Nós descrevemos a dissecação do sistema nervoso do mar marinho lebre Aplysia Após a anestesia, o isolamento de neurônios para a cultura de tecidos de curto prazo e gravações de correntes iônicas única célula através da técnica de patch clamp.
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Artigo de método
Isolamento de neurônios sensoriais de
Neste artigo
Resumo
Resumo
O molusco gastrópode marinho Aplysia californica tem uma história venerável como um modelo de funcionamento do sistema nervoso, com particular importância em estudos de aprendizagem e memória. As preparações típicas para esses estudos são aquelas em que o sensorial e motoneurónios são deixadas intactas num animal minimamente dissecados, ou uma técnica elaborada neuronal co-cultura de motoneurónios e sensorial indivíduo. Menos comum é o isolado preparação neuronal em que pequenos grupos de neurônios nominalmente homogêneos são dissociados em células isoladas em cultura de curto prazo. Tais células isoladas são úteis para a caracterização biofísica das correntes de iões utilizando técnicas de patch clamp, e modulação específica destas condutâncias. Um protocolo para a preparação de tais culturas é descrito. O protocolo aproveita os facilmente identificáveis neurônios sensoriais glutamatérgicos do gânglio pleural e bucal, e descreve a sua dissociação e manutenção mínima in cultura durante vários dias, sem soro.
Introdução
O molusco opistobranch marinho Aplysia, tem sido um modelo neurobiológico útil para muitas décadas. Ele é mais conhecido como um modelo de habituação e condicionamento clássico 7, 8. Estudos sobre a aprendizagem e memória neste modelo ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 2000 por Eric R. Kandel, em um prêmio que ele compartilhou com Arvid Carlsson e Paul Greengard 10. Estudos envolvendo gravações eléctricos de preparações reduzidas, em que os elementos do sistema nervoso deste invertebrado são dissecados do animal com nervos e músculos permanecer ligados, ajudaram a elucidar os papéis de neurónios individuais na Aplysia. A identificação dos mecanismos moleculares precisos que constituem a aprendizagem em Aplysia no entanto, muitas vezes empregue uma outra técnica, a longo prazo co-culturas de um neurónio sensorial e uma neurónios motores, um por um, obtido a partir de animais dadores individuais e deixou-se formar uma sinapse no prato de cultura 21 .
Nós e outros 1, 3, 6, 14, 15, 16 têm explorado a facilidade com a qual identificou neurônios pode ser alvo neste modelo, bem como a sua resistência em experimentos de longo prazo para fazer culturas de curto prazo dissociadas de aglomerados de neurônios nominalmente homogêneas em que estudamos correntes iônicas sob braçadeira de tensão na configuração de patch clamp. Muitos neurônios Aplysia enfrentar repetidas rodadas de remendo de fixação para dar tempo para manipulações experimentais de longa duração. A técnica é útil para os neurónios tais como as células do saco neurossecretoras do gânglio abdominal, e os neurónios sensoriais do gânglio da pleura e bucal cuja dissociação aqui descrita, mas não no caso de grandes neurónios> 60 um de diâmetro, tal como L7 ou R2 gânglio abdominal. Não empregamos soro Aplysia em nossas culturas, ao contrário dos co-culturas sensório-motoneurônio descritos em outro lugar. A maioria dos neurônios obtidos através deste procedimento será sem processos de tele primeiras 48 h em cultura, facilitando a gravação voltagem da célula inteira, mas, em seguida germinar e elaborar axónios e outros processos para cerca de 14 dias antes da morte da falta de nutrientes e / ou factores de crescimento.
Esta técnica produz culturas primárias de neurônios por 50-100 prato de regiões fisiologicamente documentados do gânglio vestibular e pleural. Este protocolo é útil para pesquisadores que estudam os aspectos da fisiologia da célula única em experimentos que requerem numerosos experimental repetições por animal. Ela produz um par correspondente de culturas devido à separação anatómica das células alvo em hemiganglia esquerda e direita, permitindo estudos que beneficiam com o tratamento combinado e as culturas de controlo.
