As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

Summary

Descreve-se a preparação de três amostras de teste e de como eles podem ser utilizados para optimizar e avaliar o desempenho dos microscópios tempestade. Usando esses exemplos que mostram como a aquisição de dados brutos e, em seguida, processá-lo para adquirir imagens de super-resolução em células de aproximadamente 30-50 nm resolução.

Abstract

STORM é uma técnica de microscopia de super-resolução recentemente desenvolvido com até 10 vezes melhor resolução do que as técnicas de microscopia de fluorescência padrão. No entanto, como a imagem é adquirida de uma forma muito diferente do que o normal, através da construção de uma molécula molécula-por-imagem, existem alguns desafios significativos para os usuários na tentativa de otimizar a sua aquisição de imagem. Para auxiliar neste processo e ganhar mais conhecimento sobre como funciona STORM apresentamos a preparação de três amostras de teste ea metodologia de aquisição e processamento de imagens STORM super-resolução com resoluções típicas de entre 30-50 nm. Através da combinação das amostras de ensaio com o uso de software de processamento de RainStorm livremente disponível, é possível obter uma grande quantidade de informação sobre a qualidade e resolução de imagem. Usando essas métricas então é possível otimizar o procedimento de imagem a partir da ótica, da preparação da amostra, a escolha da tintura, condições de tampão, e as configurações de aquisição de imagem. Temos ummostram exemplos lso de alguns problemas comuns que resultam em má qualidade de imagem, tais como desvio lateral, onde a amostra move-se durante a aquisição da imagem ea densidade relacionada problemas resultantes do fenômeno 'mislocalization'.

Introduction

Recentemente, uma série de técnicas de microscopia óptica foram desenvolvidos, normalmente referido como microscopia de super-resolução ou Nanoscopia, que pode ultrapassar o limite de difração e gerar imagens com resoluções de 100 nm ou melhor ^1,2. Desde o anúncio da microscopia de super-resolução como sendo o método Nature Methods do ano em 2008, houve um grande desenvolvimento de microscópios com base em localização. Por exemplo, existem aplicações multi-cor ^{3-6, 7-12} implementações 3D e aplicativos de celulares ainda vivos ^5,13-17. Além disso, como esses sistemas estão sendo comercializados e agora estão fazendo o seu caminho para fora dos laboratórios de ótica nas mãos dos biólogos não é provável que seja um aumento no seu uso e aplicação de questões biomédicas.

Um ramo desta família são os métodos baseados em localização, que funcionam através da construção de uma molécula molécula-por-imagem. Euara fazer isso, a maioria das moléculas fluorescentes dentro da amostra deve ser desligada para que apenas algumas moléculas espacialmente separados são ativos a qualquer momento. Estas moléculas são então rapidamente ligado e desligado e muitas imagens são tomadas de modo que uma parte significativa da população é fotografada para refletir a estrutura subjacente com precisão sub-difração. Várias abordagens têm sido publicados incluindo GSDIM ^18, PALM ^19, fPALM ^{20, 21} e STORM RESOLFT ^22. Algoritmos que medem a posição de uma única molécula de detecção pode então ser usada para localizar a posição real da molécula com precisões melhores do que 20 nm, por meio de montagem Gaussian ^23, por exemplo rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^{26, 12} e palm3d RainStorm ^27. Quando imagens de células ou de outras amostras biológicas, que têm uma elevada densidade de molécula, por isso, é necessário ter em muitos milhares de quadros deesta piscando, espacialmente separados, a fim de sinalizar uma imagem de parte significativa das moléculas marcadas.

A microscopia óptica estocástica reconstrução (Storm) e a dSTORM altamente relacionados e métodos GSDIM são métodos de super-resolução à base de localização, que se demonstrou funcionar com corantes orgânicos comercialmente disponíveis ^21. Eles têm sido desde demonstrou ser aplicável a um número de diferentes corantes ^28-30, o que torna o método particularmente atraentes devido à especificidade e conveniência relativa de imunomarcação abordagens bem estabelecidas para a realização de microscopia de fluorescência. Consequentemente, não há acesso fácil a uma variedade de conjugados de anticorpos e de corantes de tintura-biomolécula, que têm o potencial para ser usado em super-resolução de imagem baseados em localização. Embora os princípios gerais da tempestade e abordagens semelhantes são relativamente simples, e à primeira vista a preparação do hardware e amostra parecem relativamente straightforward, há uma série de etapas no processo que são essenciais para a obtenção de alta qualidade, livre de artefatos, imagens de super-resolução.

Tal como acontece com todas as técnicas de microscopia o processo pode ser considerado em três etapas principais: em primeiro lugar, a preparação da amostra, em segundo lugar, a aquisição de imagem e, em terceiro lugar, o processamento de imagem e / ou a análise e a interpretação da imagem. O poder de resolução adicional e método de geração de imagens de super-resolução usando uma abordagem baseada em localização introduz alguns novos problemas e considerações ^31-33. Começando com a preparação da amostra, quando se realiza imunomarcação, particularmente de imunofluorescência indirecta em que a combinação do anticorpo primário e secundário é utilizado, deve-se notar que o corante fluorescente pode ser de até 20 nm de distância a partir da molécula de interesse. No caso dos microtúbulos, o que resulta em diâmetros de 35-50 nm em comparação com um diâmetro de microtúbulos esperado de 25 nm ^{de 28,30.} Além disso, a densidade de rotulagem deve meet os critérios de Nyquist, a fim de gerar uma imagem de alta qualidade ^14. Por exemplo, para uma resolução de imagem prevista de 20 nm, ao longo de uma estrutura filamentosa deve haver uma molécula de corante, pelo menos a cada 10 nm ^27. Enquanto muitos corantes têm sido publicados a trabalhar para sistemas baseados em localização se aproxima do desempenho geral do corante é uma mistura de pelo menos quatro critérios importantes, nomeadamente fótons detectados por comutação evento (o brilho de cada piscar - mais brilhante, melhor), o equilíbrio em -off ciclo de trabalho (a taxa de contraste de corantes no off contra no estado - mais fora geralmente é melhor), a fração de sobrevivência (a taxa de branqueamento de baixo é melhor) eo número de ciclos de comutação (o número de piscadas por fluoróforo - mais é melhor em alta resolução, embora uma intermitência por fluoróforo pode ser uma vantagem para fins de contagem da molécula). A situação é ainda mais complicada pelo facto de estas propriedades para qualquer dada corante pode variar em diferentes condições do tampão ecom potência ^28,29 laser. Além disso, assim como estas considerações TEMPESTADE únicas, a qualidade da imagem pode ser melhorada através da optimização de preparação de amostras da mesma maneira como as técnicas mais tradicionais de microscopia de fluorescência, por exemplo, minimizando a autofluorescência por alteração das condições de fixação e a utilização de reagentes de extinção. Além disso, minimizando fluoróforos não ligados especificamente é importante, o que pode ser feito ajustando as concentrações de etiqueta, os tempos de incubação e de bloqueio e de lavagem.

