Exame<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval células terminais traqueais por microscopia de luz

Resumo

Aqui, apresentamos um método para análise de microscopia de luz das células terminais traqueal em Drosophila Larvas. Este método permite uma análise rápida do ramo lumen e morfologia em animais inteiros e seria útil para a análise dos mutantes individuais ou ecrãs de mutações que afectam o desenvolvimento das células do terminal.

Resumo

Forma celular é crítico para a função celular. No entanto, apesar da importância da morfologia celular, pouco é conhecido sobre as células individuais como gerar formas específicas. Células terminais traqueais Drosophila tornaram-se um modelo genético poderosa para identificar e elucidar os papéis dos genes necessários para a geração de morfologias celulares. Células de terminais são um componente de uma rede tubular ramificada, o sistema traqueal que funciona de modo a fornecer oxigénio aos tecidos internos. Células de terminais são um excelente modelo para investigar questões de forma da célula que possuam duas arquitecturas celulares distintas. Primeiro, as células terminais têm uma morfologia ramificado elaborado, semelhante aos neurónios complexos, em segundo lugar, os ramos celulares terminais são formadas como tubos finos e contêm um lúmen ligada à membrana intracelular. A análise quantitativa do número de células ramo terminal, organização ramo e forma ramo individual, pode ser usado para fornecer informações sobre o papel do mecanismo genético específicomos na confecção de uma célula ramificada. Análise de formação de tubos nestas células pode revelar os mecanismos conservadas do tubulogenesis comuns a outras redes tubulares, tais como a vasculatura vertebrado. Aqui, descrevem técnicas que podem ser usadas para corrigir rapidamente, imagem e analisar os padrões de ramificação e em células de formação de tubo de terminal dentro larvas de Drosophila. Estas técnicas podem ser utilizadas para analisar as células terminais em animais de tipo selvagem e mutante, ou mosaicos genéticos. Devido à elevada eficiência deste protocolo, é também adequada para genético, baseado RNAi, ou telas da droga no sistema de Drosophila traqueal.

Introdução

Forma celular é crítico para a função das células individuais dentro de um organismo, bem como células que funcionam como parte de um tecido ou órgão. Nós usamos células terminais de Drosophila traqueais, um componente do sistema respiratório de insetos, para investigar os mecanismos moleculares que participam no controle de dois tipos conservados de morfologia celular: Desvios e formação do tubo (lumenogenesis). Células terminais estão localizadas nas pontas de uma rede de tubos ramificados que funciona para fornecer oxigénio aos tecidos internos ¹ e têm uma morfologia ramificado elaborado, que depende de uma via de sinalização do FGF, que é controlado por níveis de oxigénio dentro dos tecidos locais-alvo ^2. Ramos terminais celulares são tubos finos, com cheias de gás lúmen subcelulares que atravessam cada ramo. As arquitecturas celulares distintas de células de terminal, juntamente com a facilidade através da qual a análise genética pode ser realizada em Drosophila, tornar essas células um modelo excelente fou investigar os mecanismos de crescimento celular, a ramificação, e a formação do tubo intracelular. Células Terminal provaram um modelo útil para compreender algumas das vias de sinalização que levam à diferenciação de células ramificadas, conseqüência, e maturação ^2-4. Usando este sistema imparcial, telas para a frente genéticos para mutantes morfogênese celular foram realizados, gerando insights sobre os mecanismos que controlam a forma da célula ^5,6. Por exemplo, estas telas tenham revelado que um RabGAP específico é necessário para a polaridade do citoesqueleto e o tráfico de vesículas na formação de lúmen e de posicionamento ^7, que a adesão mediada pela integrina é necessária para a estabilidade do ramo ^8, e que as proteínas de PAR-polaridade epiteliais regular tráfico membrana polarizado necessário tanto para a ramificação e formação de lúmen ^9. Outros estudos em células de terminais têm mostrado que a acumulação de actina assimétrica e organização de microtúbulos é necessária para o alongamento das células e lumenogenesis 10. Assim, diversos mecanismos biológicos, células conservadas contribuir para a morfogénese do terminal da célula.

Aqui, descrevemos um método para corrigir rapidamente as larvas Drosophila terceiro instar intacto para análise de células ramificação terminal e formação de lúmen. Este protocolo pode também ser efectuada em ambos os primeiro e segundo instar animais. A chave para esta técnica é a capacidade de visualizar as células terminais que estão geneticamente marcadas através da expressão da proteína fluorescente directamente através da cutícula larval de animais intactos. Uma vez que este procedimento não requer quaisquer manipulações pós-fixação, tais como a coloração do anticorpo, para observar as células, que é bem adequado à análise de alto rendimento, incluindo o rastreio genético ou fármaco. A expressão da proteína fluorescente que revela a estrutura dos ramos cheias de citoplasma. Formação do tubo pode ser controlado em paralelo utilizando microscopia de campo claro para identificar o lúmen cheio de gás, o que contrasta com o ambiente fluido enchatecidos ed.

