Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Summary

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Abstract

Caracterização quantitativa das interações proteína é essencial em praticamente qualquer campo das ciências da vida, particularmente a descoberta da droga. A maioria dos métodos actualmente disponíveis de determinação de K _D requerem acesso a proteína de interesse, a geração do qual pode ser demorado e caro purificada. Nós desenvolvemos um protocolo que permite a determinação da afinidade de ligação por termoforese microescala (MST) sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O método envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida e a lise das células em condições não desnaturantes. Aplicação do método para a STAT3-GFP expresso transitoriamente em células HEK293 permitem determinar, pela primeira vez que a afinidade do factor de transcrição bem estudado para oligonucleótidos com sequências diferentes. O protocolo é simples e pode ter uma variedade de aplicações para o estudo das interacções de proteínas com moléculas pequenas, péptidos, ADN, ARN, e proteins.

Introduction

Caracterização quantitativa da afinidade de interacções intermoleculares é importante em muitas áreas da investigação biomédica. Binding constante de dissociação (K _D) é essencial não só na descoberta de drogas, mas também é um parâmetro importante na caracterização de qualquer interacção binário em qualquer sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para a detecção de interações proteína-proteína, tais como imunoprecipitação e fermento telas de dois híbridos, não nos informar sobre como apertada são essas interações, enquanto a afinidade define se este complexo particular, existe sob determinadas condições in vivo. No processo de descobert....

Protocol

1. Preparação de lisado celular

Este protocolo destina-se a células aderentes que expressam qualquer proteína GFP fundida. O número de células necessário pode variar de tão baixo quanto ⁶ a 10 até 20 x 10 ⁶ células, dependendo do nível de expressão da proteína. Por exemplo, lisado de células HEK-sobre-expressam GFP STAT3 foi preparado por tratamento de células crescidas em frascos T75 10 a cerca de 70% de confluência com 1 ml de tampão de lise. No entanto, este lisado teve de ser diluída 150 vezes para fornecer um nível óptimo de fluorescência para o experimento de MST. Protocolo de lise celular depende fortemente das ....

Results

Medição da afinidade de ligação a oligonucleótidos STAT3 não fosforilada da proteína.

As células HEK293 que expressam STAT3-GFP foram usados ​​como uma fonte de STAT3 marcado por fluorescência para ensaio de ligação de DNA. Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão RIPA (20x10 ⁶ células / ml). Para estudos de ligação, os lisados ​​foram diluídos 150 vezes com MST tampão de ligação de ADN para fornecer o nível óptimo da proteína fluorescente na reacção.......

Discussion

A expressão de proteínas e de purificação é um passo trabalhoso e caro, o que é, no entanto, necessárias para a determinação do K _D 'interacções pelo método mais usado actualmente. Aplicação de MST permite evitar a purificação de proteínas, assim, simplificar e acelerar significativamente caracterização quantitativa de interacções. Ele apresenta vantagens particularmente importantes no caso de-a-expressam difíceis e purificar proteínas, tais como proteínas de membrana e os factores de transcrição.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampão RIPA	Millipore	20-188	tampões de outros fabricantes também funcionam
Coquetel de inibidores de protease	Sigma-Aldrich	P2714
Monólito NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monólito NT.115 Bandeja capilar	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monólito NT.115 Tratado padrão Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Software de controle	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Software de análise	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Centrífuga refrigerada de mesa	Eppendorf	5417R	Outras centrífugas refrigeradas de microtubos que fornecem
Protein LoBind Tube 0,5 ml	Eppendorf	22431064