Medindo o Crescimento e Expressão Gênica Dynamics do Tumor-Targeted S. Typhimurium Bactérias

Resumo

O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de atenuado S. typhimurium Colônias de bactérias que crescem dentro dos tumores. Este vídeo aborda a preparação de células tumorais e implantação, preparação e injeção de bactérias, a imagem inteira animal-luminescência, a excisão do tumor, e contagem de colônias de bactérias.

Resumo

O objetivo desses experimentos é gerar dados de curso de tempo quantitativos sobre o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de S. atenuada colônias bacterianas typhimurium crescimento dentro dos tumores.

Geramos um modelo de xenoenxerto de tumores em ratos, por injecção subcutânea de uma linha de células de cancro do ovário humano, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

Nós transformado cepas atenuadas de S. bactérias typhimurium (ELH430: SL1344 ^phoPQ-1) com a luciferase expresso constitutivamente (luxCDABE) plasmídeo para visualização ^2. Estas estirpes colonizar especificamente tumores, permanecendo essencialmente não virulento para o rato ^1.

Uma vez que os tumores eram mensuráveis ​​estabelecido, as bactérias foram injectados por via intravenosa através da veia da cauda, ​​com diferentes doses. Tumor-localizada, a expressão do gene bacteriano foi monitorizado em tempo real, ao longo de 60 horas utilizando umsistema de imagem in vivo (IVIS). Em cada ponto de tempo, os tumores foram excisados, homogeneizados e plaqueados para quantificar colónias bacterianas para a correlação com dados de expressão de genes.

Juntos, estes dados produz uma medida quantitativa do crescimento in vivo de expressão do gene e da dinâmica do crescimento de bactérias no interior de tumores.

Introdução

A biologia sintética progrediu rapidamente na última década e agora está posicionada para influenciar importantes problemas de energia e saúde. No entanto, a expansão na arena clínica tem sido retardado por questões de segurança e ausência de desenvolvimento de critérios de projeto para em circuitos genéticos in vivo. Acelerar aplicações médicas de alto impacto vai exigir a utilização de métodos que interagem diretamente com a infra-estrutura médica, circuitos genéticos que funcionam fora do ambiente de laboratório controlado, e hospedeiros microbianos seguras e clinicamente aceito.

Um certo número de estirpes têm sido investigados para a terapia do cancro devido à sua capacidade para crescer preferencialmente em tumores. Estes incluíram C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, e S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium tem gerado interesse particular como eles exibiram segurança e tolerância em um certo número de ensaios clínicos em humanos ^9-12. Estes bactericida um foram inicialmente mostrado para criar efeitos anti-tumorais através da estimulação do sistema imunitário do hospedeiro e pela depleção de nutrientes necessários para o metabolismo de células do cancro. Produção de carga terapêutica foi adicionado mais tarde através de modificações genéticas. Embora estes estudos representam avanços importantes no uso de bactérias para as terapias do tumor, a maioria dos esforços actuais têm confiado na expressão de alto nível, que normalmente resulta na entrega de doses elevadas, os efeitos fora do alvo, e do desenvolvimento de resistência do hospedeiro ^13-16 .

Agora, a biologia sintética pode adicionar a produção de carga programável, utilizando circuitos genéticos computacionalmente desenhados que podem executar detecção avançadas e entrega ^17-20. Estes circuitos podem ser concebidas para funcionar como sistemas de entrega que detectam estímulos específicos de tumores e auto-regulam a produção de cargas, conforme necessário. No entanto, o estudo da função destes circuitos in vivo tem sido até agora difícil.

ve_content "> Desde plasmídeos são o quadro comum para circuitos sintéticos, nós descrevemos um método para caracterizar a dinâmica da expressão gênica baseada em plasmídeo in vivo utilizando um modelo de mouse. Estes métodos utilizam imagens luminescência time-lapse e medição quantitativa de biodistribuição. Juntos, essas abordagens fornecem uma estrutura para o estudo de redes baseadas em plasmídeo in vivo para aplicações clínicas.

Protocolo

1. Preparação celular

1. Linhagens de células utilizando técnicas de cultura de células padrão. Neste experimento, foi utilizado OVCAR-8 células (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Crescer as células-alvo a uma confluência de 80-100%.
2. Incubar as células em 5 ml de tripsina durante 5 min, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio RPMI + FBS para inactivar a tripsina.
3. Células colheita e contar com um hemocitômetro. Ressuspender em DMEM livre de fenol vermelho em uma concentração alvo de aproximadamente 5 x 10 ⁷ células / ml, ou cerca de 200 mL por frasco.
4. Adicionar 15% de redução do fator de crescimento Matrigel (BD Biosciences) e manter a suspensão de células em gelo até a implantação.