Incluído neste protocolo é o método para a geração de mosaicos genéticos baseados no sistema MARCM ^11, para produzir as células terminais mutantes homozigotos marcadas com proteínas fluorescentes em animais unlabeled contrário. Isto é necessário, uma vez que as células terminais só elaborar suas estruturas complexas relativamente tarde no desenvolvimento; mosaicos genéticos permitem a derivação de requisitos de genes em outros tecidos anteriores em desenvolvimento. . Gerar clones MARCM, traquéia são rotulados usando o driver específico-traqueal sem fôlego (BTL) ¹² aqui descrito é o protocolo para o cromossomo X Drosophila, por outros cromossomos, um procedimento semelhante pode ser usado, com reagentes genético apropriado para o cromossoma ser examinados. Aqui, a traqueia são rotulados por expressão de uma GFP citoplasmaticamente localizada, mas o procedimento funciona igualmente bem com a expressão de outras proteínas fluorescentes, tais como DsRed.

Além disso, nós incluímos um método para quantificar os padrões de ramificação e formação de lúmen em células de terminais, com base em métodos desenvolvidos para a caracterização de padrões de ramificação neuronal ^13. Este tipo de dados quantitativos pode ser crítico para discernir o papel exacto de genes no processo de ramificação ou lumenogenesis, bem como permitindo comparações directas entre diferentes mutantes ^9.

Protocolo

1. Geração de Mosaico

1. Cruzamento genético
   w FRT ^19A banheira: GAL80 FLP ¹²² / Y; Btl-GAL4, UAS-GFP (do sexo masculino) X * FRT ^19A / Bal (fêmeas), onde * representa o mutante para ser examinado. Nota: Configurar atravessar pelo menos um dia antes da experiência, pois isso permite que os animais se acasalar adequadamente.
2. Pré-lay: Cruz transferência para frascos voar alimentares com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco colocado na mídia. Permitir fixar durante 1 hora a 25 ° C.
3. Lay: animais de Transferência de pré-configuração frasco para um novo frasco com uma pequena mancha de pasta de fermento fresco. Permitir a deitar por 6 h a 25 ° C.
4. Adultos de transferência de volta ao frasco pré-configuração para armazenamento e uso em experimentos posteriores. Imediatamente choque de calor do frasco contendo leigo 0-6 hr embriões velhos durante 45 min a 38 ° C, num banho de água circulante. Nota: A superfície do alimento deve estar abaixo do nível de água para verificar todosembriões são adequadamente aquecer chocado.
5. Incubar calor frascos chocou a 25 ° C por 4-5 dias até larvas de terceiro instar começar a vagar.

2. Tela para Mosaico Animais

1. Usando fórceps finos escolher cuidadosamente errante larvas de terceiro instar a partir dos lados do frasco e colocá-los em refrigeradas glicerol 100% numa pequena placa de plástico.
2. Examinar larvas usando um microscópio de alta ampliação de dissecação equipado com óptica fluorescentes. Identificar larvas com expressão mosaico de células de traquéia fluorescente etiquetado. Tipicamente, isto pode ser feito em 10-20X de ampliação.

3. Fixação de calor

1. Utilizando uma pinça fina escolher cuidadosamente os animais mosaico fora do prato e coloque em uma gota de fresco 100% de glicerol em um mm branco vidro lâmina de microscópio 75x25x1. Nota: vários animais podem ser colocados na gota (Figura 1A).
   Os animais também podem ser colocados numa gota de glicerol sobre uma lamela directamente,mas cuidado deve ser tomado durante a fixação (passo 3.2), já que os animais vão aquecer muito rapidamente e pode tornar-se mais fixo.
2. Lugar lâmina de vidro para 70 ° C em bloco de calor até que os animais só parar de se mover, não mais do que 20 segundos para um slide, e 10 seg para uma lamela (Figura 1B). Animais vão torcer inicialmente, mas parar e tornar-se rígida e alongada, uma vez morto. Nota: A exposição prolongada ao calor pode danificar ramos terminais e lúmens, bem como fazer o sinal GFP fraca e difusa. Para a máxima eficiência recomenda-se que o bloco de calor no mesmo quarto que os microscópios.
3. Usando fórceps finos orientar cuidadosamente todas as larvas na gota num único sentido, de tal modo que todas as larvas do slide são orientados paralelamente uns aos outros (Figura 1C).
4. Suavemente colocar uma tampa de vidro de micro 18x18mm no topo das larvas (ou a lamela invertido sobre uma lâmina de vidro) e evitar a formação de bolhas (Figura 1D). Nota: lamela pode não estar exatamenteplana sobre larvas, isto não é um problema.
5. Larvas de Imagem dentro de 30 min. Células terminais fixas de calor irá degradar o sinal de GFP e irá tornar-se muito difusa.

