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Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta

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DOI:

10.3791/50513

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4 de julho de 2013

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1Department of Complexity Science and Engineering, Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo, 2Department of Physics, Graduate School of Science, The University of Tokyo

Neste artigo

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo para manipulação optogenetic de atividade motoneurônio enquanto monitora mudanças na saída do motor (contração muscular) em semi-intactas Drosophila Larvas usando laser dentro de um microscópio confocal convencional. Esta técnica permite aos investigadores perturbação atingir locais de actividade neural em poucos neuromeres para elucidar a dinâmica do circuito do motor.

Resumo

Drosophila larval locomoção é um sistema modelo excelente no desenvolvimento fisiológico e neuroscience, em virtude da acessibilidade genética dos componentes neuronais subjacentes existentes nos circuitos 1-6. Aplicação de optogenetics 7,8 no circuito neural larval nos permite manipular a atividade neuronal de uma forma espacialmente e temporalmente estampados 9-13. Tipicamente, as amostras são largamente iluminada com uma lâmpada de mercúrio ou de LED, de modo a especificidade dos neurónios-alvo é controlado por sistemas de expressão de genes binários como o sistema Gal4 UAS-14,15. Neste trabalho, para melhorar a resolução espacial de "resolução sub-genético", que localmente iluminado um subconjunto de neurónios no cordão nervoso ventral utilizando lasers implementadas em um microscópio confocal convencional. Ao monitorizar o movimento da parede do corpo do semi-larva intactos, nós interactivamente activado ou inibido actividade neural com o 16,17 channelrodopsinar halorodopsina 18-20, respectivamente. Por espacialmente e temporalmente restrita iluminação do tecido neural, pode-se manipular a actividade dos neurónios específicos no circuito a uma fase específica do comportamento. Este método é útil para estudar a relação entre as actividades de um conjunto neural local no cordão nervoso ventral e o padrão de espaço-temporal de saída do motor.

Introdução

Locomoção para a frente peristáltica em larvas de Drosophila ocorre pela propagação da contração muscular do posterior aos segmentos anteriores. Este movimento é realizado pela ativação seqüencial dos neurônios motores dentro do cordão nervoso ventral ao longo do eixo longitudinal do corpo. Para examinar o circuito por trás dessa atividade de propagação modelada, perturbação locais da atividade neural poderia ser uma abordagem informativa. Embora o ensaio farmacológico pode controlar substância específica, tais como neurotransmissores, no tecido neural, os efeitos farmacológicos das drogas podem ser semelhantes entre quase todos os segmentos porque o cordão nervoso ventral larval é a estrutura repetitiva composto neuromeres semelhantes ao longo do eixo longitudinal. Alternativamente, pode-se expressar optogenetic ou moléculas de sonda, sensíveis à temperatura, em um pequeno número de segmentos. No entanto, essas linhas Gal4 específicas são muito difíceis de produzir. Aqui é apresentado um método para manipulação de neurónios em alguns segmentos que utilizam iluminação a laser. Aproveitando-se da iluminação espacialmente confinado em microscopia confocal, pode perturbar a atividade dos neurônios em uma área local. Combinado com o padrão de expressão da sonda por subconjuntos de gal4 linhas específicas de neurônios, este método de iluminação a laser melhora muito a resolução espacial para a perturbação. E porque este método requer apenas um microscópio confocal convencional, a compra de equipamentos de laboratório adicional normalmente não é necessário.

Utilizando esta técnica, que examinaram o papel da actividade neuronal motora durante a propagação de saída do motor 13. Ao bloquear as actividades dos neurónios motores em poucos segmentos durante o movimento peristáltico, fomos capazes de testar se a actividade dos próprios neurónios motores é necessária para a propagação do sinal de saída do motor. Bloqueio local e transitória dos neurônios motores detido a propagação do movimento peristáltico. Após o bloqueio foi removida, própagation apareceu no segmento em que a onda tinha sido preso. Este fenômeno sugere que sem a ativação neuronal motora, a onda propagativo não pode progredir ao longo do cordão nervoso ventral mais longe, e, portanto, é necessário para o movimento peristáltico a ativação de neurônios motores. Nós relatamos anteriormente dados detalhados e discussões sobre este fenômeno em Inada et al. (2011) 13. Aqui, nós descrevemos o método para perturbar a actividade neural interactivamente durante a monitorização do movimento das larvas dissecados. Usando vários gal4 linhas e uma série de padrões espaço-temporais para a manipulação atividade, pode-se investigar a lógica de circuitos através das propriedades do circuito do motor de resposta de perturbação.