O protocolo visa bucais S cluster (BSC) neurônios do gânglio vestibular, e ventrocaudais (PVC) neurônios do gânglio pleural pleural. Estas células são um tamanho apropriado para as gravações de tensão de células inteiras e de exibição Robust respostas glutamatérgicos. A metodologia discutido é apropriado para a maioria dos gânglios do sistema nervoso Aplysia.
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Protocolo
1. Preparação celular
- No dia 1, pesar e anestesiar animal.
- Pesar a 30 g-1 kg de animal. Anestesiar em 5-10 volumes de animais de 01:01 de água do mar: MgCl isotónica. 6H 2 0 durante 1 hora, com arejamento, tal como uma bomba de ar eléctrica de aquário com uma pedra difusora em anexo.
- Preparar material de dissecação.
- Montar bandeja de dissecação limpa com alfinetes de aço inoxidável, tais como pinos de tecido. Montar vários pratos de Petri contendo água do mar artificial (ASW, ver as Tabelas 1 e 3) + penicilina / estreptomicina (P / S).
- Tenha pronto um microscópio de baixa potência. Ter instrumentos de dissecção limpo pronto, como nariz com nervuras e finas pinça cirúrgica, e multa e grandes tesouras cirúrgicas. Pulverizar os instrumentos com 70% de álcool isopropol antes da utilização e deixar secar.
- Posição animal na bandeja de dissecação.
- Posição animais lado ventral para baixo na bandeja de dissecação. Pin animaisatravés bordas da parede do corpo e fronteiras parapodial, mas evitar a cauda ea cabeça, para expor a superfície dorsal eo sulco genital
- Enxaguar a superfície dorsal na água slow-running da torneira fria. Aplicar um fluxo de luz de 70% de álcool isopropol de um frasco de pressão ao longo do sulco genital e sobre a parte superior da cabeça.
- Fazer a incisão inicial.
- Usando um microscópio de baixa potência (veja a Tabela 2) e a luz reflectida para observar o ponto em que a ranhura genital origina a partir da margem anterior do invólucro, tautly segurar com nervuras-nose pinça uma dobra de tecido para o lado esquerdo desta origem, enquanto um recorte raso buraco todo o caminho através da, área lisa e plana de parede do corpo à direita do sulco genital com multa tesoura angulada.
- Hemolinfa deve ser observado para derramar do buraco, às vezes levando consigo o gânglio abdominal e do estômago.
- Expanda a incisão.
- Use tesoura grande para expandir the incisão anterior a um ponto entre as rhinophoros, enquanto puxa para cima com a lâmina inferior, para evitar o entalhamento intestino. Os órgãos internos serão observados para derramar da incisão.
- Remover os gânglios.
- Reposicionar a bandeja e reorientar o microscópio sobre a região da cabeça.
- Utilizando uma pinça limpa e tesouras finas, remove os gânglios cabeça, cortando em um ponto os nervos que formam gânglios cabeça em um anel ao redor do esôfago para remover pleural-pedal e cerebral gânglios como um grupo.
- Remover o gânglio vestibular que adere ao lado ventral do esófago.
- Retire o gânglio abdominal cortando os 4 grandes conectivos nervosas que emitem a partir deste gânglio.
- Isolar gânglios de interesse.
- Apare gânglios cabeça separados, deixando um comprimento de conectivos ligados uns aos gânglio de interesse, que é igual a, pelo menos, o diâmetro do gânglio, o que irá retardar a enzima sobre-digestãodas células de interesse no passo seguinte.
- Coloque cada gânglio alvo através de duas lavagens de ASW + P / S, movendo-se entre as lavagens com uma pinça limpa.
- Se alvo as células de PVC, deixe o hemiganglion pleural direito ligado à hemiganglion pedal direito, e da mesma forma deixar o hemiganglion pleural esquerdo ligado ao hemiganglion pedal esquerdo.