A segunda etapa de aquisição de imagens também é crítico. As configurações óptimas no microscópio dependerá do corante, condições de tampão, a densidade de rotulagem, e do tipo de amostra, por exemplo, de vidro, sobre as monocamadas de células ou amostras de tecido. As principais considerações são o tempo de exposição da câmera, número de quadros, ângulo de iluminação (TIRF, Hilo, Epi) e potência do laser. O objetivo é recolher o maior número pisca separadas espacialmente brilhantes o mais rápido possível. Se o i fundos muito elevados ou a piscar não são muito brilhantes, em outras palavras, a relação de sinal-para-ruído é má, o algoritmo de reconstrução não vai ser capaz de localizar as posições mais exacta. , Bem como maximizar a precisão de localização, isto é, a precisão com a posição de cada molécula pode ser medida, a qualidade da imagem, também depende de um grande número de localizações. Se um número suficiente de moléculas de interesse são gravadas, quer devido à falta de eficiência de marcação, fotodegradação excessiva ou um número do quadro insuficiente, então a imagem de super-resolução resultante será pontuada e descontínua como critério de Nyquist não foram cumpridos ^14,27 .

E, finalmente, a terceira etapa, processamento de imagem, é particularmente importante em comparação com as técnicas de microscopia de fluorescência padrão. Há uma variedade de livre e comercialmente disponíveis algoritmos, o que é tanto uma vantagem, em termos de escolha, e uma desvantagem, na medida em que pode ser confuso para saber which é o mais apropriado para usar. Se, por exemplo, os dados em bruto foi bem espaçadas pisca espacialmente distintas, em seguida, um algoritmo de ajuste de molécula única pode ser de alta precisão e eficiente, por exemplo, os algoritmos de ajuste esparsos disponíveis em chuvada ^27, rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² e ²⁶ QuickPALM software . Se os dados em bruto contém uma grande quantidade de sobreposição de sinais, em seguida, os algoritmos que podem ser mais apropriado incluir DAOSTORM ^{34, 35} e 3B deconSTORM ^36. Além disso, esses algoritmos contêm limites para vários critérios, tais como a contagem de sinal, ou fótons por piscar, bem como várias opções diferentes de visualização de imagens, tais como a visualização com funções de Gauss suavização ou como histogramas com grades de pixels, onde o tamanho do pixel super-resolução pode ser seleccionado pelo utilizador. Todas estas opções alterar a aparência da imagem final e ter implicações para a interpretação e análise de imagem.

Por isso, apresentamos três amostras de teste, que irá fornecer o novo usuário com um ponto de partida para experiências à base de corantes à base de localização de super-resolução, que por uma questão de clareza, vamos referem como tempestade, e os usuários mais experientes a oportunidade de otimizar ainda mais seus experimentos. Em primeiro lugar, é possível revestir a superfície de vidro com uma camada fluorescente de conjugado de dextrano-corante. Isso fornece uma maneira rápida e simples para estabelecer que o microscópio, corante e tampão estão trabalhando para gerar piscando sinal fluorescente. O método pode ser estendido por meio da comparação de precisão de localização e número de métricas médios gerados pela tempestade de otimizar as condições de buffer, configurações de aquisição de imagem e testar diferentes corantes. Em segundo lugar, apresentamos um protocolo simples para a preparação de filamentos de actina em vidro que pode ser facilmente rotulados com conjugados phalloidin-dye. Estes fornecem estruturas ideais para tomar medidas de resolução ²⁷ e normalmente a metade de largura máxima cheia (FWHM)de um filamento é dada como uma estimativa empírica da resolução ^37. Deve notar-se que a resolução varia entre as amostras e entre as imagens dentro da mesma amostra por resolução em microscopia de super-resolução à base de localização é uma função do brilho fluoróforo, o ruído de fundo e a densidade de localização ²⁷ e estes não são necessariamente constantes ao longo do espécime. Filamentos de actina são usados ​​para demonstrar artefatos potenciais, como mislocalizations e deriva e como eles podem ser identificados com recursos de software dentro de tempestade. Além disso, descreve-se o uso de marcadores fiduciais fluorescentes para ambos medida e deriva correcta. E em terceiro lugar, a coloração das células com o factor de crescimento epidérmico (EGF), os conjugados de corante é descrito. EGF oferece um útil indicador de desempenho de imagem super-resolução, pois uma parte do receptor na superfície da célula sofre endocitose via vesículas, que são sub-difração de estruturas de tamanho de aproximadamente 50-150 nm de diâmetro ^27,38,39.

Protocol

Nota: Ao longo deste protocolo, dicas e sugestões são encontradas seguindo determinadas etapas. A notação "* 1" indica que a nota 1 é relevante para este passo específico, e assim por diante.

1. Fluorescente Dextran Revestimento de Vidro

1. Adicionar 200 mL de L-lisina de poli solução 0,01% a cada poço de uma lamela 8-câmara e incuba-se durante 10 min. Retire com uma pipeta para garantir que não é líquido restante.
2. Reconstituir dextrano-Alexa 647 ^{* 1} de acordo com as instruções do fabricante para criar uma solução de 2 mg / ml. A partir deste, diluir 0,25 ul em 25 ul de água desionizada para criar uma solução de 20 ug / ml.
3. Para criar um revestimento de alta densidade de dextrano-Alexa 647 solução diluída 20 ul da solução de 20 ng / ml dentro de um total de 200 mL de água desionizada. Para uma solução de média densidade diluir 2 ul em 200 mL de água desionizada (diluição de 1:10.000 a partir da solução em bruto). Por um baixosolução densidade diluir 0,2 mL em 200 mL de água deionizada (1:100.000 diluição da solução estoque original).
4. Adicionar 200 ul dos diluídos dextrano-Alexa 647 soluções a cada poço e incubar durante 10 min. Tempos de incubação mais longos podem ser utilizados, que podem resultar em uma camada de dextrano mais denso. Remover e lavar com _H2O, três vezes ^{* 2}

Nota 1: Outros conjugados de corante-dextrano pode ser utilizado. Dextrano não conjugado também pode ser conjugado com corantes se combinações desejadas não se encontram disponíveis comercialmente.

Nota 2: As mesmas câmaras de dextrano pode ser recriada ao longo de um período de semanas, embora a uniformidade da fluorescência pode diminuir. O armazenamento a 4 ° C, na ausência de qualquer tampão é recomendado.

2. Fluorescente filamentos de actina em Vidro

1. Adicionar 200 mL de L-lisina de poli solução 0,01% a cada poço da câmara, e incubar durante 10 min ^{* 3.} Remover-se com uma pipeta, para garantir que o líquido não é remanescente.
2. Adicionar 90 ul de tampão de actina geral (reconstituídos de acordo com as instruções do fabricante) para cada câmara. Adicionar 10 ml de 10 uM preformados solução filamentos de actina e 1 ul faloidina-Alexa 647 (0,2 unidades, quando dissolvido em 1,5 ml de metanol, conforme as instruções do fabricante) e suavemente pipetar para cima e para baixo para misturar. Incubar por 30 minutos ^{* 4.}

Nota 3: O aumento do volume da solução de filamentos dentro dos resultados da câmara de menos filamentos que se ligam ao vidro revestidas com poli-L-lisina.

Nota 4: Os tempos de incubação de até 48 horas a 4 ° C foram testados com bons resultados. Qualidade de imagem deteriora-se filamentos de actina, uma vez uma câmara tiver sido exposto a tampão de interrupção, por isso, não é recomendado utilizar a mesma amostra para mais do que um dia.

