Artigo de método

Isolamento manual de células-tronco adiposo-derivadas de Lipoaspirates Humanos

DOI:

10.3791/50585

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26 de setembro de 2013

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1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

Neste artigo

Resumo

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Em 2001, pesquisadores da UCLA descreveu o isolamento de uma população de células-tronco adultas, chamadas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC, a partir de tecido adiposo. Este artigo descreve o isolamento de ASC de lipoaspirates usando, um protocolo de digestão enzimática manual utilizando colagenase.

Resumo

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Em 2001, pesquisadores da Universidade da Califórnia, em Los Angeles, descreveu o isolamento de uma nova população de células-tronco adultas do tecido adiposo lipoaspirada que inicialmente denominado Células lipoaspirado ou células processados ​​PLA. Desde então, essas células-tronco foram renomeados como células-tronco adiposo-derivadas ou ASC e passaram a se tornar um dos mais populares populações de células-tronco adultas nos campos da investigação em células estaminais e medicina regenerativa. Milhares de artigos agora descrever o uso de ASC em uma variedade de modelos animais regenerativos, incluindo a regeneração óssea, reparação de nervos periféricos e engenharia cardiovascular. Artigos recentes começaram a descrever a miríade de usos para ASC na clínica. O protocolo mostrado neste artigo descreve o procedimento básico para manualmente e enzimaticamente isolando ASC de grandes quantidades de lipoaspirates obtidos a partir de procedimentos cosméticos. Este protocolo pode ser facilmente escalado para cima ou para baixo para accommodcomeu o volume de lipoaspirado e pode ser adaptado para isolar as ASC de tecido adiposo obtidas por abdominoplasties e outros processos semelhantes.

Introdução

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Em 2001, uma população putativo de células-tronco multipotentes do tecido adiposo foi descrito na revista Engenharia de Tecidos 1. Estas células receberam o nome Processado lipoaspirado ou PLA células devido à sua derivação de tecido lipoaspirado processado obtidos através de cirurgia estética. O método de isolamento descritas neste artigo foi baseado em estratégias enzimáticas existentes para o isolamento da fracção do estroma vascular (SVF) a partir de tecido adiposo 2. O SVF tem sido definida como uma população minimamente processados ​​de glóbulos vermelhos, fibroblastos, células endoteliais, células musculares lisas, pericitos e pré-adipócitos que ainda têm que aderir a um substrato de cultura de tecidos 2, 3. O cultivo deste SVF ao longo do tempo é proposto eliminar muitos destes contaminantes populações de células e resultar em uma população de fibroblastos aderente. Estes fibroblastos, foram identificados na literatura durante os últimos 40 anos como sendo pré-adipócitos. No entanto, nosso grupo de pesquisa demonstrou que estas células possuíam mesodermal multipotency e rebatizou a população SVF aderente como células PLA. Estudos posteriores por inúmeros outros grupos de pesquisa foram adicionados a esse potencial, o que sugere tanto endodermal e potenciais ectodérmicas (para revisão ver 4). Desde essa altura, numerosos termos adicionais para estas células têm aparecido na literatura. A fim de fornecer algum tipo de consenso, o termo células-tronco adiposo-derivadas ou ASC foi adotada na ª conferência anual IFATS 2. Como tal, o termo ASC serão usados ​​neste artigo.

O protocolo descrito neste artigo é um procedimento relativamente simples, que requer equipamento laboratorial padrão e utiliza reagentes simples, tais como solução salina tamponada com fosfo, reagentes de meios de cultura de tecido padrão e colagenase. Pode produzir grandes números de ASC, dependendo da quantidade do volume inicial do tecido adiposo e subsequente culture tempo. No entanto, o processamento de uma grande quantidade de tecido adiposo, tais podem apresentar alguns problemas físicos que possam ser mitigados para um grau usando este protocolo. Além disso, este protocolo requer estéreis a cultura de tecidos e capuzes de biossegurança aprovados, implicando o uso de uma unidade de cultura de tecidos aprovado. Este requisito também pode diminuir a utilidade da população ASC em aplicações clínicas, a menos que eles sejam isolados em boa prática de fabrico (BPF instalações)-aprovados concebidos para o isolamento e a expansão do material para uso clínico. Como alternativa, os sistemas automatizados que podem isolar ASC em um sistema fechado na sala de operação evitaria esta questão fundamental e permitir a utilização imediata de ASC, sem necessidade de posterior expansão in vitro. Até à data, há seis sistemas automáticos que estão disponíveis comercialmente para o isolamento de células a partir de tecido humano. Estes sistemas podem tornar possível isolar umnúmero significativo de ASC de grandes quantidades de tecido adiposo imediatamente após a sua colheita. Estes ASC poderia, então, ser reintroduzida no paciente para uma variedade de fins regenerativos sem o paciente ter que deixar a sala de cirurgia. Além deste protocolo descrevendo o isolamento Manual de ASC, um protocolo para isolamento automatizado de ASC usando o Sistema Celution também é dada em um artigo do companheiro.

