Localização e quantificação relativa de nanotubos de carbono em células com citometria de fluxo de imagem multiespectral

Resumo

Neste estudo, o objetivo principal foi monitorar a captação celular e eventual exocitose de nanotubos de carbono (NTCs). Nessa perspectiva, propusemos aqui um método único usando citometria de fluxo de imagem multiespectral permitindo uma quantificação e localização de CNTs em um número estatisticamente relevante de células.

Resumo

Os nanomateriais à base de carbono, como os nanotubos de carbono (CNTs), pertencem a este tipo de nanopartículas que são muito difíceis de discriminar das estruturas celulares ricas em carbono e de facto ainda não existe um método quantitativo para avaliar a sua distribuição a nível celular e tecidual. O que propomos aqui é um método inovador que permite a detecção e quantificação de CNTs em células usando um citômetro de fluxo de imagem multiespectral (ImageStream, Amnis). Este dispositivo recém-desenvolvido integra um alto rendimento de células e imagens de alta resolução, fornecendo imagens para cada célula diretamente no fluxo e, portanto, análise de imagem estatisticamente relevante. Cada imagem celular é adquirida em canais de campo claro (BF), campo escuro (DF) e fluorescente, dando acesso respectivamente ao nível e à distribuição de absorção de luz, luz espalhada e fluorescência para cada célula. A análise consiste então em uma comparação pixel a pixel de cada imagem, das 7.000-10.000 células adquiridas para cada condição do experimento. A localização e quantificação de CNTs é possível graças a algumas propriedades intrínsecas particulares dos CNTs: forte absorção e dispersão de luz; de fato, os CNTs aparecem como manchas escuras fortemente absorvidas em BF e pontos brilhantes em DF com uma colocalização precisa.

Esta metodologia pode ter um impacto considerável nos estudos sobre as interações entre nanomateriais e células, uma vez que este protocolo é aplicável a uma vasta gama de nanomateriais, na medida em que são capazes de absorver (e/ou dispersar) a luz com força suficiente.

Introdução

Durante as últimas décadas, o lugar das nanopartículas ganhou importância em uma ampla gama de aplicações. Em particular, os nanotubos de carbono (CNTs) são cada vez mais explorados como nanoferramentas para diversas aplicações diagnósticas e terapêuticas; graças às suas propriedades elétricas, térmicas e espectroscópicas particulares, os CNTs podem atuar como veículos de entrega para vários medicamentos ou agentes de contraste, ou também podem estar envolvidos na engenharia de tecidos¹.

No entanto, as preocupações sobre a toxicidade potencial de tais nanomateriais ainda estão em debate, principalmente porque o destino dos CNTs no organismo permanece muito controverso. De fato, faltam métodos apropriados para detectá-los e quantificá-los em células e tecidos vivos: por exemplo, técnicas como espectroscopia Raman, fotoacústica e fotoluminescência de infravermelho próximo têm sido sugeridas, mas cada método apresenta limitações dependendo do tipo de nanotubos e/ou de seu ambiente^2-8.

Aqui, o método proposto pode ser aplicável para a detecção e quantificação de nanopartículas em células. Isso foi possível graças ao uso do ImageStream, um dispositivo que combina citometria de fluxo e imagens de alta resolução. Ele combina as vantagens de adquirir uma grande quantidade de células (até 5000 eventos/seg) - e os benefícios de dados estatísticos e imagens de alta resolução de cada célula ao mesmo tempo (resolução espacial de 0,5 μm). Geralmente, as imagens são coletadas usando uma câmera CCD e são uma representação bidimensional em escala de cinza da célula. A luz é quantificada para cada pixel na imagem e identifica tanto a intensidade quanto a localização da fluorescência ou de componentes com tamanho subcelular (em BF, por exemplo), permitindo assim uma poderosa capacidade de discriminar células com base em sua aparência^9,10.