3. Microesferas fluorescentes Beads como Fiducial Marcadores

1. Diluir 1 ml de pérolas de TetraSpeck em 200 ul de PBS e misturar.
2. Adicione as contas diluídas em uma câmara de imagem e esperar por 15 minutos ^{* 5.} Remover a solução e lava-se 3 vezes com PBS antes da imagiologia.

Nota 5 - o tempo de incubação e de diluição pode ser ajustada para se obter diferentes densidades dos grânulos. Este protocolo normalmente resulta em entre 3-10 contas por 20,5 mM x 20,5 mM campo de visão.

4. Fator de Crescimento Epidérmico coloração celular

1. Cultura de células HeLa em câmaras de imagem para cerca de 80% de confluência em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina a 1%.
2. Remover o meio de cultura e lava-se com PBS. Em seguida adicionar 500 ml de solução de formaldeído a 4% (solução de formaldeído a 4 ml de 10%, 1 ml de PBS 10X, 5 ml de água) durante 10 min. Remover o formaldeído e lava-se 3 vezes com PBS. Não permita que as células permaneçam dry e use sempre PBS tamponado soluções para evitar o estresse hipotônico.

ATENÇÃO - formaldeído é extremamente tóxico. Certifique-se de que as luvas apropriadas, proteção para os olhos e jalecos são usados. Verifique as diretrizes locais para a eliminação de formaldeído.

3. Reconstituir o EGF-Alexa 647 de acordo com as instruções do fabricante para criar uma solução de estoque de 50 mg / ml. Adicionar 2 mL de desta solução de reserva a 200 ml de solução de BSA a 0,1% (em PBS). Remover o PBS a partir das células, adicionar a solução de EGF e incuba-se durante 30 min.
4. Remova a solução e lava-se 3 vezes com PBS antes da adição de uma solução de bloqueio de BSA a 0,1% (em PBS) durante 15 min. Remover esta e lavar mais 3 vezes com PBS antes da imagem.

5. Mudando de Buffer Preparação

1. Adicione uma solução de estoque de enzima (A) com 10 ml de catalase (20 ug / ml), 20 pi de 1 M Tris cloridrato de (2-carboxyelthyl) fosfina (4 mM), 2,5 ml de glicerina (50%), 125 ulde 1 M de KCl (25 mM), 100 ul de 1 M de pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg de glicose-oxidase (1 mg / ml) e de topo até 5 ml de volume com diH20. Isto é suficiente para fazer 100 x alíquotas de 50 ul, que podem ser armazenadas a -20 ° C e utilizados para até 1 ano.
2. ) Adicione uma solução de glicose (B) com 4 g de glicose (100 mg / ml), 4 ml de glicerina (10%) e 36 ml diH20. Isto é suficiente para fazer 100 x 400 mL alíquotas, que podem ser armazenados a - 20 ° C e usadas até 1 ano.
3. Produzir uma solução stock do agente redutor (C) com 113,6 mg de MEA-HCl (1 M) e 1 ml de ₂ 0 dih. Use fresco ou fazer 10 x 100 mL alíquotas, as quais podem ser armazenadas a -20 ° C e utilizados para até 1 mês (não recongelar alíquotas).
4. Imediatamente antes da imagiologia, misturar a enzima (A), glucose (B) e as soluções de agente de redução (C) em conjunto na proporção de 50 ul, 400 ul, 100 ul e perfazer 1 ml com PBS ^{* 6.} Esse buffer será agora eliminar o oxigénio e ter um ambiente redutor (100 MEA-mMHCl) ^{* 7.} O pH final deverá estar na gama de 6,0-8,5 (ajustamento não é normalmente necessário) ^{* 8.}

Nota 6 - este tampão é adequado para utilização com os corantes à base de carbocianina, tais como Cy5 e Alexa 647.

Nota 7 - a concentração final de enzima é de 50 ng / ml (5 unidades / ml) de uma oxidase de glucose e 1 mg / ml (40-60 unidades / ml) de catalase. A atividade enzimática (unidades) é dada por fornecedores e podem variar. Os cálculos para a catalase assumir que 1 ug / ml de concentração final após a etapa 5.4 irá conter 50 unidades de enzima. Várias composições de tampão, incluindo os componentes de eliminação de oxigénio semelhantes podem ser encontrados ^21,30,40. Para um resumo das combinações de tampão e corante ver referências ^28,29. Glicerina e TCEP são necessários para o armazenamento a longo prazo a -20 ° C.

Nota 8 - se os filamentos de actina imagiologia adicionar MgCl2 ₂ mM e ATP 0,2 mM, para ajudar a estabilizar tele filamentos.

6. Microscópio Aquisição de Dados STORM (usando Alexa 647 corante)

1. Ligue o microscópio TEMPESTADE / PALM, de preferência, pelo menos, 3 horas antes de imagem para permitir um equilíbrio térmico a ser alcançado. Imagem antes disso tem uma chance maior de drift.
2. Insira a câmara de imagem no suporte de amostra do palco microscópio. Certifique-se de que a amostra é firmemente no suporte e é plana.
3. Retire a PBS da câmara de imagem e, em seguida, preencher a parte superior com o tampão de comutação. Com cuidado, coloque uma lamela sobre a parte superior da câmara, certificando-se de que não existem bolhas em tudo e que toda a câmara é coberto. Atestar com tampão adicional ou PBS, se as bolhas são vistos de outra forma tampão desempenho pode diminuir.

CUIDADO - para minimizar as possibilidades de desvio lateral e axial da amostra em relação à lente objectiva, recomenda-se que a amostra e o tampão são deixados a equilibrarà temperatura ambiente durante pelo menos 15 minutos antes da imagiologia.

4. Localize uma estrutura fluorescente de interesse a ser trabalhada. Seleccione o ângulo desejado de iluminação, neste caso, um ângulo TIRF ou altamente inclinado é recomendada pois aumenta a relação sinal-ruído através da minimização de luz fora do foco, o que é particularmente benéfico para as amostras de células. Pegue uma imagem de difração limitada de referência da estrutura antes da imagem STORM.
5. Aumentar o laser de excitação (com um comprimento de onda de excitação apropriada de cerca de 640 nm) a uma potência elevada, que corresponde a cerca de 2 kW / cm ^2, embora de imagem com as configurações da câmara de exposição de 10 ms e um tempo de ciclo de cerca de 50 Hz (frames por segundo) . Uma vez que os fluoróforos fizeram a transição para um padrão de piscar escassa (provavelmente dentro de 10 segundos para a maioria das amostras) coletar 10.000 quadros ^{* 9.}

Nota 9 - 10.000 quadros é adequado para as amostras aqui descritasmas pode ser necessário aumentar o número de quadros a 50.000 ou mais para outras amostras.

7. Reconstruindo Super-resolução de imagens a partir de dados brutos (usando tempestade)

1. Abra o ficheiro de dentro rainSTORM.m MATLAB e executar (Figura 1A).
2. Na janela de tempestade (Figura 1B), selecione o arquivo de imagem a ser analisada usando o botão Procurar. Este deve ser um arquivo. Tif (ImageJ pode ser usado para converter outros tipos de arquivos em um formato tif). Altere a largura de pixel para combinar os dados brutos do sistema de microscópio utilizado para a aquisição dos dados ^{* 10.} Deixe os outros valores para o padrão.