2. Implantação do Tumor

1. Anestesiar quatro semanas femininos Ncr / Nu ratos velhos que usam 3% isoflurano e esperar cerca de 5 min para garantir a anestesia profunda. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
2. Carregar as células (100 ul por tumor) numa seringa de 1 ml e anexar uma 27 1/ 2 agulha de calibre.
3. Para cada um dos dois locais de injecção flanco traseiras bilaterais, levantar a pele suavemente com uma pinça para fazer uma tenda e injectar células na base. Tome cuidado para não penetrar muito profundamente, produzindo sangue. Use uma pinça para remover suavemente a seringa sem respingos.
4. Controlar o crescimento do tumor por dia, durante 10 - 20 dias até um diâmetro de tumor de 2-4 mm, é alcançado.

3. Bactérias Preparação

1. Iniciar uma cultura durante a noite de bactérias em 3 ml de LB + ampicilina mídia a partir de um estoque C -80 congelador ou placa refrigerada. Neste experimento, utilizou-se S. typhimurium estirpe ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
2. Na manhã seguinte, dilui-se a cultura de 1:100 em LB filtrou-se e crescer a DO600 0,4-0,6.
3. Girar e lavar 3 vezes em tampão fosfato salino (PBS) e ressuspender em definitivo uma DO600 de 0,1 (cerca de 1 x 10 ⁷ células / ml).

4. Bactérias Injection

1. Anestesiar o animal umd posição de lado, com a cauda apontada para sua mão dominante. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia.
2. Dilatar a veia da cauda com água morna ou uma lâmpada de calor.
3. Carregar as bactérias (100 ul por rato) numa seringa de 1 ml e dobrar a ponta apenas menos do que 90 graus.
4. Alinhar a ponta da seringa com a veia da cauda, ​​penetrar a uma profundidade rasa (deve sentir nenhuma resistência), e injectar bactérias. Observe o deslocamento bloodflow para uma injeção de sucesso.

5. Rato de imagem

1. Anestesiar animais na câmara de indução seguida, coloque cada mouse sobre a plataforma de imagem. Use pomada veterinário sobre os olhos para evitar a secura sob anestesia. Manter o posicionamento preciso para assegurar resultados quantitativos entre os pontos temporais.
2. Animais de imagem usando o sistema de imagem IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Se uma imagem mais do que um lugar de animais, barreiras de luz entre eles para evitar cross-illuminação. Os animais devem ser fotografada em primeiro lugar no lado ventral para confirmar a localização de bactérias.
3. Imagem de animais dorsalmente usando IVIS a cada 2 horas, para a duração da experiência (36 horas). Gerar um campo de tempo para um dado ROI.

6. Quantificar Biodistribution bacteriana

1. Eutanásia animais usando CO ₂ e colocar na parte de trás em uma fralda absorvente.
2. Ligue o animal para expor os dois flancos traseiros tumores subcutâneos. Cortar o tecido da pele circundante, para separar e remover os tumores. Segurando o tumor com uma pinça, retire a pele com um movimento tesoura invertida. Quando a maior parte da pele foi separada, a remover completamente o tumor, usando uma pinça.
3. Coloque os órgãos em microtubos pré-pesados. Uma vez que a massa destes tubos pode variar significativamente, é importante pré-pesar de resultados quantitativos.

7. Quantificar Biodistribution bacteriana

1. Para cada ponto de tempo, consumo e pesar os tumores.
2. Adicionar 500 ul de PBS + 15% de glicerol e homogeneizar utilizando um Tissue-Tearor (BioSpec). Lavar as homogeneizador 3 vezes com etanol entre amostras.
3. Gerar diluições em série e placa para contagem de colônias de bactérias. Para prato várias diluições em uma única placa, utilizar placas pré-seccionados.

Resultados

Usando este protocolo, somos capazes de gerar dados sobre o crescimento in vivo e da dinâmica de expressão de genes de bactérias específicas do tumor. O fluxo de trabalho global está resumida na figura 1.

Na primeira etapa, nós injetar bactérias (verde) ea imagem do animal usando IVIS para medir a expressão do gene com luminescência (azul) como repórter.

Em seguida, na segunda etapa, de consumo, homogeneizar e tumores placa para contagen...

Discussão

Usando este procedimento, somos capazes de gerar campos de tempo para o crescimento ea dinâmica de expressão de genes de bactérias que colonizam tumores. Embora estas medições são rotineiramente realizados in vitro em cultura descontínua ou dispositivos microfluidics, eles são muito mais difíceis de executar in vivo.

Há diversas modificações que podem ser aplicadas a estes métodos. Quando foi utilizado o OVCAR-8 de linha de células para gerar os modelos de rato, um número d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 ml	BD Biosciences	309602
Seringa de insulina de 3/10 cc	BD Biosciences	309301
Agulha PrecisionGlide	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), líquido, com L-glutamina	Invitrogen	11875-119
Ampicilina	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Caldo	Sigma Aldrich	L2897
Caldo Luria-Bertani	BD Biosciences	244610