O objetivo era projetar um método de nanometrologia que permitisse uma avaliação quantitativa da distribuição e comportamento dos NTCs nas células. Em particular, este método foi desenvolvido para estudar a captação celular, processamento e exocitose de NTCs pelas células. Evidenciamos, em primeiro lugar, o complexo tráfego celular de NTCs e, em segundo lugar, a transferência desses nanomateriais entre células: NTCs internalizadas por células escapam de suas células hospedeiras quando estressadas, espalham-se no espaço extracelular e são reinternalizadas por células virgens, sejam elas homotípicas ou heterotípicas¹¹

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Estudo anterior mostrou que diferentes mecanismos de captação celular, ativos ou passivos, podem ocorrer dependendo da funcionalização da NTC e do estado de agregação¹². Aqui, os CNTs de paredes múltiplas foram funcionalizados por meio de cicloadição e amidação de 1,3-dipolar e, em seguida, derivatizados com uma sonda fluorescente, fluorescente em isotiocianato (FITC). Na microscopia eletrônica de transmissão, eles parecem ser internalizados pelas células individualmente com localização citosólica ou como feixes, encontrados principalmente nos compartimentos endossômicos e lisossômicos¹¹. No ImageStream, os CNTs agrupados aparecem com uma alta correlação como manchas escuras no BF e pontos brilhantes no DF, permitindo uma distinção clara entre células marcadas com CNT e células de controle. Por outro lado, a distribuição do sinal fluorescente emitido pelo marcador fluorescente funcionalizado com CNTs não foi tão bem colocalizada: de fato, provavelmente devido a um fenômeno de extinção, as manchas fluorescentes verdes não correspondem necessariamente às manchas em BF e DF. Isso indica que, em primeiro lugar, uma sonda fluorescente não é obrigatória para a detecção de CNTs com o ImageStream e, em segundo lugar - a fortiori - que não é totalmente representativa tanto para quantificação quanto para localização de CNTs.

Além de fornecer uma quantificação relativa estatística de nanopartículas, este método também fornece informações sobre a localização de CNTs em células, o que significa que discrimina, por exemplo, CNTs no interior da célula versus aqueles que estão ligados à membrana plasmática. A capacidade de localizar CNTs em imagens celulares supera claramente a limitação da análise convencional de citometria de fluxo¹³. O procedimento foi desenvolvido aqui por meio da criação de máscaras ajustadas a regiões específicas da célula e selecionando também os pontos escuros correspondentes aos CNTs carregados.

De um modo geral, este método pode ser aplicado para uma ampla gama de experimentos envolvendo a necessidade de visualização ou quantificação em células, desde que as nanopartículas usadas sejam capazes de absorver fortemente (e/ou espalhar) a luz.

Protocolo

1. Preparação de Nanotubos de Carbono Dispersíveis em Água (CNTs)

1. Dispersar os primeiros NTC em água de cultura de células, antes de os sonicar durante 20 minutos num sonicador de água de banho a 20 °C. Se os CNTs forem funcionalizados com uma sonda fluorescente, proteja-os o máximo possível da luz durante todo o experimento.

2. Rotulando células com CNTs

1. Cultivar células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) (por exemplo) em placas de 25 cm² em meio DMEM, contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de estreptomicina de penicilina.
2. Preparar soluções de NTC nas concentrações de 0, 10, 20 e 50 μg/ml em meio completo e incubar células a 37 °C durante 20 horas ou a 4 °C durante 20 horas (2 ml de suspensão de NTC para uma placa de 25 cm²).

3. Fixação Celular

1. Remova o meio de incubação depois; lave as células com PBS, tripsinize e ressuspenda as células em meio DMEM completo. Centrifugue por 5 min a 1.200 rpm.
2. Substitua o meio primeiro por paraformaldeído a 4% por 1 hora a 4 ° C e, em seguida, por PBS para preservá-los. Se necessário, as células podem ser armazenadas nesta fase do processo a 4 °C durante vários dias até à análise citométrica.
3. Cada amostra deve conter cerca de 10⁶ células concentradas em 50 μl de PBS. Suspenda-os corretamente para evitar agregados durante a análise e filtre-os através de um corante de malha de 50 μm.
   Nota: Cada etapa deve ser executada com muito cuidado para preservar as células.

4. Aquisição do ImageStream

Use o citômetro de fluxo de imagem multiespectral ImageStream para adquirir imagens de células.
Alguns pontos devem ser respeitados:

1. Selecione uma ampliação adaptada (aqui uma objetiva de 40X é usada).
2. Se forem usados fluorocromos:
   - preparar uma amostra de controle sem fluorocromo.
   - Prepare as células com um controle positivo de cor única para cada fluorocromo usado em
   adição às suas amostras.
3. Use o laser 488 nm para excitar o FITC e o canal 02 para coletar a emissão de fluorescência (passa-banda 480-560 nm). Além disso, use também os canais 01 e 06 para o campo claro (BF) e campo escuro (DF), respectivamente.