Nota 10 - A câmera típico EMCCD tem um tamanho de pixel de 16 mM de modo em um sistema com uma lente objetiva de 100X o tamanho do pixel na imagem será de 160 nm. Em sistemas comerciais o tamanho do pixel geralmente é exibido dentro do software. Tamanhos de pixel variar entre 100 nm e 160 nm, para a maioria dos microscópios de localização.

3. Pressione o botão "Processar Imagens 'e espere até que uma imagem preliminar aparece. A duração do tratamento dependerá do tamanho do ficheiro, especificação de computador e o número de candidatos pisca dentro dos dados brutos ^{* 11.}

Nota 11 - 10.000 seqüências de quadros de actina e dados EGF levou 23 seg e 25 seg para processar respectivamente usando um PC com um processador Intel Xeon E5420. Usando o mesmo computador sem uma caixa de ferramentas de processamento paralelo em MATLAB, ou com um computador sem múltiplas core, os tempos eram de 66 seg e 81 seg, respectivamente.

4. Para gerar uma super-resolução de imagem imprensa atualizou o botão 'Abrir Revisor' e uma segunda janela será exibida (Figura 1C). Pressione o botão "Ajustar Contraste", a fim de mudar a visualização da imagem se for o caso (Figura 1D). Em alguns casos, onde a imagem é muito escuro o valor máximo deve ser diminuído.
5. Use o reviewer janela (Figura 1C) para gerar métricas úteis qualidade de imagem e melhorar a imagem de super-resolução mais. Defina os três primeiros parâmetros de controle de qualidade a valores de 4000, 0,1 e 0,8-2,0 respectivamente ^{* 12.} Atualize as contagens por valor de fótons, que deve ser baseada em uma medida de calibração ou de fótons usando fótons curva valores das curvas de calibração especificado pelo fabricante da câmera para um ajuste de ganho particular, EM. Isso é fundamental para a obtenção de precisão exata e medidas de resolução ^{* 13.}

Nota 12 - Contagens de sinal rejeita pisca com base em critérios de brilho. Quanto maior o valor mais brilhante a piscar deve ser tornar-se aceito como uma localização na imagem final. Isto pode necessitar de ser alterada de acordo com a saída de fotões de corante e o tempo de exposição e da sensibilidade da câmara. Tolerância rejeita pisca se houver erro quadrado significativa entre o sinal eo equipada Gaussian ou seja, dpicos ouble. PSF Sigma Faixa rejeita pisca se a largura de ajuste do PSF encontra-se fora deste intervalo, ou seja, uma faixa mais estreita pode ser usado para rejeitar fora de foco sinais e grandes manchas agregadas de fluorescência constante. Usando uma gama mais ampla pode resultar em artefactos mislocalization aparecem na imagem final. Na prática, recomenda-se realizar o controle de qualidade inicial usando o parâmetro de corte de precisão de localização.

Nota 13 - para saber mais sobre as métricas de resolução de ver referências ^23,27. Em resumo, conhecendo o número de fótons produzidos por cada piscar, é possível calcular a precisão de localização de cada localização e, consequentemente, derivam média global estimativas de precisão para toda a imagem. Usando um Andor IXON DU-897E com um ajuste de ganho de 200 as contagens por valor Photon é 9.04.

6. Alterar a localização de corte de precisão (Figura 1C) a troca entre otimizando precis médios de localizaçãoíon contra número de localização na imagem final. Os valores de 30-50 nm, são recomendados, dependendo da qualidade dos dados e a amostra. Ambos os histogramas e os arquivos INFO.TXT pode ser utilizado para informar esta decisão (Figuras 1F e 1G).
7. O fator de escala reconstrução (Figura 1C) padrão é 5, o que irá gerar pixels de super-resolução de 32 nm, assumindo que a largura de pixel nas imagens originais é de 160 nm. Se as imagens cruas têm um tamanho de pixel de 100 nm isso irá produzir imagens de super-resolução, com pixels de 20 nm. Aumentar o fator de escala para a produção de pequenos pixels de super-resolução na imagem final ^{* 14.}

Nota 14 - Resolução de microscopia localização depende da suavização necessária para a visualização (isto é, o tamanho do pixel de uma reconstrução histograma simples), bem como a precisão de localização. Na prática, o tamanho do pixel de reconstrução deve geralmente ser menor do que a localizaçãoprecisão (ver a métrica Média Precisão Estimativa no arquivo de texto info - passos 6.11 e 6.12). Neste caso, a perda de resolução devida a reconstrução tamanho do pixel será pequeno ^23,27. Por exemplo, as estimativas de precisão média na linha e direção da Figura 4E coluna são de 16,1 nm e 16,2 nm. Um tamanho de pixel de 16 nm foi utilizado para visualizar dados (fator de escala reconstrução de 10 com uma largura original do pixel de 160 nm).

8. Modificar a faixa limite do quadro (Figura 1C) para restringir a reconstrução de subconjuntos dos dados brutos, por exemplo [2001-inf] excluiria os 2.000 quadros iniciais de dados brutos.
9. Pressione o botão "Run Revisor '(Figura 1C) para gerar uma imagem de super-resolução atualizado (Figura 1E).
10. Pressione o botão 'Exibir' histogramas (Figura 1C), a fim de exibir métricas de qualidade de imagem (Figura 1F) ^{* 15.}

Nota 15 - O gráfico no canto superior direito que representa o número de localizações aceites contra número do quadro da câmera e do histograma Thompson Localização Precisions no canto inferior direito (Figura 1F) pode ser usado para informar a opção de precisão de localização crítica de corte. Por exemplo, usando um corte de 50 nm excluiria todas as localizações com pior precisão de ser incluído na imagem final super-resolução.

11. Pressione o botão "Salvar imagem" na revisor (Figura 1C), a fim de salvar todos esses dados ^{* 16.}

Nota 16 - entre 3 e 5 arquivos podem ser salvos, dependendo das opções selecionadas (imagem soma, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists), ver figura 1G. A imagem processada STORM é exibido com mapas de contraste e cores modificadas. O STORMdataImage é uma imagem em tons de cinza, em que o nível de cinza de cada pixel é igual ao entorpecidoer de localizações que foram identificados dentro dele.

12. Depois de examinar os dados (por exemplo Info.txt arquivo e histogramas) retorno para a etapa 7.6 e repita os passos subsequentes com diferentes parâmetros do revisor, se desejar. Clicando no botão "Salvar imagem" no passo 7.11 substituirá os dados salvos anteriormente.

8. Box Rastreamento e Correção de Deriva (usando tempestade)

1. Siga passos 7,1-7,9 para gerar uma imagem de uma forma normal.
2. Pressione o botão 'Caixa de rastreamento "na revisor (Figura 1C) e clique e arraste uma caixa sobre o marcador fiducial ou estrutura de juros sobre a revisão da imagem.
3. Aguarde até que uma nova imagem aparece, que irá mostrar os 'Posições encaixotado' (ver Figuras 6B, 6C e 6F para exemplos). Salve esta imagem, se desejar.
4. Se o objeto de interesse é um marcador fiducial então deriva correção pode ser feita clicando no botão 'Definir âncora', seguido do 'Subbotão Deriva trato '. Por fim, clique novamente em "Executar Revisor 'para gerar uma nova imagem STORM, que terá agora todas as localizações corrigidos de acordo com as posições dos marcadores fiduciais. As posições de contas são excluídos da imagem revisado final.
5. Se houver outros marcadores fiduciais dentro da imagem deriva corrigido final, estas podem ser removidas pressionando 'Box Rastreamento', 'Apagar em caixa "e, em seguida, quantas vezes' Run Viajante" se o desejar.

