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Artigo de método

Geração de subcutânea e intra-hepática Humanos carcinoma hepatocelular Xenoenxertos em Immunodeficient Ratos

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DOI:

10.3791/50544

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25 de setembro de 2013

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1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Department of Pathology, University Health Network, 3Division of General Surgery, University Health Network

Neste artigo

Resumo

Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.

Resumo

In vivo modelos experimentais de carcinoma hepatocelular (HCC) que recapitulam a doença humana fornecer uma plataforma valiosa para a pesquisa em fisiopatologia da doença e para a avaliação pré-clínica de novas terapias. Nós apresentamos uma variedade de métodos para gerar subcutânea ou ortotópicos xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes que pode ser utilizado em uma variedade de aplicações de pesquisa. Com um foco sobre o uso de tecido do tumor primário de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica como ponto de partida, descrevemos a preparação de suspensões de células ou fragmentos tumorais para xeno. Descrevemos as técnicas específicas para estes tecidos de xenoenxerto i) por via subcutânea, ou ii) intrahepatically, quer por implantação directa de células tumorais ou fragmentos para o fígado, ou indirectamente através de injecção de células no baço do rato. Os requerentes também descrevem a utilização de ressecção parcial do fígado nativo do rato na altura do xeno-enxerto como uma estratégia parainduzir um estado de regeneração hepática ativa no rato destinatário que pode facilitar o enxerto intra-hepática de células tumorais humanas primárias. Os resultados esperados destas técnicas são ilustradas. Os protocolos descritos foram validados utilizando amostras HCC humanos primário e xenotransplantes, que normalmente executam menos robusta do que as linhas de células de carcinoma hepatocelular humano bem estabelecidas que são amplamente utilizados e freqüentemente citados na literatura. Em comparação com linhagens de células, discutimos os fatores que podem contribuir para a relativamente baixa chance de enxerto HCC primário em modelos de xenotransplante e comentar sobre as questões técnicas que podem influenciar a cinética de crescimento de xenotransplante. Sugerimos também os métodos que devem ser aplicados para garantir que xenografts obtidos assemelham-se com precisão os tecidos HCC-pai.

Introdução

O carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto tipo de câncer mais comum no mundo eo mais rapidamente crescente causa de morte por câncer na América do Norte. O fator de risco mais prevalente para HCC é a cirrose hepática, ocorrendo com mais freqüência devido a hepatite crônica viral, abuso de álcool, doença auto-imune, ou distúrbios metabólicos hereditários 1.

Apesar da carga de doença pesada imposta pelo HCC em populações em todo o mundo, a fisiopatologia da HCC é relativamente mal entendido em comparação a outros cânceres comuns como colorretal, de mama ou câncer de próstata. Por exemplo, os eventos moleculares e celulares específicos tumorigenesis condução continuam a ser claramente definidas 2. Como a maioria dos cancros epiteliais sólidos, abordagens genómicas revelaram heterogeneidade nas aberrações associadas com HCC 3. Um certo número de estudos revelaram actividade desordenado de uma variedade de vias de sinalização envolvidos na proliferação celular, survência, diferenciação, e angiogénese 4. Além disso, o papel de células estaminais de cancro no HCC pathobiology ser esclarecido 5.

Com uma compreensão limitada do HCC fisiopatologia, o arsenal de terapias eficazes para HCC também se manteve relativamente limitada. Pacientes em início de carreira com tumores confinados ao fígado são candidatos à terapia curativa com ablação do tumor ou ressecção cirúrgica, embora a recorrência é comum. Para pacientes com doença mais avançada, a quimioterapia ea radioterapia são de eficácia limitada e são usados ​​principalmente para o controle da doença com intenção paliativa 6.

