Aqui, descrevemos um método robusto para o fraccionamento das membranas plasmáticas de plantas solúveis em membranas resistentes a detergente e do detergente baseado numa mistura de não marcado e in vivo totalmente 15 n marcadas culturas de células de Arabidopsis thaliana. O procedimento é aplicado para estudos de proteômica comparativas para compreender os processos de sinalização.
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Artigo de método
Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de
Neste artigo
Resumo
Resumo
Microdomínios de membrana de plasma são características baseadas nas propriedades físicas do ambiente de lípido e de esteróis e tem funções particulares em processos de sinalização. Extraindo microdomínios de membrana enriquecidos com esteróis a partir de células de plantas para análise proteômica é uma tarefa difícil, devido principalmente a várias etapas de preparação e fontes de contaminação de outros compartimentos celulares. A membrana plasmática consiste apenas cerca de 5-20% de todas as membranas de uma célula de planta, e, por conseguinte, o isolamento da fracção de membrana de plasma altamente purificado é um desafio. Um método frequentemente utilizado envolve a partição aquosa em duas fases em polietileno-glicol e dextrano, que produz vesículas da membrana de plasma com um grau de pureza de 95% 1. Microdomínios membrana rica em esteróis na membrana plasmática são insolúveis mediante tratamento com detergentes não iónicos a frio a um pH alcalino. Esta fracção membranar resistente a detergente podem ser separados a partir da membrana do plasma por ultracentrifugação, em grandes quantidades, comogradiente ucrose 2. Subsequentemente, as proteínas podem ser extraídas a partir da banda de baixa densidade do gradiente de sacarose por precipitação de metanol / clorofórmio. Proteína extraída irá então ser digerido com tripsina, dessalinizada e finalmente analisadas por LC-MS/MS. Nosso protocolo de extração de microdomínios ricos em esteróis é otimizado para a preparação de frações de membrana detergente limpa-resistente de culturas de células de Arabidopsis thaliana.
Usamos a marcação metabólica completa de Arabidopsis thaliana as culturas de células em suspensão com K 15 NO 3 como a única fonte de nitrogénio para os estudos de proteómica comparativa quantitativa após o tratamento biológico de interesse 3. Ao misturar proporções iguais de culturas de células marcadas e não marcadas para extração de proteínas conjunta a influência de etapas de preparação no resultado quantitativo final é mantido a um mínimo. Além disso a perda de material durante a extracção vai afectar o controlo e as amostras de tratamento da mesma forma, umad por conseguinte, a proporção de luz e péptido alçada irá permanecer constante. No método proposto quer marcado ou não marcado de cultura de células é submetido a um tratamento biológico, enquanto a outra serve de controlo 4.
Introdução
Em 1972, Jonathan Singer e Garth Nicolson propôs o modelo de mosaico fluido um modelo de estrutura das membranas celulares, substituindo o modelo sanduíche proteína-lipídio-proteína que foi geralmente aceite no início de 1960. Singer e Nicolson postulado que a membrana biológica pode ser considerada como um líquido bidimensional em que todas as moléculas de lípidos e de proteínas difundem-se livremente e facilmente 5. Desde essa altura, o modelo de estrutura da membrana do plasma e do conhecimento da composição de membrana tornaram-se ainda mais complexo. Particularmente, dentro da membrana do plasma, tais como estruturas de complexos de proteínas e de líp....
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Protocolo
PROCEDIMENTO
Reagentes e tampões comuns utilizados no protocolo de extracção:
- Médio JPL para Arabidopsis thaliana culturas de células em suspensão
- 3 uM H 3 BO 3
- 3 uM MnSO4 x H2O
- 1,1 iM ZnSO4 x 7 H2O
- 0,15 mM KJ
- 0,03 uM de Na 2 MoO 4 x 2 H2O
- 3 nM de CoCl 2 x 6 H 2 O
- 3 nM de CuSO4 x 5 H2O
- 0,9 mM de CaCl2 x 2 H2O
- 0,5 mM de MgSO4 x 7 H2O
- 0,5 uM....
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Resultados
Com o protocolo apresentado por meio de culturas de células marcadas metabolicamente Arabidopsis é possível isolar as membranas de plasma a partir de tecidos de plantas (passo 2, as Figuras 2 e 4), e enriquecer por fracções de membrana resistente a detergente no interior da membrana plasmática (passo 3, as Figuras 3 e 5). Subsequentemente, o protocolo permite a extracção de proteínas a partir destas fracções de membrana resistente a detergentes (passo 4) e de digestão da proteí.......
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Discussão
O protocolo apresentado neste artigo contém muitas etapas e todos eles são cruciais para a obtenção de fracionamento pura e representante da membrana plasmática da planta em membranas resistentes detergente e frações solúveis detergentes. Portanto, é importante seguir cada passo as instruções.
O tratamento da fracção da membrana de plasma com um detergente não-iónico (passo 3.2) tem a maior influência sobre a qualidade da membrana microdomínio fraccionamento. Para obter resultados reprodutív.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
O autor, Witold Szymanski, é um funcionário do Instituto Max Planck de Biologia Molecular Plant Physiology. O autor, Waltraud Schulze é um funcionário da Universidade de Hohenheim, na Alemanha.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| REAGENTES | |||
| Produtos químicos foram encomendados da Sigma-Aldrich, salvo indicação em contrário | |||
| Amônia (solução de estoque a 25%) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μ m | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polietilenoglicol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Tripsina | Promega | V5113 | |
| Coquetel inibidor de protease (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrífuga | Beckman | ||
| Leitor de placas | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-cromatógrafo líquido | Thermo Scientific | ||
| Espectrômetro de massa LTQ-Orbitrap | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
Referências
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K.
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Reimpressões e permissões