Results

Dextran

Um revestimento bem sucedido de dextrano deve produzir uma monocamada fluorescente. Na parte alta concentração deste deve aparecer relativamente uniforme. A concentrações mais baixas que aparece mais esparsos (Figura 2A). Muitos microscópios STORM / PALM têm a capacidade de mudar o ângulo de iluminação de epifluorescência para TIRF. Ao usar uma visão de câmera full frame, por exemplo, em 512 x 512 pixels em uma câmera típico EMCCD, uma iluminação uniforme deve ser observada. Se houver listras ou regiões fora de foco que pode indicar que a amostra deve ser reinserido no suporte da amostra com óleo fresco sobre a lente objetiva. Alternativamente, ele pode indicar um problema com o microscópio.

Ao adquirir super-resolução dados brutos que o laser de imagem deve ser aumentada em poder de cerca de 2 kW / cm ^2. Haverá uma explosão inicial de fluorescência seguindo-se a piscar como os fluoróforos são accionadosaos estados escuros temporários. Em altas densidades de dextrano os pisca tendem a sobrepor-se, em particular, perto do início da aquisição de imagem (vídeo 1). Na média e baixa densidades dessas pisca deve ser escassa, ou seja, espacialmente separados, e em foco sem fundo óbvia (ver quadros 2.000, 5.000 e 8.000, Figura 2A, Videos 2 e 3). Durante esta fase de aquisição da imagem, a iluminação por laser constante, o número de pisca irá diminuir com o tempo (comparar com quadro de armação 2000 8000 na amostra de alta densidade, a Figura 2A). A principal diferença entre as várias imagens de super-resolução das diferentes concentrações de dextrano (alta, média e baixa) é a diminuição do número de localizações (Figuras 2A e 2B). Em outras palavras, a concentração das moléculas fluorescentes, número de pisca nos dados em bruto e o número de localizações têm uma relação de proporcionalidade. Esta relação,no entanto, não é um processo linear simples como a molécula muito alta densidades do software é incapaz de localizar com sucesso moléculas (comparar as linhas vermelhas e azuis, Figura 2C). A razão para isto é que a elevada concentração que não é possível para o software de processamento para ajustar as posições utilizando o algoritmo de ajuste de Gauss onde os pisca não são escassos. Como os pisca diminuir através da fase de aquisição devido a fotodegradação do software pode caber mais e mais dos pisca enquanto se tornam escasso (Figuras 2A e 2C). Além disso, as moléculas de corante individuais podem piscar, e, por conseguinte, ser localizada mais do que uma vez ^28,41,42.

Um problema comum quando imagiologia qualquer dessas amostras, mas particularmente a alta densidade de um dextrano, pode ser a presença de neblina fluorescente brilhante, mas sem foco, que parece estar difundindo rapidamente durante a fase de aquisição de imagem de tempestade. Isto é diferente dos fluoróforos de alto contraste ema superfície do vidro, o que pode ser visto a piscar (Figura 3A, vídeo 5). Estas moléculas fluorescentes destacadas pode ser prevenida ou removida, aumentando o número de passos de lavagem com PBS antes da adição do tampão de comutação ou por adição de tampão de comutação de fresco para a câmara (Figura 3B, vídeo 6). Processar e comparar os dados de cada imagem na sequência de resultados muito diferentes imagens de super-resolução, que têm uma diminuição tanto no número de localizações e a precisão com a qual eles podem ser montados de software para localizar os pisca (Figuras 3C, 3D, 3E e 3F).

Filamentos de actina

Filamentos de actina previamente formados podem ser vistos preso à superfície do vidro por meio de difração limitada imagiologia (Figura 4A-4C). Se o número de filamentos aparece muito baixo, então um tempo de incubação pode ser usada ou uma diminuição do volume da actinafilamento solução também ajuda. Selecionando únicos filamentos relativamente brilhantes (Figura 4D), em vez de emaranhadas resultados áreas em imagens de melhor qualidade. Durante a fase de aquisição, brilhantes pisca no foco deve ser visto ao longo do comprimento do filamento (Video 7). Dispersa intermitente devem ser visto durante a fase de aquisição e, em seguida, subsequentemente nos dados processados ​​não deve ser um filamento contínuo fino (Figura 4E) e as localizações por quadro deve um declínio gradual (Figura 4F), ao contrário da Figura 3E.

Se a piscar não é escasso, ou se o software de não ser capaz de localizar as moléculas, um artefacto mais subtil, chamado um mislocalization ^32, pode resultar. Isto ocorre quando as médias de software a posição de duas moléculas de sobreposição e a localização é a posição a meio caminho entre eles. Uma indicação de que não houve um número significativo de sobreposição bliNKS, e consequentemente mislocalizations, é que as estimativas médias de precisão deve ser a mesma nas direcções das linhas e das colunas, ou seja, na horizontal e na vertical, onde existem mislocalizations estes teriam ocorrido ao longo do comprimento do filamento, produziu uma maior do que o normal piscar ( ou seja espalhada por mais pixels), o que, consequentemente, foram localizados com precisão menos numa das direcções. Isto é mais facilmente observado quando existe um único filamento de actina na área de imagem e que está deitado na horizontal ou na vertical. Neste caso, o microscópio TEMPESTADE, conseguida uma precisão média de 16 nm, em ambos os sentidos. Isso resulta em um limite de precisão, uma medida de resolução de imagem efectiva de aproximadamente 34 nm. Estas métricas são fornecidos pela tempestade ^27, no entanto, como temos uma estrutura filamentosa de diâmetro uniforme, 7 nm com a muito pequena phalloidin-Alexa 647 etiqueta podemos tomar uma medida de FWHM para estimar a resolução da imagem. Por draasa de uma linha reta através do filamento da imagem de super-resolução em ImageJ (Figura 4G), usando o recurso de perfil plot (Figura 4H) e, posteriormente, realizar um ajuste de Gauss (Figura 4I) a FWHM é calculada como 43,2 nm. Ao tentar esta medida, recomendamos que o tamanho do pixel deve ser igual ou ligeiramente menor do que a estimativa de precisão média para a imagem (veja o arquivo info.txt Figura 1G). Neste caso, 16 pixels nm foram utilizados para reconstruir uma imagem.