5. Pós-processamento - Software de análise IDEAS (versão 4.0)

1. Entre todos os eventos adquiridos, a análise deve ser restrita primeiro à população de células individuais: use um gráfico de pontos biparamétrico representando 'proporção' (ou seja, largura/altura) versus 'área da célula' (parâmetros aplicados em células em BF) (Figura 1). As células individuais incluídas na região de interesse com uma área padrão e proporção próxima a 1 são então discriminadas de eventos multicelulares (grande área e pequena proporção) e detritos (área extremamente pequena).
2. Para selecionar células no plano focado, use um gráfico de pontos biparamétrico adaptado para células marcadas com CNTs altamente contrastadas: plote o 'contraste' versus o 'gradiente RMS' (que mede a qualidade da nitidez de uma imagem) na imagem BF - permite a exclusão de células desfocadas mostrando um gradiente rms baixo e um baixo contraste em suas imagens BF (Figura 1).
3. 1. Determine o parâmetro que fornece a melhor separação estatística entre células rotuladas e não rotuladas usando o "encontre o melhor recurso". Em nosso estudo, a característica média do objeto de pixel é o parâmetro mais adequado (Figura 2).
   2. Trace um histograma usando este parâmetro versus a frequência normalizada para comparar a quantidade de CNTs captados para concentrações testadas (Figura 3).
   3. Traçar o gráfico biparamétrico 'objeto médio de pixel em BF' (Notação: Pixel_Object médio (M01,Ch01,Tight)_Ch01) versus 'intensidade em DF'(Intensity_MC_Ch06), a fim de estudar a correlação entre esses dois parâmetros (Figura 4).
4. A quantificação também é avaliada por meio de máscaras:
   1. Como os NTCs aparecem como manchas escuras fortemente absorventes no BF, crie primeiro uma máscara de limiar que se ajuste a eles com precisão, selecionando uma faixa restrita de pixels com baixa intensidade compreendida entre 0-533 neste estudo (Máscara 1, notação: Intensidade (M01, BF, 0-533)) (Figura 5). A escolha da intensidade do limiar é feita nas células marcadas em comparação com as células de controle.
   2. Por outro lado, crie também um ajuste de máscara com os pixels de alta intensidade (150-4095 neste caso) do DF (Máscara 2, notação: Intensidade (M06, DF, 150-4095)) (Figura 6).
   3. Plote um gráfico usando a área da máscara (1 ou 2; (notação: Area_Intensity(M01, BF, 0-533)para máscara 1): fornecerá uma quantificação relativa da internalização de NTCs em diferentes concentrações (Figura 7).
   4. Verifique o grau de correlação entre essas duas máscaras (graças ao gráfico biparamétrico 'área da Máscara 1' versus 'área da Máscara 2') (Figura 7).
5. Crie outras máscaras para localizar CNTs em células:
   1. Uma máscara que se ajusta ao interior da célula: Erodir(M01, 7) - correspondendo à máscara de toda a célula (M01) (Figura 8), que é ainda mais erodida de 7 pixels (Figura 9).
   2. Uma máscara que se ajusta à membrana apenas usando a equação booleana: M01 e não Erode(M01,7) - máscara de toda a célula (M01) subtraída do interior (Erode(M01,7)) (Figura 10).
   3. Para considerar os pixels escuros na membrana (correspondentes aos CNTs), crie então a máscara: Intensidade (M01 e não Erosão (M01, 7), BF, 0-533) (Figura 11).
   4. Visualize as diferentes máscaras aplicadas em uma coleção de células para verificar sua relevância (Figura 12) para células rotuladas e não rotuladas.
   5. Aplique a área de recurso na máscara selecionando os pixels pretos na membrana 'Area_Intensidade (M01 e não Erodir (M01, 7), BF, 0-533)' chamada área preta. Permitirá a quantificação dos NTCs na membrana.
      