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Protocolo

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O protocolo mostrado aqui descreve o isolamento Manual de ASC de lipoaspirates obtidos através de procedimentos cosméticos utilizando digestão enzimática e centrifugação diferencial. Este protocolo foi publicado na revista Engenharia de Tecidos, em 2001, 1, em que as células resultantes foram chamados células lipoaspirado ou células processados ​​PLA por causa de seu isolamento a partir de lipoaspirates. No entanto, o termo célula PLA foi agora substituído pelo termo células-tronco derivadas de tecido adiposo ou ASC para dar ao campo algum tipo de conformidade em termos de nomenclatura. As células isoladas por este protocolo foi mostrado por muitos possuem potencial mesodérmica, tanto in vitro como in vivo (para revisão veja-se 4). Além disso, os ectodérmicos e endodérmica potenciais da ASC Foram também explorados 4. A técnica de isolamento é simples e direta e requer cerca de uma hora para ser concluído. A célula resultantes são cultivadas sob condições de cultura de tecidos padrão. Com o tempo de cultura, torna-se ASC a população mais homogénea, constituída por células fibroblásticas que se expandem rapidamente e mostram boa viabilidade a longo termo em cultura.

Nota: Os seguintes equipamentos que são necessários estão listados no final deste artigo. Todos os vidros, meios e reagentes devem ser esterilizados por meio de autoclave ou filtrada através de filtros de 0,22 mM. Aseptic técnicas de cultura de tecidos devem ser seguidas em todos os momentos. Para garantir isso, todos os materiais colocados na cabine de segurança biológica deve ser esterilizada por pulverização com uma solução de etanol a 70% e esfregando com toalhas de papel limpas.

1. Antes da colheita, preparar os seguintes:

  1. Estéril 1X tampão fosfo salina (PBS) para a lavagem das lipoaspirates. Prepare a cerca de 1 L de 1x PBS para cada 100 ml de lipoaspirado. Autoclave a PBS e todosow-se arrefecer até à temperatura ambiente antes do uso. Como uma opção, antibiótico / antimicótico pode ser adicionado a uma concentração final de: 100 UI / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 2,50 ng / ml de anfotericina B uma vez que o PBS foi arrefecida.
  2. Estéril 0,075-,1% colagenase tipo IA (de Clostridium histolyticum) para a digestão enzimática do lipoaspirado. A concentração irá depender da qualidade e origem da colagenase - isto é comparada em bruto purificado. Outros tipos de colagenase pode ser utilizado (por exemplo, colagenase tipo II ou IV), em concentrações semelhantes. Prepara-se por PBS 1x e filtro estéril usando um sistema de filtração de 1000 ml com um filtro de 0,22 um (figura 1A). No entanto, as garrafas de vidro estéril equipado com um filtro de topo de garrafa também pode ser usado. Preparar e utilizar a temperatura ambiente. Soluções de colagenase pode ser armazenada para a curto prazo, a 4 ° C até ser necessário. Não congelar a solução de colagenase, pois pode diminuir a sua actividade.
  3. Estéril Controlo Médio (MC) para a inactivação da colagenase e cultura da população ASC. Para 500 ml de CM, combinar o seguinte: 500 ml de DMEM (glucose 4,5 g / L, com L-glutamina), 50 ml de soro fetal de bovino (inactivado pelo calor), 5 ml penicilina / estreptomicina (10.000 UI de penicilina, 10.000 mg / ml estreptomicina). Como opção, podem também ser adicionados 5 ml de anfotericina B (250 ug / ml de anfotericina B). Filtração estéril dessa mídia é necessária se os reagentes não estéreis são usados. Coloque o CM num banho de 37 ° C a água 30 min antes do uso para aquecer o meio.
  4. Copos e utensílios de plástico estéril para isolamento. Autoclavar uma proveta de vidro de 1000 ml e deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente antes do uso. Além disso, têm a seguinte utensílios de plástico pronto: pipetas serológicas asséptica (5 ml, 10 ml e 25 ml), 50 ml de tubos de centrífuga, e de tecido tratado de cultura de placas de cultura.