Dois problemas relacionados podem ocorrer com TEMPESTADE, onde os fluoróforos de piscar, isto é, tornar-se moléculas individuais não-esparsos dentro de aproximadamente 250 nm piscar ao mesmo tempo e, por conseguinte, os sinais sobrepostos. A primeira é que, dependendo do algoritmo e os critérios de controlo de qualidade que utiliza, os pisca não pode ser localizada em tudo. Isso resulta em imagens de super-resolução, com poucas ou nenhumas localizações. O segundo problema demislocalizations ocorre quando os dois pisca ocorreu suficientemente próximos uns dos outros para aparecer como um único piscar de olhos. Neste caso, a posição em que a imagem final representa uma média dos dois. Para mais detalhes sobre este ver referência ^32. Em ambos os casos, isso pode ocorrer com amostras muito alta densidade, potência do laser insuficiente ou problemas com a mudança de buffer. Este problema é evidente que um número de filamentos de actina são ramificadas e / ou de passagem entre si (Figuras 5A-D, vídeo 9). Ao processar os subconjuntos de quadros, e comparando os primeiros e últimos 5000 quadros, podemos ver uma imagem resultante diferente. Na imagem de super-resolução usando os primeiros 5.000 quadros (Figura 5C), podemos ver que existem muitas localizações no meio da imagem, no entanto, quando usando os últimos 5.000 quadros, muito poucos destes são aparentes e ficamos com apenas os filamentos, embora um pouco descontínua devendo ao baixo número de localizações na imagE (Figura 5D). Se houver suspeita de uma densidade muito alta piscar comparação das imagens com a localização per dados do quadro pode sugerem fortemente que esse problema está ocorrendo, durante o primeiro conjunto de quadros não é um número médio de localizações por quadro de mais de 10 em comparação com o último conjunto de quadros onde é aproximadamente 4 (Figura 5E). A fim de minimizar a probabilidade de ocorrência mislocalizations é ideal para ter o menor número de localizações por frame como possível, embora, se houver um grande número de moléculas a ser trabalhada, ou seja, para uma amostra de alta densidade, o que exige que um grande número de aquisição quadros de ser tomada levando a um outro problema em microscopia STORM que é drift.

Lateral Deriva - filamentos de actina e Fiducial Marcadores

Deriva ocorre quando a amostra se move em relação à lente objectiva, através da fase de aquisição de dados. Isto é difícil ou impossível ver during a fase de aquisição da imagem, especialmente se ele é lateral em vez de axial, ou a menos que seja especificamente medida, uma vez que é tipicamente inferior a 50 nm, ao longo de vários minutos, para sistemas de microscópio relativamente estáveis. No entanto, nas imagens reconstruídas de estruturas conhecidas, tais como filamentos de actina com uma estrutura bem definida, que pode ser detectado nas imagens de super-resolução. O primeiro sinal de que deriva lateral pode ter ocorrido é que a estrutura é maior do que o esperado (Figura 6A, vídeo 8), por exemplo, com uma relativamente grande FWHM comparados com os dados de limite de precisão de tempestade, neste caso, de 90 nm, em comparação com 67 nm. No entanto, a melhor maneira de detectar a deriva é comparando as localizações como uma função do tempo, isto é, ver se as localizações dos quadros posteriores são deslocados em comparação com aqueles no início de quadros. Isto pode ser claramente visto, no caso dos filamentos de actina, os quais são muito pequenos e de estrutura uniforme, quandoexibida com um código de cores usando o recurso de rastreamento de caixa na tempestade (Figuras 6B e 6C).

Deriva é um problema bem conhecido e há uma série de estratégias que podem ser utilizadas para minimizá-lo ou corrigi-lo ¹⁹ de pós-aquisição ou uso de marcadores fiduciais ^21,43 ou correlações cruzadas ^44. A fim de medir a deriva e adequada ao mesmo, esferas fluorescentes de 100 nm de diâmetro podem ser utilizados como marcadores fiduciais (Figura 6D). Porque eles são pequenos e brilhante a sua posição pode ser medida com precisão usando os algoritmos de ajuste de Gauss, como a tempestade. Em um exemplo, onde existe desvio relativamente severo de cerca de 100 nm, ao longo de 3 min 10 seg, durante a fase de aquisição (Figura 6E), o recurso de acompanhamento mesma caixa pode ser utilizada para o código de cor e confirmar que deriva ocorreu (Figura 6F ). Como todos os quatro contas neste exemplo mostrar deriva quase idêntica é possible para seleccionar um deles, neste caso talão 2, para uso como referência e subtrair o desvio das outras esferas (Figura 6G). Pela adição de marcadores fiduciais de uma amostra biológica de interesse que, em seguida, torna-se possível medir e corrigir qualquer desvio, onde a estrutura subjacente é desconhecido ou muito mais variável do que um filamento de actina ou um talão fluorescente.

Fator de Crescimento Epidérmico

Finalmente, as células HeLa EGF-coradas pode ser usado para dar um exemplo real de resolução de imagem em células (Figura 7A, de vídeo 10). Estas células são relativamente simples de imagem em que deve ter a maior parte do EGF-fluorescência no foco plano-de-na superfície da célula em estreita proximidade com a lamela. A menos brilhante no centro da região que corresponde à posição do núcleo. Iluminação TIRF pode melhorar a qualidade da imagem, eliminando fluorescência fora de foco vindo de partes da célula membrane não na proximidade do vidro (cerca de 150 nm, a penetração nas células). zumbidas de regiões de interesse na imagem de difração limitada são tipicamente indistinto (Figuras 7B e 7C), no entanto, nas imagens de super-resolução deve haver uma mistura de clusters e ocasionais isoladas pixels individuais (Figuras 7D-7F). Estes irão representar tanto os receptores de EGF isolado na superfície celular ou possível uma pequena quantidade de ligação não específica. Os aglomerados será de aproximadamente 100 nm de diâmetro e é provável que correspondem aos poços que formam vesículas, e da via através da qual o EGF é predominantemente sub-regulada e endocitose. As estimativas de precisão médios típicos são de cerca de 20 nm, para este tipo de amostra, com um limite de precisão de cerca de 45 nm. Deve notar-se que esta medida limite de precisão de resolução eficaz não leva em conta o tamanho da etiqueta, ou qualquer desvio, o que pode ser medido com marcadores fiduciais, mas ainda é NoticEABLE por "caudas de cometas" sobre os clusters ou usando o recurso de rastreamento de caixa, conforme descrito na Figura 6 e descrito na seção de protocolo 8.

Componente	Concentração final
Catalase	1 ug / ml (50 unidades)
Glicose	40 mg / ml
A glicose-oxidase	50 ng / mL
Glicerina	12,50%
KCl	1,25 mM
MEA-HCl	100 mM
TCEP	200 uM
Tris	1 mM

Tabela 3. Tampão de comutação

Configurações aquisição típica	Valor
O tamanho do pixel (nm)
Tempo de exposição (mseg)	10
Ganho	200
Tamanho do quadro (pixels)	128 x 128
Tempo de ciclo (fps)	52.5
Número da imagem	10.000
640 nm do laser de densidade de potência (kW / cm 2)	2

