Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular: A alta taxa de transferência método quantitativo para estudo de interação proteína-proteína

Summary

Citometria de fluxo e de Complementação de fluorescência Bimolecular fornece um método quantitativo de alto rendimento para estudar a interação proteína-proteína. Esta metodologia pode ser aplicada ao mapeamento de locais de ligação de proteína e para o rastreio de factores que regulam a interacção proteína-proteína.

Abstract

Entre os métodos para estudar a interação proteína-proteína dentro das células, Complementação de fluorescência Bimolecular (BiFC) é relativamente simples e sensível. BiFC baseia-se na produção de fluorescência utilizando-se dois fragmentos não fluorescentes de uma proteína fluorescente (Vénus, uma variante de proteína fluorescente amarela, é aqui utilizada). Fragmentos de Vénus não fluorescente (VN e VC) são fundidos a duas proteínas que interagem (neste caso, AKAP-Lbc e PDE4D3), produzindo fluorescência devido à interacção VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 e a formação de uma proteína fluorescente funcional no interior das células.

BiFC fornece informações sobre a localização subcelular de complexos de proteínas e a intensidade das interacções de proteínas com base na intensidade de fluorescência. No entanto, a análise por microscopia de BiFC para quantificar a força da interacção proteína-proteína é demorado e subjectivos, devido à heterogeneidade na expressão da proteína e interacção. Acoplando citometria de fluxoA análise com a metodologia BiFC, o sinal BiFC interacção proteína-proteína fluorescente pode ser medida com precisão para uma grande quantidade de células num curto espaço de tempo. Aqui, nós demonstramos uma aplicação desta metodologia para mapear regiões PDE4D3 que são necessárias para a interação com AKAP-Lbc. Esta metodologia de elevado rendimento pode ser aplicado a factores de rastreio que regulam a interacção proteína-proteína.

Introduction

650.000 de interacções proteína-proteína são estimadas a existir no interactoma humano, desempenham papéis críticos para manter as funções normais da célula ^1,2. Além de co-imunoprecipitação (co-PI), o padrão de ouro para estudar a interacção proteína-proteína a partir de lisados ​​de células, vários ensaios de complementação fragmento de proteína (APC) foram desenvolvidos para melhorar a sensibilidade na detecção de interacção proteína-proteína no interior das células ^3. As técnicas incluem a transferência de energia por ressonância de Förster (FRET), bioluminescência Resonance Energy Transfer (BRET) e Complementação de fluorescência Bimolecula....

Protocol

1. Transfecção celular

1. Células da placa um dia antes da transfecção, chapeamento menos células de imunofluorescência.
   1. Para imunofluorescência: em uma placa de 6 poços, casaco lamínulas de vidro (um por poço), com 0,02% de gelatina a 37 ° C durante pelo menos 4 horas, lave uma vez com o meio, e para cada poço, a placa 1 x 10 ⁵ HEK 293T células em 2 ml de meio de crescimento completo [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) mais 10% de FBS].
   2. Para a citometria de fluxo e análise da mancha Ocidental: placa de 1,2 x 10 ⁵ células HEK 293T / poço em 2 ml de meio de crescimento completo na placa de 6 poços (0,3 x 10

Results

AKAP-Lbc e PDE4D3 construções (Figura 1B) foram fundidas com fragmentos de VN e VC, respectivamente. Interacção dos AKAP-Lbc e PDE4D3 funcional resulta em YFP fluorescência (Figura 1A). Aqui usamos o método BiFC para mapear locais AKAP-LBC-vinculativos PDE4D3. Upstream uma região conservada (UCR1), a região a montante conservada 2 (UCR2) e região catalítica (CAT) são conservados entre as proteínas da família da PDE4, por conseguinte, o comprimento total (FL), e UCR1 UCR2 mais CAT foram .......

Discussion

BiFC é um método simples e sensível para estudar a interacção proteína-proteína. Este método não pode ser utilizado para identificar novas interacções proteína-proteína, no entanto, é especialmente conveniente para confirmar a interacção proteína-proteína no interior das células e para estudar as propriedades funcionais, tais como a localização subcelular de complexos de proteínas, mapeamento de sítios de interacção proteína-proteína, e para o rastreio de péptidos / moléculas pequenas que podem modular a interacção prot.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dulbecco’ s modificado Eagle’ s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Penicilina-Estreptomicina (caneta/estreptococos), 100x	Invitrogen	15070-063
Soro Fetal Bovino (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anticorpo Anti-Flag	Sigma	M2, F1804
Anticorpo Anti-HA	Covance	16B12, MMS-101R
α-tubulina	Sigma	DM1A, T9026
Anti-GFP anticorpo	Clontech	632569
Placas de cultura de células, 6 poços tratados com cultura de tecidos	Thermo Fisher Scientific	130184
células HEK 293T	ATCC	CRL-11268
Kit de purificação de plasmídeo Maxiprep, alta velocidade	Qiagen	12663
Dulbecco’ s Solução salina tamponada com fosfato (DPBS), estéril 1x	Invitrogen	14190-144
Tripsina-EDTA, 0,05% (p/v)	Gibco	25300
para coloração FACS	BD Biosciences	352052
Paraformaldeído	Fisher Scientific	S74337MF
Prolong reagente antidesbotamento de ouro com DAPI	Invitrogen	P-36931
Lâminas de microscópio Superfrost plus	Fisher Scientific	12-550-15
Vidro de cobertura premium Fisherfinest	Fisher Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 incubadora com camisa de ar	NuAIR DH autoflow
Microscópio confocal LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Unidade de eletroforese e transferência	Biorad
Cyan ADP Citômetro de fluxo	Beckman Coulter