2. O isolamento de ASCs de Lipoaspirates

A maioria lipoaspirates são recolhidos num recipiente de aspiração (ver Figura 1B) e pode ser constituído por três camadas distintas: 1) uma camada superior de óleo devido à lise de adipócitos maduros, 2) uma camada intermédia de tecido adiposo, e 3) um fundo, líquido infranadante contendo salina e contaminando os tipos de células, como as células vermelhas do sangue (hemácias). A camada de óleo no topo podem não estar presentes em quantidades significativas. Se estiver presente, ele deve ser aspirada como a contaminação de óleo de cultura ASC resultante poderia afectar a viabilidade da cultura. O infranadante inferior deve ser removida antes do processamento para minimizar a contaminação das culturas ASC com RBC. Isso vai deixar o meio, a camada de tecido adiposo, o que irá então ser lavada e digeridos enzimaticamente para libertar a sua fracção celular, estroma vascular (SVF).

  1. Lavar o lipoaspirado: Abra o recipiente lipoaspirado na cultura de tecidos hood e decantar cuidadosamente o lipoaspirado em um estéril 1 L copo de vidro. Permitir que as camadas lipoaspirado separar até que a camada de tecido adiposo é bem separados (Figura 1B).
    1. Aspirar para fora da camada de óleo (se presente), utilizando uma agulha estéril, pipetas de vidro e o infranadante salina inferior usando uma pipeta de 10 ml serológico. Isto irá remover a maior parte dos contaminantes de células vermelhas do sangue e soro fisiológico.
    2. Avaliar o volume da camada de tecido adiposo resultante estéril e adicionar 1x PBS a um volume igual. Agita-se a aspirar com a pipeta usada para aspiração, a fim de misturar o lipoaspirado com o PBS. Permitir que as duas camadas para resolver. Como observado acima, o 1x PBS pode ser suplementado com antibióticos / antimicóticos.
    3. Aspirar o infranadante usando uma pipeta de 10 ml sorológica.
    4. Continuar a lavagem da fracção de tecido adiposo como descrito nas etapas 2.1.2. e 2.1.3. até que a camada de tecido adiposo não tem uma cor amarelo / ouro. ª Aspirare infranadante uma última vez, deixando a fracção de tecido adiposo no copo de vidro. Para assegurar a remoção adequada da infranadante, permitir que as camadas lipoaspirado de se contentar com 5 minutos após a última lavagem e antes da aspiração final.
  2. A digestão enzimática da lipoaspirado: Preparar a solução de colagenase 1A esterilizado, conforme descrito acima em uma unidade de filtro. Prepara-se uma quantidade igual a da fracção adiposo e filtro estéril.
    1. Após a filtração da solução de colagenase, descartar da unidade de filtro superior, verter cuidadosamente a fracção adiposo lavado na solução de colagenase e firmemente a fechar a garrafa.
    2. Coloque a mistura de colagenase / adiposo em um banho de água a 37 C ° e digestão a 37 ° C durante 30 min. Agite suavemente a mistura de colagenase / adiposo cada 5-10 min e coloque de volta na água do banho. A camada de tecido adiposo deve assumir uma aparência "mais suave" (Figure 1B), como a digestão prossegue. Tempos de digestão adicionais (isto é, até 2 horas) pode ser utilizada, se a camada de tecido adiposo ainda parece ter pedaços sólidos de gordura dentro dele.
  3. Isolamento de ASC: Coloque a mistura de colagenase / adiposo digerido de volta para a cabine de segurança biológica. Certifique-se de esterilizar a unidade de filtro com etanol 70% antes de colocar de volta no armário.
    1. Pipetar 25 ml de partes alíquotas do infranadante contendo o SVF em tubos de centrífuga de 50 ml estéreis.
    2. Adicionar 25 ml de CM de cada tubo. Permitir que o CM para inactivar o colagenase por incubação à temperatura ambiente no gabinete durante 5 min.
    3. Centrifugar por 10 minutos a 1.200 xg para recolher o SVF como uma pelota.
    4. No armário de biossegurança, aspirar o sobrenadante de cada tubo. Garantir a camada de óleo superior e quaisquer adipócitos flutuantes são aspirados com este sobrenadante ( Figura 1B).
    5. Combina-se as pelotas de SVF num tubo de centrífuga usando 30 ml de CM e dividir igualmente ao longo de dois novos tubos de centrífuga de 50 ml. Centrifugar como no passo 2.3.3. e aspirar os sobrenadantes dos dois granulados SVF (não mostrados na Figura).
      Opcional: Se lise é desejada, ressuspender cada pellet SVF em 10 ml de um tampão de lise de RBC (160 mM NH 4 Cl) e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar como no passo 2.3.3. e aspirar os sobrenadantes para se obterem as pelotas de SVF (não mostrados na Figura).
    6. Combinar as duas pastilhas SVF em um novo tubo de centrifugação utilizando 5-10 ml de CM (Figura 1B).
    7. Para filtrar as partículas de tecido maiores, pipetar o sedimento ressuspenso SVF para um filtro de malha de 100 um colocado em cima de um novo tubo de 50 ml de centrífuga e deixa-se filtrar por fluxo de gravidade.
    8. Alíquotas de pipeta da ressuspensas(E filtrada) pellet SVF contendo as ASC no tecido da cultura tratados placas de cultura. Suplemento cada prato com um volume adequado de CM.
    9. Cultura das células em CM durante 3-4 dias a 37 ° C, 5% de CO 2, sem mudança de meios de comunicação.