160

Tabela 4. Configurações de aquisição

Figura 1. STORM Reconstrução imagem usando tempestade. (A) Abertura tempestade de dentro MATLAB. (B) tempestade interface gráfica do usuário (GUI). (C) tempestade GUI Revisor. (D) Ajustar contraste janela. (E) imagem STORM após revisão e ajuste de contraste. (F) Suatograms de métricas de qualidade de imagem. (G) Os arquivos gerados após pressionar o botão de imagem, salvo em revisor GUI. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. (A) Difração limitados imagens (DL) mostram diferentes concentrações de dextrano antes de imagiologia STORM. Super-resolução (SR) reconstruções de imagem têm um tamanho de pixel de 25 nm. 10.000 imagens foram coletadas com um pixel de tamanho 128 x 128 quadros e quadros individuais são apresentados a partir dessa seqüência (2.000, 5.000, 8.000). Adquirida com um tempo de exposição de 10 ms em 52,5 frames por segundo. As imagens têm um tamanho de pixel de 160 nm. Para maior clareza de visualização de um realce de contraste saturação de pixels de 0,1% foi aplicado utilizando ImageJ. A precisão médiaAs estimativas são de 28 nm (alta), 24 nm (média) e 16 nm (baixo) para as diferentes imagens de dextrano. As densidades de localização são 724 por mM ² (alto), 526 mM por ² (médio) e 13 por hum ² (baixo). (B) O gráfico mostra uma média de três sequências de 10.000 de quadro de cada concentração de dextrano. As barras de erro mostram o desvio padrão. (C) Gráfico traçar o número de localizações aceitos por quadro, usando uma média móvel de 100 quadros. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Má qualidade dos dados Dextran. (A) Difração quadro limitado de uma seqüência 15.000 quadro tempestade. Nota da neblina fluorescente difusa através da imagem. Isto é causado por fluoropho res difundindo através do médium. 128 x 128 pixels tamanho do quadro, a 10 ms de tempo de exposição e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. (B) O mesmo que (A), depois de o tampão ter sido alterado. Observe o melhor contraste como fluoróforos não ligados foram lavados. (C) A reconstrução da imagem de super-resolução correspondente aos dados coletados em (A). Tamanho da imagem idêntica, mas com pixels de 25 nm. A estimativa média de precisão é de 35 nm. (D) A reconstrução da imagem de super-resolução correspondente aos dados coletados em (B). Tamanho da imagem idêntica, mas com pixels de 25 nm. A estimativa média de precisão é de 30 nm. (E) Gráfico traçar o número de localizações aceitos por quadro, usando uma média móvel de 100 quadros. A linha vermelha corresponde à seqüência STORM (A & C), onde há um fundo alto. A linha azul mostra dados correspondentes a (B & D), onde o fundo é baixo. (F) O gráfico mostra o número de localização aceite para as imagens correspondentes ao (C) e (D) de dados de baixo fundo.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver maior figura.

Figura 4. Dados actina típica. (AC) imagens de difração limitada de filamentos de actina antes da adição de comutação tampão e imagem STORM. Comprimentos variáveis ​​de filamentos pode ser visto. Filamentos muito brilhantes são muitas vezes vários filamentos emaranhados juntos. O tamanho do pixel é de 160 nm. (D) A imagem de difração limitada de um único filamento de actina. (E) da tempestade (realce de contraste de 0,1% aplicada em ImageJ). A partir de uma seqüência de 10.000 quadro com um pixel de tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. O tamanho do pixel é de 16 nm. A estimativa média de precisão é de 16 nm. (F) Gráfico traçar o número de localização aceitos por quadro, usando uma média móvel de 100 quadros. (G) Um ampliada na região do filamento de actina a partir de (E) antes de realce de contraste com um perfil de linha desenhada através amarelo. (H) A vista de perfil parcela a partir da linha amarela traçada através do filamento de actina. Gerado em ImageJ. (I) Um ajuste gaussiana do perfil de trama utilizando a ferramenta de ajustamento de curvas no ImageJ. O desvio padrão, d, foi multiplicado por 2,35 para obter uma medição FWHM de 43,2 nm. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 5. Mislocalized filamentos de actina. (A) filamentos de actina de difração limitada. 160 pixels nm. (B) imagem Tempestade de filamentos de actina mostrado em (A). A partir de uma seqüência de 20.000 quadro com um pixel fram 128 x 128tamanho e, a 10 ms de tempo de exposição e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. O tamanho do pixel STORM é de 16 nm. Todos os quadros de 20000 foram processados. A estimativa média de precisão é de 17 nm. (C) por (B), mas com apenas os primeiros 5000 quadros da seqüência 20.000 quadro processados. A estimativa média de precisão é de 18 nm. (D) por (B), mas com apenas os últimos cinco mil quadros da seqüência 20.000 quadro processados. A estimativa média de precisão é de 17 nm. (E) Gráfico de localizações por dados do quadro de completa 128 x 128 pixels quadro de vista.

Figura 6. Lateral deriva. (A) imagem STORM de um filamento de actina reconstruído a partir de uma seqüência de 10 mil quadros com um tamanho de 64 x 64 pixel frame, a 10 ms e tempo de exposição tomada em 64,6 frames por segundo. O tamanho do pixel STORM é de 32 nm. A estimativa média de precisão é32 nm. (B) A imagem STORM exibidos usando o recurso "Caixa de rastreamento" na tempestade. Localizações são exibidos com uma cor correspondente ao número de quadros de quando eles foram adquiridos, por exemplo, localizações desde o início da seqüência de aquisição são azuis; localizações de tarde na seqüência de aquisição são vermelhos. As cores deslocadas indicam que deriva ocorreu. (C) Um zoom na região de (A) exibidos usando o recurso de caixa de rastreamento em tempestade. As cores deslocadas indicam desvio ocorreu. (D) uma imagem de difracção limitada de quatro esferas fluorescentes 100 nm, que podem ser utilizados como marcadores fiduciais. O tamanho do pixel de 160 nm. Números 1-4 mostram cortada e ampliada contas individualmente. (E) Cada talão fluorescente correspondente a (D) reconstruído em tempestade de uma seqüência 10.000 quadro com um pixel de tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. O tamanho do pixel STORM é de 5 nm. A estimativa média de precisão é de 7 nm. grânulos (F) correspondentes a (D) e (E),exibido usando a função 'Box Rastreamento. As cores deslocadas indicam desvio ocorreu. (G) Usar número talão 2 como referência, contas 1, 3 e 4 são exibidos após o recurso "Subtrair Drift 'é usado em tempestade. A comparação com o (E) mostra que o desvio lateral, tenha sido corrigido. O tamanho do pixel STORM é de 5 nm. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 7. Dados EGF típica. (D) Difracção de imagem limitado de parte de uma célula HeLa focada na superfície de células basais. Caixas amarelas indicam zoom em regiões de interesse mostrado em (B) e (C). (B) Zoomed difração imagem limitada da região perto da borda da célula (caixa B). (C) zumbidas de difração limitada imagem da região sob o núcleo (caixa C). (D) imagem STORM correspondente a (A). A partir de uma seqüência de 10.000 quadro com um pixel de tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. O tamanho do pixel STORM é de 25 nm. A estimativa média de precisão é de 21 nm. (E) da tempestade corresponde a caixa de e (D). (F) imagem STORM correspondente a caixa F (D). (G) Localizações por dados do quadro de (D). Clique aqui para ver maior figura .

Vídeos 1-4. Vídeos correspondem a Figura 2A, com diferentes concentrações de dextrano: 1 = alta, 2 = médio, 3 = baixo, 4 = nenhum). 10.000 seqüências de quadros com 128 x 128 pixels de quadros tamanhos, adquiridos com um tempo de exposição de 10 ms em 52,5 frames por segundo. Clique aqui para ver o vídeo 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> vídeo 2, vídeo 3 , vídeo 4

Vídeos 5-6. Vídeos correspondem a Figura 3 A & B. Video 5 é pré-lavagem e Video 6 é pós-lavagem após fluoróforos não ligados foram removidos. 15.000 seqüências de quadros usando um pixel tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. Clique aqui para ver o vídeo 5 , vídeo 6 .

Video 7. Vídeo mostrando a seqüência de quadros crua que foi processado para gerar a imagem STORM na Figura 4E. 10.000 quadro Sequence com um pixel de tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. Clique aqui para ver o vídeo 7 .