Alta qualidade in vivo modelos experimentais de HCC humana fornecer, assim, uma plataforma valiosa para a pesquisa básica muito necessária para a fisiopatologia da HCC humana, bem como para a avaliação de novas abordagens terapêuticas. Em comparação com a utilização de linhas celulares ou em modelos de rato altamente definidos, xenoenxertos de pritumores Maria humana em ratinhos imunodeficientes surgiram como ferramentas valiosas para tais estudos, uma vez que são capazes de recapitular a doença humana com alta fidelidade reflectindo também a heterogeneidade que se encontra presente no interior e entre os diferentes pacientes 7,8. Para este fim, temos desenvolvido uma variedade de métodos para estabelecer xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes. Enquanto a maioria dos estudos publicados envolvendo xenografts HCC descrever o uso de linhas de células de carcinoma hepatocelular humano bem estabelecidas para esse fim, temos focado na otimização de nossos ensaios para gerar xenografts de espécimes HCC primários obtidos imediatamente após a ressecção cirúrgica de pacientes.

Podem ser necessárias técnicas xeno diferentes para aplicações diferentes de pesquisa. Por exemplo, xenoenxertos subcutâneos gerados a partir de fragmentos de tumor são geradas rapidamente, são facilmente monitorizados, podendo ser mais apropriado para a administração local de novas terapias com convenientemonitoramento da resposta do tumor. Xenoenxertos intrahepáticos podem ser mais relevantes para os estudos relacionados com o papel do microambiente hepática em biologia HCC. Xenoenxertos gerados a partir de suspensões de células tumorais são necessários para a identificação e caracterização de subconjuntos de células de iniciação do tumor ou para experiências que requerem a manipulação in vitro de células tumorais antes de xenotransplante. Assim, temos desenvolvido e validado os seguintes protocolos para estabelecer subcutânea ou intra-hepáticos a partir de xenoenxertos de suspensões de células ou fragmentos de tumores derivados das amostras de carcinoma hepatocelular humano primárias.

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Protocolo

Uma visão geral esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1.

1. Processamento das Amostras HCC Humano

Obter espécimes HCC humana primárias com o consentimento do paciente por escrito e com a aprovação do conselho de ética em pesquisa institucional. Estes protocolos têm sido realizados em nossa instituição com a aprovação do Conselho de Ética de Pesquisa University Health Network, em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano.

Coletar amostras de CHC frescos o mais rápido possível após o procedimento cirúrgico, uma vez amostras adequadas sejam tomadas para fins clínicos. Idealmente, esta deverá ter lugar dentro de 30 minutos após a retirada do tecido do paciente. Tal como ilustrado na Figura 2, uma amostra de, pelo menos, 1 cm 3 obtidos a partir da periferia do tumor é o ideal, como a parte central do tumor pode ser necrótico.Os tumores que não receberam qualquer tratamento antes de ressecção tais como a radiação, quimioterapia, ou ablação são preferidos, a fim de maximizar a probabilidade de que as células tumorais são viáveis. Lidar com tecidos humanos primários, de acordo com os protocolos de proteção individual padrão para material de risco biológico. Realize todas as manipulações laboratoriais de tecidos tumorais e preparações de células em uma cabine de segurança biológica classe II usando técnicas assépticas.

