Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.
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Artigo de método
Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células humanas não proliferar indefinidamente. Após a estímulos externos e / ou intrínseco, as células podem morrer ou entrar em uma parada do ciclo celular estável chamado de senescência. Vários mecanismos celulares, tais como o encurtamento dos telómeros e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos, têm sido mostrados para causar a senescência. A senescência não está restrita às células normais, as células cancerígenas têm também sido relatada a senescência.
Agentes quimioterápicos têm demonstrado induzir a senescência das células cancerosas. No entanto, permanece controverso se a senescência impede ou promove a carcinogênese. Como se pode, eventualmente, ser específico para cada paciente, um método rápido e sensível para avaliar a senescência celular no cancro logo será necessária.
Para este fim, o ensaio padrão β-galactosidase, o método utilizado correntemente, apresenta inconvenientes importantes: é demorado e não é sensível. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria de estudar senescência em live células. Este ensaio tem a vantagem de ser rápido, sensível e pode ser acoplada ao imunomarcação de vários marcadores celulares.
Introdução
Desde o início dos anos sessenta e sua descoberta por Hayflick e Moorhead, senescência ainda permanece uma curiosidade celular 1. As células humanas não indefinidamente proliferar e, por senescência, Hayflick e Moorhead cunhou o processo de envelhecimento celular. A senescência é uma paragem do ciclo celular estável em que as células permanecem metabolicamente activa em oposição à morte celular. Até à data, quatro mecanismos celulares têm sido mostrados para induzir a senescência: encurtamento dos telómeros, danos no ADN, perturbação da cromatina e a expressão anormal de oncogenes mitogénicos 2. Isto indica que não só as células normais, mas tam....
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Protocolo
1. Preparação de C12FDG, bafilomicina A1 e Cultura de Células
- Dissolve-se o pó C 12 FDG em dimetil sulfóxido (DMSO) a uma concentração final de 20 mM. Alíquota e armazenar a -20 ° C. DMSO deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas.
- Dissolve-se o pó A1 bafilomicina em DMSO para uma concentração final de 0,1 mM. Alíquota e armazenar a - 20 ° C. Bafilomicina deve ser utilizado com condições de segurança apropriadas.
- Cultivar a linha de células RPMI 8226, ou outras linhas de células aderentes ou não, em meios contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos, a 37 ° C, 5% de CO 2. Estimar o número d....
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Resultados
Mieloma múltiplo, uma malignidade hematológica, foi utilizado para avaliar a senescência induzida por um procedimento quimioterápico. Para fazê-lo numa linha de células MM comercialmente disponível (RPMI 8226) foi tratado durante 2 dias com doxorubicina, um fármaco quimioterápico. As células foram então submetidas a um tratamento bafilomicina A1 e ainda incubadas com 12 C FDG. As células foram analisadas por citometria de fluxo. Figura 1 ilustra as diferentes etapas, e mostra que a percentage.......
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Discussão
Apresentamos aqui um método baseado em citometria de fluxo para quantificar a senescência celular em células cancerosas vivas. Este método baseia-se na utilização do composto membrana permeável, a 12 C FDG, e pode, portanto, ser utilizado em qualquer tipo de célula e depois de vários tratamentos, desde que o composto é absorvido pelas células. Após a absorção celular, a 12 C FDG é hidrolisado pela β-galactosidase, enriquecido em lisossomas de células senescentes. Após excitação laser, o composto em.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Agradecemos ao SF 4206 Icore (Université de Caen) para o uso da facilidade de citometria. JC recebeu bolsas de pós-doutorado do Conseil de Radioproteção d'EDF e Conseil Régional de Basse-Normandie. Esses dados fazem parte de projetos financiados pelo Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 5-dodecanoilaminofluoresceína di-β-D-galactopiranosídeo | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimetilsulfóxido Sigma | D2650 | ||
| Bafilomicina A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorrubicina | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 meio de cultura celular | Lonza | BE12-702 | |
| Soro fetal de bezerro | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibióticos | Gibco | 5290-018 | |
| Citômetro de fluxo Gallios | Coulter | A94291 |
Referências
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biolo....
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Reimpressões e permissões