Protocolo

1. Preparação larvas

  1. Manter a voar linhas de OK6-Gal4, UAS-ChR2 ou OK6-Gal4, UAS-NpHR2 em frascos plásticos contendo alimentos fly padrão.
  2. Espalhe levedura colar contendo all-trans retinal (ATR) em concentrações adequadas (1 mM para ChR2, 10 mM para NpHR2 ("PNDH" para o short) em uma placa de ágar suco de maçã.
  3. Pegue 2 º ou 3 º instar as larvas dos frascos e colocá-los na placa ATR-contendo.
  4. Criá-los a 25 ° C no escuro durante um período de tempo apropriado (1 dia para CHR2, 2 dias para PNDH.)

2. Setup microscópio

  1. Anexar uma câmera CCD (XCD-V60, Sony) a um microscópio confocal convencional (no nosso caso, FV1000, Olympus) com um anexo C-mount (ampliação 0,35 x).
  2. Se houver um obturador ao longo do caminho da luz da lente objectiva para a câmara CCD, que fecha durante a laser scanning, remover cuidadosamente. Como este passo depende do microslidar configuração, contate o fabricante do microscópio para o suporte técnico, se necessário.

3. Dissecação

  1. Lavar as larvas ATR-alimentados com água para remover o alimento residual a partir do corpo.
  2. Coloque a larva em um prato Sylgard revestido, com o lado dorsal para cima (o lado dorsal tem dois tubos traqueais rodando longitudinalmente, um de cada lado da linha média dorsal). A espessura da Sylgard é de cerca de 5 mm.
  3. Insira um pino de inseto (Austerlitz pinos de insetos, Φ0.10mm, inoxidável) na cauda entre os tubos traqueais com uma pinça (# 5 Inox, FST por Dumont, Suíça). Os pinos, cerca de 10 mm de comprimento, deve ser dobrada ou cortada para ser suficientemente curto (~ 2 milímetros de comprimento) para evitar bater e danificar a superfície da lente objetiva. Em seguida, coloque o segundo pino de inseto na cabeça da larva perto do gancho boca, preto estrutura garra-como no final anterior.
  4. Adicionar Ca2 + livre salina normal (NaCl 140 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 6 mM, HEPES-NaOH a 5 mM,Sacarose 36 mM (pH 7,1)) para manter a larva úmida.
  5. Adicione uma pequena incisão próximo da cauda com micro-tesouras (MB-50-7 Napox, Japão).
  6. A partir da incisão, faça um corte longitudinal ao longo da linha média dorsal em direção à cabeça. Tenha cuidado para não danificar o cordão nervoso ventral (VNC) e axônios.
  7. Fazer uma pequena incisão na cabeça lateralmente.
  8. Coloque 4 pinos em cada canto do bodywall dissecados. A parede do corpo deve ser esticado o suficiente para visualizar um padrão segmentar da parede do corpo, mas não muito para dificultar o movimento peristáltico.
  9. Remover os órgãos internos, excepto para o cérebro e o VNC e enxaguar a amostra com a solução salina normal de Ca2 + livre.
  10. Ajustar a orientação do cordão nervoso ventral ser bilateralmente simétrico, alterando a posição e orientação dos pinos de insectos na parede do corpo. Para fixar a posição do cordão nervoso ventral, inserir um pino através do tecido entre o cérebro e a boca para baixo para ligar o Sylgard.
  11. Substitua o tampão com 2 mM Ca 2 + solução de Ringer (NaCl 130 mM, KCl 5 mM, MgCl2 2 mM, CaCl2 2 mM, HEPES-NaOH 5 mM, sacarose 36 mM (pH 7,3)).

4. Imagem com iluminação a laser

  1. Anexar uma lente objetiva seca 4x (UPlanSApo 4x, NA 0,16, Olympus, Japão) no microscópio confocal e definir a preparação larva no palco.
  2. Obter uma imagem de transmissão da preparação dissecados com um laser vermelho (633 nm) para localizar o cordão nervoso ventral por microscópio confocal. Para esta verificação, não se esqueça de usar um laser de 488nm ou 559nm, que induz a estimulação indesejada de ChR2 ou PNDH, respectivamente.
  3. Definir a região de interesse (ROI) da imagem de transmissão no. Modo zumbidas poderia ser útil para a determinação pormenorizada da ROI.
  4. Alterar o conjunto de filtro do microscópio para iluminar com a luz 488nm ou 559nm.
  5. Iluminar a preparação com uma lâmpada de halogénio de visualizar a parede do corpo. The a preparação pode ser monitorada com uma câmara CCD ligada a um microscópio confocal.
  6. Registe o movimento da parede do corpo e ligar o feixe de laser ligado e desligado durante a monitorização do movimento.