Após este período inicial da cultura, o meio de cultura pode ser aspirado e quaisquer contaminantes de células vermelhas do sangue removidas suavemente por lavagem com 1XPBS estéreis. Substituir com CM e continuar a cultura das ASC conforme necessário. O tipo de cultura de tecido utilizado e prato como o sedimento ressuspenso SVF está dividido entre estes pratos irá depender do número de células desejadas na sequência de cultura de tecidos convencionais.

3. Caracterização da População ASC: Citometria de Fluxo e multilinhagem Diferenciação

Uma vez isolados, a caracterização da população ASC deve ser realizada. As abordagens convencionais para este fim incluem cito fluxometria para caracterizar o perfil de antigénio CD superfície celular das células e na diferenciação in vitro para confirmar a sua capacidade de diferenciação em múltiplas. Enquanto múltiplas linhagens pode ser avaliada em ASC, este protocolo define a diferenciação de ASC em células do adipogênica, osteogênica e linhagens condrogênicas como um meio de confirmar potenciais mesodermal multilinhagem 5.

Na diferenciação in vitro multi-linhagem de ASC

  1. A diferenciação osteogénica de ASC: Antes da indução, preparar osteogénica Médio (OM) como segue: Para um frasco de 500 ml de meio DMEM (4,5 g / ml de glicose) adicionar 25,0 mL de SBF (5,0% de concentração final) e 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10000 IU / mL e 10000 mg / ml de concentração final, respectivamente). Para isso, adicione os seguintes agentes de indução osteogênicas para dar as concentrações finais indicadas: dexametasona (0,1 mM final), L-ácido ascórbico 2-fosfato (50,0 mM finais) E β-glicerofosfato (10,0 mM final).
    1. Antes da indução, colheita e as ASC prato de cultura para a cultura de tecidos prato desejado de modo a que uma confluência de aproximadamente 50% é atingido. Para cada prato experimental banhado, placa um prato adicional para um controle não-induzido. Overnight Cultura em CM.
      Nota: 50% de confluência é recomendado, a fim de permitir a proliferação continuada que pode ocorrer durante o curso de indução
    2. No dia da indução, remover o meio e adicionar o seguinte: OM aos poços experimentais osteogénicas desejados e CM para os poços de controlo. O volume do meio usado dependerá do tamanho da placa de cultura de tecidos. Para 12 pratos assim, 1,0 ml de meio por poço é suficiente. Para seis pratos assim, 2,0 ml de meio por poço é suficiente. Para placas de 100 mm, deve ser utilizada 10,0 ml de meio por caixa.
    3. Cultura das células por um período mínimo de 14 dias com as mudanças do meio apropriado a cada 3-4dias. Populações ASC altamente osteogênicas podem mostrar sinais de depósito mineral extracelular tão cedo como indução de 7 dias.
    4. Diferenciação osteogênica (ou seja, a deposição mineral extracelular) pode ser confirmada usando uma mancha histológica von Kossa para o fosfato de cálcio. Esta mancha irá produzir um precipitado preto-castanho identificar a presença de fosfato de cálcio extracelular (ver Figura 2).
      Para manchar com o reagente von Kossa:
      1. Remover o OM das células experimentais e o CM a partir das células de controlo
      2. Fixar as células por 60 min em 4,0% paraformaldeído preparado em 1x PBS.
      3. Lave as células duas vezes com PBS 1x.
      4. Incubar as células com 2,0% de nitrato de prata (preparado em água) no escuro durante 30 min.
      5. Retire o nitrato de prata, lavar duas vezes com água destilada e ar seco nas células.
      6. Expor as células à luz UV durante 60 minutos para desenvolver o calprecipitado de fosfato de cio.
      7. Lave as células várias vezes com 1XPBS.
      8. Contracorante a célula com hematoxilina, se desejar.
  1. Diferenciação adipogénica de ASC: Antes da indução, preparar adipogênica Médio (AM) como se segue: Para um frasco de 500 ml de meio DMEM (4,5 g / ml de glicose) adicione 50,0 ml de FBS (10,0% de concentração final) e 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10000 IU / mL e 10000 ng / ml concentração final, respectivamente). Para isso, adicionar os seguintes agentes de indução adipogênicos para dar as concentrações finais indicadas: dexametasona (1,0 uM final), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX - 0,5 mM finais), indometacina (0,2 mM final), insulina (10,0 uM definitivo ).
    1. Antes da indução, colheita e as ASC prato de cultura para a cultura de tecidos prato desejado de modo a que uma confluência de aproximadamente 80% é atingido. Para cada prato experimental banhado, placa uma adiçãoai prato para um controlo não induzidas. . Cultura durante a noite em CM Nota: diferenciação adipogênica de ASC parece ser mais eficiente com o aumento da confluência.