- Descartar gânglios indesejada e o resto do animal de acordo com a prática da pesquisa aceite.
- Enzimaticamente digerir os gânglios.
- Para cada gânglio, preparar 1 ml de solução de enzima consistindo de dispase 3,75 mg, 1 mg e 0,3 g hialuronidase colagenase tipo XI por ml de ASW + P / S num tubo cónico de 15 ml de polipropileno.
- Lugar lavado gânglios na solução enzimática e coloque a tampa firmemente. Colocar o tubo no seu lado num agitador rotativo (ver Tabela 2), a uma velocidade lenta para 13-5 hr durante a noite a cerca de 23 ° C (temperatura ambiente).
- Prepare oplacas de cultura.
- Antes de microdissecção (Dia 2), preparam poli-D-lisina (PDL) revestidos em placas de cultura de um capuz de cultura de tecidos. Adicionar 0,5 ml de PDL ~ (0,2 mg / ml de água esterilizada) ao centro de 35 mm de prato de ~ 25 min.
- Lavar PDL 3x com água estéril. Deixe secar. UV-esterilizar as placas.
- Dia 2 Isolar os neurônios.
- Encher o centro de pratos de 35 mm que foram PDL revestido e UV esterilizadas com aproximadamente 0,5 ml de ASW + P / S para criar uma ilha de meios de comunicação dentro do prato de outro modo seca. Isto pode ser feito sobre a bancada, fora do capuz de cultura de tecidos. Um prato deve ser preparado para cada grupo de células provenientes de um hemiganglion.
- Já imediata de 100 mm de diâmetro dissecção prato feito por Sylgard-revestimento e cura de uma superfície de dissecção 5 mm de profundidade, equipado com pinos de dissecação fina de diversos tamanhos para serem utilizados como pinos e as sondas (ver Tabela 3). Enxaguar este prato com 70% de álcool isopropol, em seguida, com ASW + P / S, e, finalmente, fill com ASW + P / S.
- Prepare microdissection de gânglios digerida.
- Despeje a solução de enzima que contém a pleural-pedal e bucal gânglios digerido no prato dissecção.
- Colocar a cápsula na fase do microscópio sobre uma superfície preta sob luz reflectida.
- Usando o tecido conjuntivo em anexo, o pino de cada lado dorsal hemiganglion pleural pedal-up. Os tecidos vão ser suave e intolerante de alongamento.
- Microdissect neurônios PVC.
- Usando dois pares de fórceps finas e limpas, e segurando um pino de dissecação muito bem em um par de fórceps como uma sonda, isolar as células de PVC a partir de um hemiganglion pleural. Digestão enzimática irá ter removido ou partido para além da bainha do tecido conjuntivo que cobre o conjunto de PVC, no entanto, as células vão aderir um ao outro.
- Utilização da sonda de separar estas células a partir do conjuntivo pedal 18 pleural, em seguida, deixar cair o grupo de células para a parte inferior da dissecçãoprato.
- Transferir neurônios prato de cultura.
- Transfira o grupo de células a um preparado 35 milímetros prato de cultura sugando suavemente o cluster na ponta de um pouco de fogo polido descartável vidro Pasteur pipeta, em seguida, dispensando-o lentamente na ilha de mídia em uma placa de cultura, tomando cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar para a pipeta. Repita o isolamento do cluster PVC do outro hemiganglion e coloque em um prato de cultura distinta.
- Microdissect e transferir BSC neurônios.
- Pin o gânglio lado ventral bucal para cima, com cuidado para poupar as células de interesse. Repetir passo 1.12, com os dois conjuntos de células BSC do gânglio vestibular 10.
- Isolamento de PVC e BSC neurônios irá produzir quatro placas de cultura contendo aglomerados de neurônios: 2 pratos que contenham grupos BSC e 2 pratos contendo aglomerados de PVC. Descartar o resto dos gânglios e anular o prato de 100 mm de dissecação.