4. Imagem in vivo de células terminais traqueais

1. Coloque deslize no palco de um microscópio estereoscópico composto. Usando um objetivo 5X localizar os dois troncos dorsal paralelas que correm de anterior para posterior na superfície dorsal do animal (Figura 1F). Localize as duas células terminais dorsal, diretamente entre os dois troncos dorsal. Isso ajuda a identificar o segmento apropriado para análise.
2. Uma vez orientada, rodar os animais para as células da imagem de terminais desejados. Para fazer isso, empurrar cuidadosamente a lamela na extremidade com a pinça perpendicular ao eixo longo das larvas, rolando lentamente as larvas sob a lamela (Figuras 1E e 1G).
3. Selecionando as células terminais apropriados é fundamental para resultados consistentese as comparações entre os mutantes. Células terminais do ramo de gordura corporal (FB) são facilmente encontrados junto ao tronco dorsal, lateral à linha média. As células do Grupo G terminais laterais (LG) são facilmente encontradas e estão localizadas imediatamente lateral da linha média ventral (Figura 1H). Nota: nos (TR10) segmentos mais anteriores (Tr1) e posterior o arranjo de célula terminal é divergente de outros segmentos. Nós só analisar as células terminais em segmentos Tr2-TR9. Células terminais dorsais têm um padrão de ramificação mais estereotipados do que outras células do terminal da traquéia. Isto pode depender de sinais autónomas adicionais, não-celulares, e isso deve ser considerado quando se decide se a incluí-los na análise.
4. Uma vez que uma célula de terminal de interesse tiver sido identificado, a captura de uma imagem utilizando a ampliação desejada; tipicamente 10X ou 20X é melhor (Figura 2A). Nota: devido a padrões de ramificação variáveis, tentar capturar imagens que incluem como muitos ramos e dicas ramo como possível.
5. Sem mover o palco, desligue a fluorescência e acender a luz transmitida para capturar uma imagem de campo claro da mesma célula e plano focal (Figura 2B). O lúmen será visualizado como escura contrastante dentro do espaço celular terminal. Se planejando quantificar ramos terminais celulares e lúmens, recolher várias imagens em múltiplos planos focais de cada célula terminal.

5. Análise e Quantificação da morfologia celular Terminal Usando ImageJ

1. Abra as imagens fluorescentes e brightfield usando o ImageJ ( http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) plug-in NeuronJ ( http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/ ).
2. Usando o "Add traçados" ferramenta, traçar manualmente os ramos e lúmen da célula do terminal inteiro.
3. Usando a ferramenta "Etiqueta traçados", renomear e reColor atribuir a cada linha dentro do trace uma designação específica.
4. Usando a ferramenta "Definir parâmetros", ajustar a largura da linha 6-10 pixels (512x512 para imagens obtidas a partir da câmera digital conectada ao microscópio composto. Para câmaras maior ou menor resolução, a largura de pixel deve ser dimensionado de forma adequada), utilizando todos outras configurações padrão e clique em "OK". Em seguida, use a ferramenta "Faça snapshot" para tirar uma foto. Escolha "Draw trace" para obter um instantâneo do traço que pode ser mostrado, lado a lado com o original.
5. Selecione a ferramenta "Measure traçados" e selecione o tipo de rastreamento (ou seja, que se ramifica para medir com base nas designações específicas atribuídas no passo 5.3). Em seguida, selecione "Mostrar medições de rastreamento" e "Limpar medições anteriores" e clique em "Executar". Isto produzirá uma folha de cálculo que contém o nome, a etiqueta, o comprimento (em pixels), e outros dados para a imagem. Estes dados podem ser salvos como uma planilha do Microsoft Excel para posterior estatísticaanálise.

Resultados

Os resultados são mostrados na Figura 2. Um grupo lateral, único (LG) célula do terminal mostra extensa ramificação subcelular (visualizado por GFP; A) e um cheios de gás lúmen subcelulares que atravessa cada um dos ramos (visualizadas por microscopia de campo claro, B). Estas imagens foram coletadas a partir de um mosaico L3 larva, gerado através do sistema MARCM descritos nas seções 1 e 2, eo calor fixa e fotografada, conforme descrito nas seções 3 e 4. Painéis C e D mostram um traço NeuronJ gerado, c...

Discussão

A técnica de fixação calor aqui descrito é uma ferramenta rápida e conveniente para as células terminais traqueais imagem Drosophila larvas. Aqui, podemos utilizar esta técnica para examinar o padrão de ramificação e do lúmen de células do tipo selvagem. Células de traquéia expressando GFP, impulsionada pelo promotor específico traqueal fôlego, pode ser facilmente visualizado através da cutícula larval após a fixação de calor. Os padrões de ramificação específicos de células individuais do terminal, be...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aluno Dumont #5 fórceps	Fine Scientific Tools	91150-20
Leica MZ16 Microscópio de dissecação (ou equivalente)	Leica	MZ16
AxioImager M1 microscópio composto (ou equivalente)	Carl Zeiss		Equipado com AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Conjunto de Filtros 38HE
100% Glicerol	BioExpress	M152-4L
Genótipo do estoque			: cuba de w FRT19A: GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP e FRT19A
Genótipo			: e FRT19A

da mosca