  1. Colocar a amostra HCC fresco em 10-25 ml Modified Eagle Médium F12 / 's Ham de Dulbecco isento de soro, a 4 ° C e transferir em gelo para o laboratório para processamento imediato e preparação de fragmentos de tecidos e / ou células de xeno-enxerto em ratinhos.
  2. Utilizando fórceps estéreis, colocar a amostra de tumor em 100 mm x 20 mm numa caixa de Petri ou outra superfície de trabalho estéril adequado. Dividir a amostra tumoral em fragmentos de cerca de 2-3 mm 3, usando uma lâmina de bisturi cirúrgico No.10. Neste ponto, considere o snap-congelamento ou de fixação de formalina some fragmentos do tumor para outros experimentos ou análises, conforme necessário.
  3. Para fragmentos de tumor de xeno-enxerto, colocar alguns dos fragmentos de HCC em um ou mais tubos de microcentrífuga contendo Matrigel suficiente para permitir que os fragmentos de permanecer submerso. Mantenha estes tubos no gelo.
  4. Para a preparação de uma suspensão de células de tumor, utilizar a lâmina de bisturi cirúrgico para picar o tecido HCC remanescente tanto quanto possível e misturar-se com 5-10 ml de DMEM-F12 em um tubo de 50 ml, dependendo do volume do tecido moído.
  5. Adicionar colagenase tipo IV e dispase II a concentrações finais de 200 unidades / ml e 0,8 unidades / ml, respectivamente. Pipeta a mistura para cima e para baixo bem com uma pipeta de 25 ml.
  6. Veda-se o tubo e incubar a mistura a partir do passo 1.6 a 37 ° C numa incubadora de dióxido de carbono a 5% durante 30-60 minutos, dependendo da suavidade do tecido do tumor. Pipeta a mistura para cima e para baixo algumas vezes a cada 10 minutos para avaliar o progresso da digestão enzimática.
  7. Depois de digestion estiver concluída, passar a solução tumor através de um filtro de células 100 m. Suavemente triturar o tecido remanescente no filtro celular utilizando uma ponta de pipeta de 25 ml, ao permitir que o número máximo de células tumorais para passar. Coletar a suspensão de células tensas em um tubo cônico de 15 ml.
  8. Centrifugar a suspensão de células do tumor a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C.
  9. Delicadamente, decantar o sobrenadante. Dependendo do tamanho da pílula, adicionar 2-5 mL de gelo frio 1x de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise e suavemente pipetar para cima e para baixo para ressuspender o sedimento. Mantenha no gelo por 5 min.
  10. Adicionar DMEM-F12 para um volume total de 15 ml e centrifugar a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para lavar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos.
  11. Delicadamente, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento RBC-livre de células tumorais em DMEM-F12.
  12. Contar as células viáveis ​​utilizando a exclusão de azul de tripano, manualmente ou com um contador de células automatizado.
  13. Alíquotas de células de tumor de centrífuga contendo o desejado number de células por injecção, tal como descrito acima, ressuspender o sedimento de células resultante em 30 mL de gelo-Matrigel frio, e armazenar em gelo.

Opcional: Depois do passo 1.11, rotineiramente depleção das células humanas CD45 + (leucócitos) a partir da suspensão de células de tumor em massa e / ou purificar os subconjuntos de células tumorais utilizando a citometria de fluxo ou esferas imunomagnéticas. Os protocolos detalhados para estas técnicas são bem descritos pelos fabricantes dos anticorpos relevantes, grânulos, e citómetros de fluxo.

Nota: O protocolo descrito acima podem também ser utilizadas para efectuar a xenoenxertos de tumores humanos colhidos a partir de ratinhos, a fim de realizar o transplante em série, substituindo o tecido de xenoenxerto para o tecido HCC humana primária no passo 1.1. Nesta situação, após o passo 1.11, rotineiramente esgotar células infiltrantes de murino a partir da suspensão das células usando um anticorpo contra o antigénio de rato histocompatibilidade H2K.

2.Xeno

Realizar todos os procedimentos com animais, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados com os animais institucional. Os procedimentos aqui descritos foram cumpridos ao abrigo de algum Uso de Animais protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care da University Health Network, nos termos e de conformidade com todas as agências relevantes regulatórios e institucionais, regulamentos e diretrizes.

Equipamentos para a entrega de agentes anestésicos voláteis inalatórios para animais de pequeno porte devem ser utilizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão do biotério e instituto de pesquisa. Realizar todos os procedimentos cirúrgicos, utilizando técnica asséptica e instrumentos esterilizados em uma cabine de segurança biológica classe II. Utilizar não obesos imunodeficiência combinada severa diabético (NOD / SCID) ou NOD / SCID / interleucina 2 do receptor gama cadeia nulos (NSG) estirpes de ratinhos de ambos os sexos, em 6-8 semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Estescamundongos devem ser alojados e mantidos em um local capaz de proporcionar condições isentos de agentes patogénicos adequados para animais imunodeficientes.