- DissocIATE os grupos de células.
- Coloque um prato de cultura contendo células no estágio do microscópio de baixa potência e retire a tampa.
- Dissociar o cluster PVC sacudindo suavemente a parte inferior da placa de cultura junto ao grupo de células com um pino de dissecação fina realizada em fórceps. Piparotear espetada a ponta do pino no plástico do fundo do prato, como se tentasse cavar uma mancha de plástico. Quando o atrito com o plástico libera o ponto de pino, uma onda de percussão é produzido através do meio que rompe a moita nas proximidades de células.
- 5-10 súbitos podem ser necessários para quase dissociar completamente as células, mas é preferível deixar pequenos aglomerados de células, em vez de passe rapidamente demais para que as células sejam destruídos por pura mecânica.
- Recoloque a tampa e repita com outros pratos da cultura.
- Armazenar culturas de células.
- Coloque as placas de cultura contendo ilhas de mídia em seus centros com células dissociadas emum grande recipiente, que permite a circulação de ar, tal como um x 25 mm de plástico redondos de Petri de 150, e em colocar este prato um conjunto incubadora a 17 ° C.
- Instalar na câmara num prato aberto de água como fonte de humidade. Deixar repousar durante a noite. As células aderem ao revestimento de poli-D-lisina no centro do prato.
- Placas de cultura de inundação.
- No Dia 3, os pratos inundar suavemente com 2,5 ml de ASW + P / S. Examinar e contar as células usando um microscópio de cultura de células invertido. Loja no 17 ° C incubadora.
2. Eletrofisiologia
O método é o tampão padrão de aperto que tem sido descrito em numerosos documentos (por exemplo, Sakmann e Neher, 1995) 16. Este protocolo irá funcionar em células ≤ 100 pF de capacitância, ou células <60 um de diâmetro durante os dias 3 e 4 do protocolo. Células sem processos são ideais para a gravação. A seguir CONSIDERAÇ especialíons se aplicam:
- Células maiores podem ser acomodados com a configuração do amplificador Axopatch 200B configurada para β = 0,1. Activação de grandes correntes pode levar as células a escapar fixador de tensão. Soluções ASW substituído por o teor de sal (por exemplo, uma fracção do NaCl substituo com cloreto de N-metil-D-glucamina impermeável) pode ser usado para reduzir toda a amplitude da corrente de células.
- Fibra pipetas cheias de remendo borosilicato puxadas sobre um puxador de pipeta e reencheu meio com uma solução intracelular (ICS), constituído por 450 mM de KCl e outros sais (ver Tabela 1) são adequados, e deverá ter a resistência de cerca de 0,5-1 MOhms. Se o isolamento de correntes iónicas específicas é desejada, por exemplo, as correntes de Na +, na ausência de correntes de K, K + no presente solução pode ser substituído por outros iões tais como + Cs. Cl - substituição do ICS com um ânion impermeant também é justificada se a ICS mais natural é desejado9.
- As células são robustos com> 1 hr de duração gravações possíveis à temperatura ambiente. A gravação é ideal nos dias 3 e 4 do protocolo, correspondendo a 24-48 h em cultura. Após 48 horas, há dificuldade em formar vedações gigaohm, talvez devido à elaboração de um glicocálice na superfície da célula, e os problemas de fixação de espaço causados pelo processo de desdobramento. As células são úteis, no entanto, para estudos de fixação não-correção, tais como toxicologia, que podem ser concluídos em <14 d.
- ASW e outras soluções para ser distribuído a partir do dispositivo de solução alimentada por gravidade, bem como a solução intracelular, deve ser filtrada através de uma seringa montada 0,2 um filtro Acrodisk (Tabela 3) para eliminar as partículas finas que interferem com a formação de selo gigaohm.