Resultados

Ativação local e transitória dos neurônios motores com ChR2.

Expressamos ChR2 em neurônios motores. Os axônios dos neurônios motores saem de cada projeto segmento VNC a um segmento correspondente da parede do corpo. Quando estimulado um ou dois segmentos do VNC com um laser azul, músculos, nos segmentos correspondentes exibiu contracções (Figura 1).

Inibição local e transitória dos neurônios motores com PNDH.

Expressamos PNDH nos neurônios motores. Quando estimulado algumas (1 ~ 2) segmentos do VNC com um laser vermelho, durante as contracções musculares peristálticas, a onda de propagação foi preso aos correspondentes segmentos de parede do corpo (Figura 2). Em seguida, a onda reiniciado a partir dos segmentos presos quando desligada a iluminação a laser 13.

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Figura 1. Ativação local dos neurônios motores com ChR2. A. Esquema da ativação local de preparação de filetes. Pela iluminação azul-luz de algumas segmentos do cordão nervoso ventral expressando ChR2 em neurônios motores, os músculos dos segmentos correspondentes são contratados (cabeça de seta). B. imagens transmissão de um larva dissecados. Iluminação local do cordão nervoso ventral (seta cabeças) induz contração segmentar dos músculos da parede do corpo (setas).

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Figura 2. Inibição local dos neurônios motores com PNDH. A. Esquema da inibição local de preparação em filetes. Pelo amarelo-liluminação ight de alguns segmentos do cordão nervoso ventral expressando PNDH em neurônios motores, os músculos de contração durante espontaneamente, ocorreu movimento peristáltico (cabeça de seta na parte superior) estão relaxados (cabeça de seta na parte inferior). B. imagens transmissão de uma larva dissecado . Iluminação local do cordão nervoso ventral (cabeças de seta) relaxou os segmentos da parede do corpo espontaneamente-contratadas (setas).

Discussão

Perturbação temporal e local da atividade neural é uma técnica valiosa para analisar a dinâmica da rede de circuitos neurais. Neste protocolo, apresentamos um método para manipular a atividade neural por optogenetics usando um laser. Alta direcionalidade do laser permite estimulação optogenetic mais localizada do que a estimulação campo largo uso de mercúrio ou uma lâmpada Xenon. Embora iluminações de laser já foram aplicados para Optogenetics em estudos anteriores, configurações especiais, tais como a fibra de vidro, micromanipulador, e uma fonte de laser, são necessários na maioria dos estudos anteriores. Neste protocolo, usamos um microscópio confocal convencional para a iluminação local. Uma vez que o sistema de microscópio confocal é amplamente utilizada, este método vai abrir a possibilidade de aplicar Optogenetics de alta resolução em muitos laboratórios.

O protocolo tem dois pontos críticos: dissecção larval e potência do laser. Em primeiro lugar, se o cérebro, o cordão nervoso ventral ou um nervo motor é danificado during dissecção, as larvas apresentam menos ou nenhum movimento peristáltico espontânea. A precisão é, portanto, essencial, especialmente quando se fazer uma incisão no lado dorsal, com uma tesoura de mola e remoção de órgãos internos com uma pinça. Detalhes sobre a dissecação foram relatados anteriormente 21. Em segundo lugar, se a estimulação é suficiente para atingir, a potência do laser de cerca de 0,1 ~ 1 mW / mm 2 para ChR2 ou 1 ~ 10 mW / mm 2 para PNDH é necessária. Avaliou-se a potência do laser, como total de energia de luz abaixo de uma lente objectiva dividida por uma área estimada de iluminação. Medimos a potência total da luz usando um medidor de energia (mobiken, Sanwa MI Technos, Japão). Estimou-se a área de iluminação como constante vezes circular o quadrado do comprimento de onda do laser, o que dá mais ou menos área iluminada no limite de difração. Poder iluminação eficaz na amostra pode ser ajustada não só pela potência da saída do laser, mas também pela alteração da velocidade de digitalização e dormenteser de repetições. Nós digitalizados laser com 20-100 ms / pixel para 63 vezes. Além disso, o nível de proteína Optogenetics e a quantidade de ATR expressão também são críticos para a eficiência da estimulação. Assim, se as larvas não mostrou nenhuma resposta optogenetic, os seguintes pontos devem ser verificados e corrigidos: 1) potência do laser (por meio da otimização do sistema de microscópio), 2) nível de expressão da proteína optogenetics (marcando genótipo e temperatura criação), e 3) a quantidade de ATR (ajustando a concentração de ATR e período de alimentação). PNDH exige maior concentração de ATR que ChR2 faz por razões desconhecidas 13. ChR2 funciona bem em larvas criadas em alimentos contendo ATR menor (por exemplo, 0,1 mM) do que o descrito aqui (a 1 mM). Como a alimentação das larvas de 1 mM ATR é suficiente para fazer ChR2 foto-reativo, recomendamos esta concentração para o primeiro julgamento em ChR2 experimentos. A concentração de ATR pode subsequentemente ser titulada para baixo a partir de 1 mM. Quanto à duração da exposição por ATR, recomendamosa duração descrita aqui para robusto controle optogenetic. Nós muitas vezes não respeitou resposta optogenetic quando se alimentam de larvas de ATR por menor duração.