      Para discriminar finalmente os CNTs que foram internalizados daqueles adsorvidos apenas na membrana, plote a área preta na membrana versus a área preta em toda a célula (ou seja, 'Intensidade Area_ (M01 e não Erosão (M01, 7), BF, 0-533' versus 'Intensidade Area_ (M01, BF, 0-533)').
      
      nota: O mesmo tipo de procedimento é aplicado com o sinal fluorescente FITC: compare o aumento da intensidade da fluorescência FITC versus a diminuição do sinal médio de pixel no BF, ou a colocalização entre manchas escuras no BF e a intensidade de fluorescência FITC. Em nosso caso, esse tipo de análise não é relevante porque o sinal de fluorescência não coincide corretamente com manchas escuras em BF, por um lado, e com campo claro em DF, por outro, mostrando que as propriedades intrínsecas dos CNTs (absorbância e espalhamento de luz) são mais apropriadas do que o sinal relacionado à sonda de fluorescência.
6. Depois que todos os gráficos forem criados em uma condição experimental, crie um "modelo de relatório estatístico", salve o modelo como arquivo .ast e agrupe todos os arquivos de dados.

Resultados

Uma visão geral do princípio do dispositivo ImageStream é fornecida na Figura 1. Ele produz várias imagens de alta resolução de cada célula em fluxo, incluindo campo claro (BF), campo escuro (DF ou luz espalhada lateralmente) e canal (s) de fluorescência, como exemplificado na Figura 2 com três células diferentes marcadas com CNTs. As sobreposições desses canais também são mostradas, à primeira vista ilustrando a correlação.

Dado que toda a análise de pós-processamento é baseada em imagens celulares, a seleção de células focalizadas é crucial para o estudo (Figura 3). Na verdade, a presença de NTCs induz mudanças tanto no contraste quanto no gradiente em comparação com células não marcadas: células focadas, tendo internalizado uma quantidade importante de NTCs, tendem a ter um baixo gradiente rms (que geralmente é o parâmetro único usado para a discriminação de células focadas versus não focadas), mas também um contraste importante, explicando por que um gráfico biparamétrico é essencial. Na Figura 3 é mostrada a discriminação entre células desfocadas (área amarela) versus focadas (área azul).

Os CNTs internalizados por células são claramente distinguíveis - particularmente no BF que aparece como manchas escuras fortemente absorventes (veja o efeito da concentração de marcação diversa, Figura 4). Além disso, o sinal médio de pixel no BF foi analisado, fornecendo uma quantificação relativa da captação: os gráficos na Figura 5 mostram seu aumento significativo com a concentração de marcação CNT (resultados para cerca de 7.000 células por condição experimental).

Em segundo lugar, a quantificação de NTCs também é possível por meio do uso de máscaras, aplicadas em uma faixa restrita de pixels escuros do BF ou no pixel de alta intensidade do DF (ver exemplos na Figura 6), correspondendo às manchas resultantes da presença de CNTs. Assim, plotar a área dessas máscaras permite o realce e o aumento da captação (exemplificado na Figura 7 com a área da máscara em BF, selecionando pixels que variam de 0 a 533).

Além disso, a correlação entre manchas no BF e no FD pode ser avaliada plotando a intensidade do DF versus o sinal médio de pixel do BF (como na Figura 8) (análise independente da máscara) ou a área da máscara no BF (Máscara 1) versus a área no DF (Máscara 2).

Em relação ao procedimento criado para a localização de CNTs dentro das células, a Figura 9A exibe as diferentes máscaras que foram criadas. Observe que a robustez das máscaras de localização (com base na erosão da máscara de célula padrão) deve ser verificada visualmente em uma coleção de células rotuladas e não rotuladas. As mesmas máscaras são usadas para todas as amostras.

Traçar a área total de manchas pretas na membrana celular versus a de toda a célula fornece uma pontuação de internalização para células que foram incubadas por 20 horas a 37 °C em comparação com 2 horas de incubação a 4 °C (ver Figura 9B); indica que os NTCs estão localizados principalmente na membrana a 4 °C, enquanto a 37 °C os NTCs são internalizados em mais de 90% das células.