- A dessensibilização ocorre quando se utiliza agonistas tais como D-aspartato (D-Asp), portanto, ~ 1-2 min entre as aplicações dos agonistas é recomendada. Inversamente, a potenciação é frequentemente observada com rápida aplicação repetidacatião de agonistas, tais como L-glutamato (L-Glu).
- Agonist correntes activadas, tais como L-Glu, pode ser estudado através da aplicação de agonistas com o Picospritzer pipeta. Esta pipeta é puxado para a mesma que a pipeta patch e contém agonista ASW. Quando a ponta da pipeta este está posicionado abaixo do tubo de saída do dispositivo de solução alimentada por gravidade, e a um ângulo de 45 ° a partir do tubo de saída (Figura 2F), agonista será rapidamente lavados a partir da célula, e dessensibilização será minimizado. A pipeta agonista deve criar um ângulo de 90 ° ou mais em relação à pipeta patch.
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Resultados
As localizações dos neurónios sensoriais dos gânglios dentro que são orientados neste protocolo, os neurónios do BSC e PVC são mostrados na Figura 1. Os neurónios BSC estão localizados em dois conjuntos ovais simétricos no lado ventral do gânglio vestibular, a superfície que fica virado para fora a partir da massa no gânglio vestibular intacta (Figura 1A). Os neurónios do PVC formam aglomerados bilaterais, em forma de V que envolvem a superfície dorsal do gânglio pleural em direcção ao ...
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Discussão
As técnicas descritas aqui dissociação produzir culturas de neurônios sensoriais contendo 50-100 neurônios isolados intercaladas com um pequeno número de células gliais e outras células não identificados. Os passos mais críticos na protocolo são o momento em que o gânglio permanecem na solução enzimática, e sacudindo a dissociação dos grupos de células digeridos para quebrar o aglomerado em células individuais. Digestão enzimática (passo 1.8) tem de ser optimizada para a temperatura disponível. A 23 ° C com agitação len...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Financiado pelo NIH P40 OD010952, a Fundação Korein, da Universidade de Miami Fellowship para SLC e uma bolsa Maytag a ATK. Os autores agradecem o pessoal da Resource Nacional de Aplysia, assim como Lauren Simonitis e Hannah Peck, que forneceu micrografias para a figura.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Água do mar artificial ASW | Sigma-Aldrich | sortida | (mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6 |
| Solução intracelular | Sigma | sortida | (mM): 450 KCl, 2,9 CaCl2 (2 H2O), 2,5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA e 40 HEPES-KOH, pH 7,4 |
| Poli-D-lisina | Sigma | P6407 | ; |
| penicilina/estreptomicina adicionada ao ASW em 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5.000 Unidades/ml de penicilina mais 5.000 mg/ml de estreptomicina |
| Distribuição neutra II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| hialuronidase | Sigma-Aldrich | H4272 | ; |
| colagenase tipo XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-Glutamato (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-Aspartato (D-Asp) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-metil-D-aspartato (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-Asp | Sigma | A6683-25G | |
| ácido alfa-amino-3-hidroxil-5-metil-4-isoxazol-propiônico (AMPA) | Sigma | A6816-5MG& | nbsp; |
| Antagonistas L-Glu R | vários | ||
| ágar | |||
| quinurenato | Sigma-Aldrich | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Ácido DL-2-amino-5-fosfonopentanóico (antagonista NMDAR) | |||
| 2-propanol | VWRSP | BDH1133 | |
| Solução de cloreto | Sigma | sortida | 25 g FeCl3 + 25 ml de HCl concentrado + 50 ml H2O |
| Polímero de silicone de 2 partes Sylgard | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Fornece superfície de pinagem para pequenos pratos de dissecação |