Video 8. Vídeo mostrando a seqüência de quadros crua que foi processado para gerar a imagem STORM na Figura 5B. 20.000 seqüência de quadros com um pixel de tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. Clique aqui para ver o vídeo 8 .

Video 9. Vídeo mostrando a seqüência de quadros crua que foi processado para gerar a imagem STORM na Figura 6A. 10.000 seqüência de quadros com um tamanho de 64 x 64 pixel frame, a 10 ms e tempo de exposição tomada em 64,6 frames por segundo. Click aqui para ver o vídeo 9.

Video 10. Vídeo mostrando a seqüência de quadros crua que foi processado para gerar a imagem STORM na Figura 7D. 10.000 seqüência de quadros com um pixel de tamanho 128 x 128 quadro, um tempo de exposição de 10 ms e adquiridas a 52,5 quadros por segundo. Clique aqui para ver o vídeo 10 .

Discussion

Mostramos com algumas amostras de teste simples e livremente disponível tempestade software de processamento, é possível otimizar STORM super-resolução de imagem. Estas ferramentas e métodos irá fornecer pontos de partida úteis para novos usuários e maneiras para os usuários experientes para aumentar a confiança em seus microscópios e seu uso deles para estudo das estruturas biológicas e celulares com detalhes sem precedentes. Usando uma combinação de amostras com estruturas conhecidas ou bem compreendidos e um algoritmo que pode produzir uma série de métricas úteis qualidade de imagem, tais como estimativas de precisão média, o número de localização e histogramas mostrando que é possível melhorar a qualidade de imagem e de ter maior confiança no processo de imagem STORM. Não há um tamanho único abordagem para a aquisição dos dados, pois há um número de diferentes configurações de microscópio comerciais e auto-construído, que pode ser utilizada. Além disso, há muitos e preparação de amostras de imagem etapas de aquisição, que pode influenrência a imagem final, portanto, ter ferramentas de software e amostras de teste é fundamental para a compreensão e otimizando a qualidade de imagem de tempestade.

Além disso, estes protocolos podem fornecer formas úteis e menos ambíguas de resolver quaisquer problemas que possam surgir. Por exemplo, a amostra de dextrano é uma forma muito útil para identificar se existe qualquer desalinhamento do feixe de laser ou de iluminação não uniforme da amostra. Se há preocupações de que o buffer de comutação não pode ser trabalho de um teste visual muito simples para ver se há alguma 'piscar' vai ajudar. Filamentos de actina são uma maneira útil de medir resolução usando comparações FWHM, bem como destacar deriva e mislocalization artefatos. No entanto, deve notar-se que, como métodos de super-resolução com base em localização podem ser densidade fluoróforo sensível, não obstante os outros fatores que contribuem, tais como tempo de exposição, as taxas de frame, poderes laser e a forma como a imagem é processada, é impossível atribuir uma resolução para umespecial microscópio e assumir que todas as imagens terão essa resolução. O que é possível, no entanto, é medir vários aspectos da resolução, como precisões média de localização, número de localização e deriva ^27. Mesmo marcadores fiduciais não pode ser incorporado em cada experiência que pode, pelo menos, ser usado para caracterizar um sistema de microscópio, o seu ambiente e entender melhor as considerações operacionais, tais como a forma como é exigido muito tempo para atingir o equilíbrio térmico após o arranque. Bem como corrigir o desvio lateral, marcadores fiduciais podem ser utilizados para caracterizar e corrigir o desvio axial, embora este requer o uso de uma lente de astigmatismo e um mecanismo de retorno para corrigir a posição da amostra, enquanto as imagens são adquiridas ^43. Sistemas de super-resolução comerciais normalmente incluem algum tipo de controle de estabilidade ou concentrar-lock mecanismo, que pode ser uma solução mais prática para corrigir foco deriva.

Há umre alternativas para a não-especificamente o revestimento de vidro com dextrano, tais como a utilização de corantes directamente ou outras moléculas conjugadas, tais como anticorpos secundários. Uma limitação dessas abordagens é que o número de moléculas ligadas ao vidro não é conhecido. Estruturas filamentosas alternativos que têm sido utilizados incluem microtúbulos ²⁸ e ²¹ de DNA. No entanto, a combinação de tamanho muito pequeno e conveniente reagentes disponíveis comercialmente fazer actina uma alternativa atraente, em particular, como a distância de separação de filamentos divergentes ou ramificados também podem ser um indicador útil de desempenho do sistema ^27.

Há espaço para o desenvolvimento de amostras, apesar dos recentes progressos nesta área ^28,29,46,47. Em particular, a imagem multi-cor apresenta um número de desafios em todos os três aspectos principais da imagiologia, rotulagem exemplo, a aquisição de imagem (hardware), e software (processamento de imagem e alinhamento). Tem sido umuma série de publicações abordando esses aspectos, ^4-6 e, portanto, é claro que as amostras e metodologias de ensaio adequados são fundamentais para gerar e interpretar de forma confiável esses tipos de imagens. De fato, recentemente foi mostrado que dSTORM poderia ser usado para tirar duas imagens da cor, e resolver, a natureza altamente simétrico do complexo do poro nuclear e os autores sugeriram que esta seria uma forma ideal para avaliar o desempenho de correcções aberração cromática ^45. Outra abordagem interessante é a utilização de origami de DNA para criar uma nanoruler, o que cria a possibilidade de posicionamento fluoróforos a distâncias sub-específicos para além de difracção ^46. Isso fornece uma maneira de avaliar a resolução e fazer medições de distância. No entanto, o objectivo final é aplicar estas técnicas de super-resolução para amostras não-idealizados, como as células, que são estruturas tridimensionais complexas. Neste caso, uma combinação de compreensão mais completa de tele técnica combinada com ferramentas de software que auxiliam o usuário na aquisição de dados, processá-lo de forma adequada, e fornecendo métricas imagem é provável que seja a resposta definitiva ^28,29,47,48.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Imaging chamberglass	Fisher	CBR-166-390E	Preparação de amostras
Microscópio invertido	Olympus	IX71	* Veja abaixo as alternativas
100 X TIRF Lente Objetiva	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* Veja abaixo as alternativas
EMCCD Camera	Andor	iXon 897	* Veja abaixo as alternativas
640 nm laser	Toptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - para imagens de corantes Alexa 647 ou Cy5
LabVIEW	National Instruments		*Software de aquisição (hardware de controle)
PC	Dell		Windows XP (64 bits), CPU Intel Xeon E5420, 16 GB de RAM *Controle de instrumento e processamento de imagem
ImageJ			Análise e processamento de imagens http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM		Laser Analytics Group (Cambridge)	http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Exemplo de microscópios			Consulte também a referência 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Microscópios			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Localização Monet) Alternativas aos microscópios autoconstruídos
Tabela 1. Materiais e Equipamento
[header]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
Tampão de actina geral	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Filamentos de actina reformada	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Falodina-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
Microesferas TetraSpeck (0.1 mícron)	Invitrogen	T-7279	3.1
Células HeLa	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pen/Step	Invitrogen	15070063	4.1
Pratos de plástico	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldeído - solução a 10% EM grau	Polysciences	04018-1	4.2
Catalase	Sigma	C100	5.1
Glicose oxidase	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glicose	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Glicerina	Sigma	G2289	5.1; 5.2
Tabela 2.