Finalmente, em relação à fluorescência, este parâmetro não foi utilizado como indicador para a quantificação de NTCs devido a uma correlação muito baixa entre manchas fluorescentes e manchas em BF (e DF). De fato, a correlação entre a intensidade do FITC e o pixel médio do campo claro indica um coeficiente de correlação de Pearson de -0,2. Na Figura 10, são ilustrados dois casos, nos quais o sinal de fluorescência coincide adequadamente ou não com a mancha preta de campo claro.

Figura 1. Visão geral do ImageStream - operação geral. O sistema de imagem multiespectral adquire até 12 imagens/célula em três modos diferentes: campo claro, campo escuro e fluorescência. A configuração consiste em 5 lasers de excitação, incluindo 405, 488, 560 e 658 nm. A luz é coletada das células que fluem na cubeta com diferentes lentes objetivas (neste estudo, a lente objetiva 40X foi usada) e retransmitida para o elemento de decomposição espectral, que consiste em um conjunto de filtros passa-longo em uma matriz angular. A câmera CCD que coleta imagens de células é operada usando uma técnica chamada integração de atraso de tempo para evitar listras de imagem. A profundidade de campo estendida (EDF) é uma opção.

Figura 2. Galeria de imagens de células marcadas com nanotubos de carbono (50 μg/mL) capturadas pelo ImageStream através de diversos canais (Bright Field (BF), Dark field (DF), fluorescência (FITC) e suas sobreposições). Os NTCs confinados dentro dos lisossomos intracelulares aparecem como grandes manchas pretas em imagens de campo claro. Por outro lado, eles criam pontos brilhantes no campo escuro e nas imagens de fluorescência.

Figura 3. Seleção de células em foco. O gráfico de pontos bivariados que representa o gradiente quadrático médio (rms) versus contraste em imagens BF permite a exclusão de células desfocadas. Aqui, a área amarela representa células desfocadas, enquanto as células focadas são representadas em azul. As células desfocadas são caracterizadas por baixo contraste e baixo gradiente rms na imagem de campo claro. Além do gradiente rms, o recurso de contraste é necessário para discriminar células focadas após sua rotulagem com CNTs.

Figura 4. Captação dose-dependente de CNTs visualizada pelo ImageStream. O número e a área de manchas pretas nas imagens de campo claro estão aumentando com a dose de CNTs durante a incubação com células (variando de 0-50 μg / ml). Observe que as células de controle são desprovidas de manchas pretas.

Figura 5. Quantificação relativa da captação de CNT com base nas imagens de campo claro. Os histogramas do recurso de pixel médio aplicado ao "objeto" da máscara com toda a célula mostram claramente um comportamento dependente da dose, que pode ser usado para quantificação. A faixa R9 inclui as células positivas para CNT.

Figura 6. Criação de máscaras selecionando pontos pretos em BF e pontos brilhantes em imagens DF. Como os CNTs aparecem como manchas escuras fortemente absorventes na imagem BF, uma máscara de limiar é criada para selecionar uma faixa restrita de pixels com baixa intensidade compreendida entre 0-533 neste estudo (Máscara 1, notação: Intensidade (M01, BF, 0-533)). Por outro lado, uma máscara ajustada com os pixels de alta intensidade (150-4095 neste caso) na imagem DF (Máscara 2, notação: Intensidade (M06, DF, 150-4095)) é usada para selecionar o ponto brilhante em DF, correspondendo a áreas de alto espalhamento.

Figura 7. A captação dose-dependente de CNTs é demonstrada pela quantificação da área da mancha preta nas imagens BF. Usando a máscara de limiar (máscara 1) aplicada no BF, a área de manchas pretas pode ser quantificada para cada célula, mostrando uma distribuição dependente da dose.

Figura 8. Os métodos de quantificação de CNT baseados em imagens BF (absorção) e DF (espalhamento) estão correlacionados. À esquerda, o pixel médio na imagem BF versus a intensidade na imagem DF mostra uma boa correlação para células marcadas com NTCs (50 μg/ml) (coeficiente de correlação de Pearson r = -0,68). À direita, área da máscara que ajusta pontos escuros em BF versus área da máscara que ajusta pontos brilhantes em DF para células marcadas com CNTs (50 μg/ml). O coeficiente de correlação de Pearson é r = -0,83.Os valores de 7.000 células são plotados.