Preparar para cirurgia ratos numa câmara fornecer a 5% (v / v) de isoflurano inalado em 1 L / min de oxigénio. Manter a anestesia até que haja perda de reflexo corneal e dedo do pé no animal (s). Para xeno subcutânea, raspar uma ou mais pequenas áreas no dorso do animal (s) e limpar a pele com etanol a 70%. Para xeno intra-hepática, raspar o tórax e abdômen ventral do animal (s) a partir da axila até a região inguinal e limpar a pele com etanol 70%.

2.1 implante subcutâneo de fragmentos do tumor

  1. Colocar o rato anestesiado deitado, mantém a anestesia por inalação de isoflurano (2% (v / v) em 1 L / min de O2) com um bocal. Aplicar Tear-Gel para proteger os olhos do animal de lesão traumática.
  2. Esterilizar a zona dorsal rapada (s) com Betadinelimpeza cirúrgica seguido de etanol a 70% e por fim com uma solução de povidona-iodo.
  3. Faça uma incisão na pele 5 milímetros usando uma tesoura afiada estéreis.
  4. Inserir uma tesoura sem corte fechou suavemente no espaço subcutâneo e espalhar com cuidado para desenvolver um bolso grande o suficiente para acomodar um fragmento de tumor.
  5. Insira o fragmento de tumor preparada no passo 1.3 na bolsa subcutânea usando uma pinça fina estéreis.
  6. Feche a incisão na pele com suturas ou grampos.
  7. Prestar cuidados no pós-operatório para o mouse, conforme descrito abaixo.

2.2 A injecção subcutânea de células tumorais

  1. Prepare o animal conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2.
  2. Carregar a suspensão de células de tumor em Matrigel preparados no passo 1.13 a uma seringa de insulina com uma 29 G 1/2 em agulha.
  3. Inserir a agulha no espaço subcutâneo e descarregar o conteúdo da seringa. Avançando a agulha alguns milímetros ao longo do plano subcutâneo distância from o local da punção da pele impede a fuga de suspensão de células do tumor para fora do local da punção após a retirada da agulha.
  4. Prestar cuidados no pós-operatório para o mouse, conforme descrito abaixo.

2.3 Implantação de fragmentos do tumor intra-hepática

  1. Usando um 27 G 1/2 na agulha em uma seringa de 1 ml, administrar 350 mL de estéril por via subcutânea normal de solução salina no dorso do pescoço do animal anestesiado para compensar as perdas de fluido intra-operatórias. Para analgesia, administrar 350 ul de solução salina estéril normal contendo buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea no flanco do animal, usando um 1/2-in agulha 27 G e seringa de 1 ml.
  2. Colocar o rato supina sobre um tapete de pré-aquecida, com o nariz e a boca posicionado dentro do bocal para proporcionar manutenção da anestesia por inalação de isoflurano (2% (v / v) em 1 L / min de O2).
  3. Estenda as pernas e prenda-os com fita adesiva a superfície de operação para otimizar a exposição deabdômen ventral e tórax.
  4. Realize o procedimento em uma lente de aumento para otimizar a visualização.
  5. Esterilizar a pele rapada no abdómen e do tórax ventral com limpeza cirúrgica Betadine seguido de etanol a 70% e por fim com uma solução de povidona-iodo.
  6. Usando uma tesoura afiada estéreis, fazer uma incisão na pele subcostal bilateral transversal e dividir as camadas musculares para entrar na cavidade peritoneal para permitir a exposição adequada de todo o fígado.
  7. Coloque um ponto na pele acima do apêndice xifóide e prendê-lo para o bocal com fita adesiva, de modo a permitir uma melhor exposição do fígado e estruturas adjacentes.
  8. Use dois aplicadores com ponta de algodão adjacentes e posterior ao fígado para estabilizá-lo.
  9. Fazer uma incisão de 3 mm de comprimento e profundidade na superfície do fígado usando uma lâmina de bisturi número 10 estéril.
  10. Aplique imediatamente Surgicel e pressão suave para o local da incisão para alcançar a hemostasia; remover após 60-90 sege prosseguir somente se a hemostasia completa foi alcançada.
  11. Coloque um fragmento de tumor passo 1.3 na incisão do fígado com uma pinça fina estéreis ou com uma agulha de 18 G.
  12. Aplicar um pequeno pedaço de Surgicel sobre a incisão no fígado para impedir o deslocamento do fragmento de tumor e garantir a hemostase continuação.
  13. Feche a incisão com suturas ou grampos.
  14. Prestar cuidados no pós-operatório, conforme descrito abaixo

