Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Lyuba Khavrutskii; Joanna Yeh; Olga Timofeeva; Sergey G. Tarasov; Samuel Pritt; Karen Stefanisko; Nadya Tarasova

doi:10.3791/50541

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Artigo de método

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

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DOI:

10.3791/50541

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15 de agosto de 2013

Lyuba Khavrutskii¹^,² , Joanna Yeh¹ , Olga Timofeeva³ , Sergey G. Tarasov⁴ , Samuel Pritt¹ , Karen Stefanisko¹ , Nadya Tarasova¹

¹Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, ²Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., ³Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, ⁴Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

Neste artigo

Resumo

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Resumo

Caracterização quantitativa das interações proteína é essencial em praticamente qualquer campo das ciências da vida, particularmente a descoberta da droga. A maioria dos métodos actualmente disponíveis de determinação de K _D requerem acesso a proteína de interesse, a geração do qual pode ser demorado e caro purificada. Nós desenvolvemos um protocolo que permite a determinação da afinidade de ligação por termoforese microescala (MST) sem purificação da proteína alvo a partir de lisados celulares. O método envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida e a lise das células em condições não desnaturantes. Aplicação do método para a STAT3-GFP expresso transitoriamente em células HEK293 permitem determinar, pela primeira vez que a afinidade do factor de transcrição bem estudado para oligonucleótidos com sequências diferentes. O protocolo é simples e pode ter uma variedade de aplicações para o estudo das interacções de proteínas com moléculas pequenas, péptidos, ADN, ARN, e proteins.

Introdução

Caracterização quantitativa da afinidade de interacções intermoleculares é importante em muitas áreas da investigação biomédica. Binding constante de dissociação (K _D) é essencial não só na descoberta de drogas, mas também é um parâmetro importante na caracterização de qualquer interacção binário em qualquer sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para a detecção de interações proteína-proteína, tais como imunoprecipitação e fermento telas de dois híbridos, não nos informar sobre como apertada são essas interações, enquanto a afinidade define se este complexo particular, existe sob determinadas condições in vivo. No processo de descobert....