Neste protocolo, iluminação a laser e de aquisição de imagem são operados por um computador separado. Assim, a detecção clara do padrão espaço-temporal da iluminação laser, câmera CCD é fundamental para a análise de dados. Se o ponto de laser ou a linha é fraca imagem CCD, você deve otimizar o poder de lâmpada halógena e valor de ganho da câmera CCD para visualizar a iluminação a laser, mantendo parede do corpo visível.

Iluminação espacial e temporal mostrada neste protocolo fornece informações sobre circuitos motores larvais, no entanto, o método tem algumas limitações. Quanto ao aspecto "espacial", a localização da iluminação é registrado baixa de imagem CCD de ampliação usada para filmar os movimentos da parede do corpo por. Assim, a área de iluminação pode ser atribuído ao nível do segmento, mas não em nível celular. Como para o "temporal "aspecto, intervalo de tempo entre a ligação na analise por microscopia confocal a laser e de iluminação pelo laser depende do sistema de microscópio confocal e condição de digitalização. Consequentemente, alguns ensaios por tentativa e erro, é necessário para ajustar o tempo de iluminação. Desde que a temporização de iluminação pode ser determinado em filmes de imagem CCD, utilizando software adequado como ImageJ, o fator crítico na resolução temporal é a taxa de quadros de câmera CCD de imagem. Nós normalmente definir a taxa de quadros para 7,5-15 quadros por segundo.

Avanços em ferramentas optogenetic nos proporcionar uma oportunidade para modificar esse protocolo. Usamos 3 ª larvas possuindo OK6-Gal4 e UAS-ChR2 [H134R] ou UAS-NpHR2. Outras ferramentas optogenetic em vez de ChR2 [H134R] ou NpHR2 como ChR2 [T159C/E123T], NpHR3 ou Arch pode aumentar a eficiência do controle da atividade 22. Além disso, utilizando outros gal4 linhas ou análise em outros estágios de desenvolvimento pode fornecer mais informações sobre o circui do motorts.

Neste protocolo, actividade motora foi monitorizada por meio de imagens de transmissão da contracção bodywall com uma câmara CCD. A atividade dos neurônios motores com moléculas de fluorescência de cálcio sensíveis (por exemplo, GCaMP) também pode ser diretamente monitoradas ao manipular a atividade neural com ChR2 ou PNDH. Neste caso, a iluminação a luz azul em uma área ampla e uma câmara CCD altamente sensíveis (por exemplo, câmara EMCCD) são usados ​​em vez de uma lâmpada de halogénio e a câmara CCD normal, aqui descrito anteriormente. Para melhorar a resolução espacial de estimulação durante o monitoramento movimento bodywall, usando uma lente objetiva adicional pode ser um método mais avançado: iluminação do cordão nervoso ventral por uma lente objetiva de grande aumento (por exemplo, 40x) por cima da amostra e monitoramento bodywall por baixo da lente de ampliação (por exemplo, 4x) abaixo da amostra. Este sistema de lente dupla pode permitir-nos para estimular o sistema nervoso em maior resolução espacial.

O protocolo mostrado aqui pode ser aplicado a outros circuitos neurais, ferramentas optogenetic proporcionados podem ser expressos no sistema nervoso e preparação em que a luz suficiente podem ser entregues no tecido neural pode ser estabelecida.

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras "Mesoscópica neurocircuitry" (n º 22115002) e "Comprehensive Rede Ciência Cérebro" (No. 221S0003), do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência, e Tecnologia, Japão para AN e Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (N º 21700344) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (JSPS) para HK

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BX61WI MicroscópioOlympus CorporationBX61WI
Fluoview FV1000 sistema confocalOlympus CorporationFV1000
câmera CCDSonyXCD-V60
all-trans retinalSigmaR2500-500MG200 mM estoque em 95% EtOH
Silpot184Dow Corning Toray3255981

Referências

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