| Microscópio de ampliação de zoom de 0-40x para dissecações | Wild | ||
| Iluminador de Fibra Óptica Techniquip 150 Watts | Microoptics da Flórida | TQ FOI-150 | |
| orbital RotoMix 50800 | |||
| Microscópio de contraste de fase invertido Nikon Diaphot com objetivas de 4x, 20x (opcional) e 40x | SR Research Ltd. | Eyelink II& | nbsp; |
| Osciloscópio digital Tektronix | SR Research Ltd. | ||
| Software de aquisição e análise de dados pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| PC com sistema operacional Windows XP ou superior | Soluções | para PC Thinkserver com discos rígidos de estado sólido (80GB) e monitores de baixo ruído | |
| Extrator de micropipeta Flaming/Brown P87 | Sutter Instruments, Novato, CA& | nbsp; | |
| Amplificador de grampo Axopatch 200B da Axon Instruments com uma faixa de compensação de capacitância de 1-1000 pF; pré-amplificador | Molecular Devices, Sunnyvale, CA& | nbsp; | |
| Suporte de eletrodo Axon instruments para pré-amplificador Axopatch 200B | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV203BU | |
| Conversor A/D Digidata 1200 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA& | nbsp; | |
| Picospritzer, alimentado por N2 ajustável para pressão e duração | Parker Hannifin, Cleveland, OH& | nbsp; | |
| Mesa de isolamento de vibração TMC Micro-G | Ametek | ||
| personalizada | gaiola de Faraday | ||
| Micromanipuladores de garra piezoelétricos Burleigh | Instruments; Thorlabs | atualmente PCS-5000; -6000 series + monta | |
| manipuladores manuais Narishige M-152 (para sistema de perfusão e picospritzer) | Narishige USA& | nbsp; | |
| Vidro de pipeta de filamento, 1,5 mm OD, 0,84 mm ID - | WPI | 1B150-3 | |
| 3 polegadas de comprimento | |||
| Ag/AgCl meia célula | WPI | EP4 | |
| Tubos de centrífuga de 15 ml, 35-2097 BD Falcon* Tubos de centrífuga | VWRSP | 21008-918 | |
| Tesoura Angulada | Ferramentas de Ciência Fina | 15006-09 | |
| Pinça Fina Dumostar | Ferramentas de Ciência Fina | 11295-00 | |
| Placas de cultura de tecidos de falcão de 35 mm | VWRSP | 25382-064 | |
| Placas de cultura de tecidos Falcon 150 x 25 mm; 1013 | VWRSP | 1013 | também pode ser transformado em pequenas placas de dissecação com sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| bandeja de dissecação de animais | várias | ||
| Tubos de centrífuga de 15 ml, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | Para sistema de perfusão alimentado por gravidade de 6 |
| furos Clipes de alumínio com extremidades de furo de parafuso | loja | Para sistema de perfusão | |
| Agulhas de calibre 23 (pontos de arquivamento manual) | VWRSP | Para sistema de perfusão | |
| Tubo de polietileno 0,022"ID x 0,042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | Para sistema de perfusão | |
| H-7 suporte de pipeta para matriz de perfusão microcap | Narishige USA | Para sistema | |
| válvulas unidirecionais | Para sistema de perfusão | ||
| Drummond Microcaps 1 μ l | VWRSP | Para sistema de perfusão | |
| agulhas de calibre 18 para sucção (pontos de descarga) | |||
| Tubo de polietileno | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| pinos de dissecação fina | Ferramentas Fine Science | 26002-20 | |
| tubos capilares | Kimble 71900-100 | polidos a fogo e em forma de U em uma chama de bico de Bunsen e preenchidos com ágar 3% em | |
| loja de artesanato em argila de modelagem | ECS | ||
| suporte para prato para estágio de microscópio com banho | |||
| Pipetas pasteur | VWRSP | 14672-412 | |
| bulbos de pipeta | VWRSP | 53283-911 | |
| filtros de seringa acrodisk | VWRSP | 28144-040 | |
| filamento de vidro borossilicato de parede espessa de 1,5 mm de diâmetro | WPI | 1B150F-3 | |
| Cilindro de nitrogênio de alta pureza e regulador | |||
Tabelas 1-3. Listas de reagentes, materiais e equipamentos. |
Referências
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Reimpressões e permissões