2.4 Implantação intra-hepática de células tumorais através de injecção directa no fígado

  1. Prepare o mouse como descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.7 supra.
  2. Carregar a suspensão de células tumorais (preparado no passo 1.13) para uma seringa de insulina usando um 29 G 1/2 em agulha.
  3. Com o fígado estabilizado usando um aplicador de algodão-ponta, insira a agulha de seringa de insulina no fígado e promover a ponta alguns milímetros fora do local da punção longo de um plano subcapsular.
  4. Suavemente descarregar o conteúdo da seringa e tuando remover a agulha do fígado.
  5. Local Surgicel sobre o local da punção e aplique uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para evitar a fuga de suspensão de células do tumor e para alcançar a hemostasia completa.
  6. Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo.

2.5 xeno intra-hepática de células tumorais via injeção no Baço

  1. Prepare o mouse conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.5 supra.
  2. Usando uma tesoura afiada estéreis, fazer um 1 cm à esquerda incisão subcostal para entrar na cavidade peritoneal.
  3. Use um aplicador com ponta de algodão para refletir o estômago cranial e para o lado direito do animal, a fim de expor o baço.
  4. Ao manipular os tecidos adiposos circundantes com uma pinça atraumática finas estéreis, entregar o baço na incisão e colocar um aplicador com ponta de algodão atrás do baço para estabilizá-lo.
  5. Usando 5-0 fio de seda, lugarum nó pré-amarrado solto em torno do baço acima do pólo inferior.
  6. Carregar a suspensão de células tumorais (preparado no passo 1.13) para uma seringa de insulina usando um 29 G 1/2 em agulha.
  7. Insira a agulha de seringa de insulina para o pólo inferior do baço e avançá-lo passado, o nível do nó pré-amarrado solto.
  8. Descarregam-se lentamente o conteúdo da seringa, retirar a agulha do baço, e apertar o nó para evitar qualquer fuga da suspensão de células de tumor injectadas.
  9. Substituir o baço para a cavidade peritoneal.
  10. Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo.

2.6 hepatectomia parcial para Facilitar intra-hepática enxerto de tecido tumoral Humano

  1. Prepare o mouse conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.7.
  2. Com uma tesoura afiada estéreis, dividir o ligamento falciforme ligado ao lóbulo médio do fígado.
  3. Usando um aplicador com ponta de algodão, mobilizaro lobo esquerdo do fígado e a posição de um nó pré-atado solta de seda de sutura 5-0 em torno do lóbulo esquerdo. Avançar o nó frouxo o mais próximo possível para o pedículo Bilio-vascular do lobo esquerdo e apertar o nó.
  4. Extirpar o lóbulo esquerdo distal à ligadura com uma tesoura estéril, deixando um pequeno toco para evitar o deslizamento do nó e hemorragia subseqüente.
  5. Utilizando uma técnica similar, ligadura e ressecar a maioria do lóbulo médio do fígado, evitando a vesícula.
  6. Use Surgicel e uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão ao longo das superfícies de corte do parênquima hepático de hemostasia completa.
  7. Para xeno intra-hepática de um fragmento de tumor ou células de tumor, prosseguir com os passos 2.3.8 a 2.3.11 ou 2.4.2 a 2.4.5, tal como descrito acima.
  8. Para xeno intra-hepática de células tumorais através da injeção do baço, utilizam aplicadores com ponta de algodão para refletir cuidadosamente o estômago cranial e para o lado direito do animal, exposing do baço. Continuar com passos 2.5.4 a 2.5.9, tal como descrito acima.
  9. Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo.