    2. No dia da indução, remover o meio e adicionar o seguinte: PM aos poços experimentais osteogénicas desejados e CM para os poços de controlo. O volume do meio usado dependerá do tamanho da placa de cultura de tecidos. Para 12 pratos bem, 1.0.ml de mídia por poço é suficiente. Para seis pratos assim, 2,0 ml de meio por poço é suficiente. Para placas de 100 mm, deve ser utilizada 10,0 ml de meio por caixa.
    3. Cultura das células por um período mínimo de 14 dias com as mudanças do meio apropriado a cada 3-4 dias. Populações ASC Altamente adipogénicos pode mostrar sinais de formação de vacúolo lipídico já indução 7 dias.
    4. ASC submetidos a diferenciação adipogênica irá desenvolver múltiplas vacúolos lipídicos que podem ser facilmente visualizadas ao microscópio de luz. Além disso, a diferenciação pode adipogênicaser confirmado utilizando um histológica mancha Oil Red O que irá acumular dentro destes vacúolos (ver Figura 2).
      Para manchar com Oil Red O:
      1. Remova a mídia a partir de células experimentais e de controle e corrigi-los por 60 minutos usando um fixador de cálcio formal de 10%. Para preparar este fixador, combinar o seguinte: água 1,0 g de CaCl 2, 25,0 ml de 16% de paraformaldeído (4,0% final) e 75,0 ml de água destilada.
      2. Lave as células duas vezes com PBS 1x.
      3. Lave as células brevemente com etanol a 70%.
      4. Incubar as células à temperatura ambiente durante 5 min com a solução de Oil Red O. Para preparar a solução de Oil Red O, dissolver 2,0 g de óleo vermelho O pó em 50,0 ml de etanol a 70% e 50,0 ml de acetona.
      5. Lavar as células com etanol a 70% e, em seguida, com água da torneira.
      6. Visualize as células logo após a coloração devido ao desbotamento da mancha com o tempo.
  1. Diferenciação condrogênica da ASC: diferenciação condrogênica é conseguido através de uma técnica de cultura de alta densidade referido como "cultura micromassa". Antes da cultura, preparar condrogénica Médio (CHM) como segue: Para um frasco de 500 ml de meio DMEM (4,5 g / ml de glicose) adicionar 5,0 ml de FBS a 1% (concentração final) e 5,0 ml de penicilina / estreptomicina (10000 UI / ml e 10.000 ug / ml concentração final, respectivamente). Para isso, adicionar os seguintes agentes de indução condrogênicos para dar as concentrações finais indicadas: L-ascórbico-2-fosfato (50,0 ug / ml final), insulina (6,25 ng / ml final), transferrina (6,25 ug / ml final) e TGF-p1 (10,0 ng / ml).
    1. Colher as ASC e centrifugar durante 5 min a 1200 xg para sedimentar as células. Contar as células para determinar a densidade da suspensão de células.
    2. Para preparar os grânulos de micromassa, preparar duas suspensões de células: uma suspensão experimental preparada em ChM a uma densidade de 1 x 10 7 célulass / ml e uma suspensão de controle preparados em CM, a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml.
      1. Coloque 10,0 ul "gotículas" da suspensão celular em poços individuais de um prato de multi-poços. Deixa-se aderir durante 2-3 horas a 37 ° C.
      2. Delicadamente sobrepor as gotas revestida com ou ChM ou CM tomando cuidado para não dissociar as células.
      3. Cultura das células para até 14 dias em ChM ou CM com mudanças em meio a cada 3-4 dias. Células cultivadas em ChM condensa ao longo deste tempo para formar uma Micromass pellet de alta densidade, com pouca ou nenhuma célula em uma monocamada circundante. As células de controlo cultivadas não sofrerão esta condensação e muitos podem ser encontrados como uma monocamada.
      4. Para confirmar a condrogénese, fixar os peletes de 15 min em 4,0% de paraformaldeído (preparadas em PBS 1x), à temperatura ambiente. Mancha para a presença de proteoglicanos sulfatados usando um Alcian mancha histológica Azul.
        Para corar com azul Alcian:
        1. Lave o papelotas fixa-raformaldehyde uma vez em PBS 1x.
        2. Incubar as peletes em 0,1 N HCl (pH 1,0) durante 5 minutos para reduzir o pH.
        3. Remover o HCl e adicionar 1% de reagente azul Alcian (preparada em HCl 0,1 N, pH 1,0). Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
        4. Remover o reagente azul Alcian e lavar os sedimentos com 0,1 N HCl (pH 1,0) para remover o excesso de corante.
        5. Lavagens adicionais utilizando a água da torneira pode ser usado para reduzir a coloração de fundo.
        6. Como alternativa, as pelotas podem ser colhidas de micromassa, fixados durante a noite em 10% de formalina, embebidos em parafina e as secções coradas por azul Alcian.