Figura 9. Localização de CNT em células usando máscaras específicas. (A) As máscaras são criadas para se ajustarem a um local específico da célula, ou seja, da esquerda para a direita - a célula inteira, apenas a membrana e o interior da célula. Outra máscara se encaixa em pontos pretos graças a uma intensidade limite (Máscara 1, notação: Intensidade (M01, BF, 0-533))). (B) A avaliação da localização dos NTCs pode ser obtida medindo a área de manchas pretas em diferentes localizações das células usando as máscaras de localização descritas em A. A incubação com NTCs (50 μg / ml) foi realizada a 37 ° C e a 4 ° C para inibir a via de internalização. O gráfico que representa a área preta na membrana versus a área preta em toda a célula mostra uma absorção dependente da dose de CNTs na membrana a 4 ° C, enquanto a internalização completa de CNTs é eficaz a 37 ° C.

Figura 10. Colocalização de pontos pretos induzidos por CNT em BF com pontos brilhantes de fluorescência na imagem FITC. Os pontos brilhantes de fluorescência nem sempre são co-localizados com os pontos pretos no BF. Eles correspondem corretamente para as duas primeiras células exibidas, mas não para as duas últimas células.

Discussão

1. Modificação e solução de problemas

Neste estudo, o primeiro objetivo foi avaliar a quantidade e a localização dos NTCs nas células. A microscopia confocal poderia ter sido a priori o método ouro para avaliar a distribuição intracelular dos NTCs funcionalizados com o marcador fluorescente FITC^8,14. No entanto, a principal desvantagem é a limitação à imagem de célula única e, portanto, a falta de dados estatisticamente relevantes. O ImageStream permite trabalhar além desses obstáculos: de fato, ao rastrear um grande número de células (5.000-10.000) em um curto espaço de tempo (

Em comparação com a citometria de fluxo convencional, a vantagem exclusiva do ImageStream é fornecer imagens multiespectrais de cada célula e uma comparação pixel a pixel da intensidade do sinal. Assim, o ImageStream combina o poder estatístico da citometria de fluxo de alto rendimento com as vantagens analíticas da imagem confocal para cada célula analisada. É crucial para uma quantificação relativa sem marcação e localização de CNTs nas células.

2. Etapas críticas dentro do protocolo

A etapa crítica consiste na escolha dos parâmetros mais adequados de cada estudo. No nosso caso, a melhor maneira foi basear a análise nas propriedades de absorção e espalhamento dos nanotubos: a boa correlação entre a localização de manchas escuras no BF e manchas brilhantes no DF sustenta que o método desenvolvido é relevante e confiável - e pode não ter sido possível sem imagens celulares.

3. Limitações da técnica

Deve-se enfatizar que a visualização de NTCs nas células só foi possível porque elas tendem a se acumular em vesículas intracelulares endossômicas e, em seguida, aparecem como fortes pontos de absorção e dispersão. Nanotubos individuais não devem ser detectados com base neste método, enquanto podem ser eventualmente detectados em fluorescência, o que constitui uma clara limitação. Em segundo lugar, a quantificação não é 'absoluta', mas relativa para diferentes concentrações de marcação e em comparação com as células de controle não marcadas. Algumas características quantitativas (pixel médio, intensidade, etc.) são parâmetros absolutos, enquanto outras dependem da escolha das máscaras (máscara de limiar, máscaras de localização).

4. Significado em relação aos métodos existentes

Em relação à fluorescência, a análise do ImageStream destaca a má colocalização dos aglomerados CNT entre o sinal brilhante FITC e os pontos nos outros canais. Portanto, parece que a fluorescência não era um indicador confiável para a quantificação e localização de CNTs. No entanto, superando a limitação da citometria de fluxo convencional, que se baseia principalmente na quantificação de fluorescência, o ImageStream multiespectral de alto rendimento abre caminho para uma quantificação estatística sem rótulos , ao mesmo tempo em que fornece localização de nanotubos de carbono dentro das células.

5. Aplicações futuras

Este método de nanometrologia estatística de alto rendimento pode ser generalizado para qualquer nanomaterial, que mostre alta absorção e dispersão de luz ao interagir com as células. Portanto, pode ter aplicações importantes para investigações da nano-bio-interface, nanotoxicologia e nanomedicina.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ImageStream	Amnis