2.7 Cuidados no pós-operatório

  1. Retire o mouse a partir do bocal anestesia inalatória.
  2. Posicione o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada de calor por aproximadamente 20 min até a recuperação da anestesia e mobilizar plenamente.
  3. Repetir a dose de buprenorfina cada 8-12 horas durante os primeiros 2-3 dias pós-operatórios.

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Resultados

A Figura 3 demonstra a aparência típica de um xenoenxerto de carcinoma hepatocelular humano por via subcutânea e a aparência histopatológica correspondente do tumor. O desenvolvimento e o crescimento de xenoenxertos subcutâneos pode ser prontamente monitorizada por análise diária de ratos receptores. O intervalo de tempo entre xeno e desenvolvimento de um tumor pode variar muito, dependendo do tipo de tecido (fragmento do tumor vs suspensão de células), a fonte de tecido (amostra primária paciente, xeno...

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Discussão

Nós descrevemos uma variedade de técnicas para estabelecer subcutânea e intra xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes que pode ser aplicado a uma ampla variedade de questões experimentais e ensaios. Enquanto xenoenxertos subcutâneos têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia HCC, xenoenxertos intra raramente são descritos na literatura. Além disso, a maioria dos estudos que descrevem a utilização de xenoenxertos geraram estes a partir de linhas celular...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde Fase 1 Clínico-Scientist Award (AG) de e uma subvenção de funcionamento da Sociedade de Pesquisa do Câncer (AG). Os autores agradecem ao Dr. John Dick por seu apoio a este projeto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco’ s Mod. Eagle Medium/Ham’ s F12 50/50 Mix x1 (DMEM-F12) WISENT Bioproducts319-075-CL
Colagenase TypeIVSigma-AldrichC5138
Dispase II Stemcell Technologies7923
Matriz MatrigelBecton-Dickinson Biosciences354234
Solução de formalina tamponada a 10%Sigma-AldrichHT501128 0,9
% de solução salina Solução (NaCl), estérilMarca da casa1011-L8001
Esfoliante cirúrgico BetadinePurdue PharmaNPN 00158313
Buprenorfina (Temegesic) NR 0,3 mg/mlReckitt Benckiser
Isoflurano USP, 99,9%, anestésico inalatórioPharmaceutical Partners of Canada Inc.M60302
Tear-Gel Novartis Pharmaceuticals
Composto de seção congelada VWR95057-838
Criomolde, Tecido -Tek Sakura Finetek4566
Agulha de deslizamento de precisão 18G 1 ½ de Precisão 305196da Becton-Dickinson Biosciences
27G ½ 305109da Becton-Dickinson Biosciences
, 3/10 cc U-100, 29G½ Becton-Dickinson Biosciences309301
lâmina cirúrgica No.10Feather Safety Razor Co.08-916-5A
#5-0 Sutura cirúrgica de seda macia, agulha de ponta cônica de 3/8" SynetureVS-880
Fita cirúrgica Transpore3M Health care1577-1
Aplicador de algodão Medpro018-425
Surgicel, celulose regenerada oxidadaEthicon1951
Filtro de células 100 μ m nylonBecton-Dickinson Biosciences352360
Iluminação de ampliação com base móvelBenson medical Industries Inc.modelo: RLM-CLT-120V
Petridish estéril 100x20 mm Sarstedt821474
Pinça de tecido, 1x2 dentes, 4-1/2"AlmedicA10-302
Pinça de curativo Adson 4-3/4"AlmedicA10-220
Pinça de curativo para os olhos, serrilhada, reta, 4" AlmedicA19-560
Pinça hemostática Hartman, curva, Tesoura AlmedicA12-142
", curva, tesoura de írisAlmedicA8-690
4", reta, chave AlmedicA8-684
AlmedicA17-228 5-1/2
Agulha de Deslizamento Seringa de Insulina de íris de 3-1/2 de 4-1/ de agulha Olsen-Hegan de 4-1/2" , de"

Referências

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