4. Citometria de Fluxo Caracterização da ASC

Caracterização do perfil do antigénio de superfície celular de CD pode ser realizada por meio de citometria de fluxo convencional.

  1. Preparação do ASC para citometria de fluxo: Antesa análise, se preparar um tampão de citometria de fluxo (DCT) a seguinte composição: 1,0% de BSA, 2,0% de FBS e 0,025% de saponina preparado em PBS 1x.
    1. Colher as ASC e centrifugar as células durante 5 min a 1200 xg para produzir um sedimento.
    2. Ressuspender as células em estéril 1XPBS e contar as células usando um hemocitômetro. Determinar a densidade celular da suspensão.
    3. Divida a suspensão se em alíquotas de 5 x 10 5 células totais e de centrífuga para sedimentar.
    4. Retirar o sobrenadante de PBS e fixar as células durante 60 min a -20 ° C com um excesso de etanol gelado a 70%. Se necessário, estas células podem ser armazenados em etanol a 70% deste em um congelador de -20 ° C até ser necessário.
    5. Após a fixação, aspirar cuidadosamente o etanol e lavar cuidadosamente a pelete duas vezes com um excesso de FCB. Para lavar:
      1. Adicionar um excesso de FCB e ressuspender cuidadosamente o sedimento.
      2. Centrifugar por 5 min a 1200 xg para coletar as células de umsa pelota.
      3. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante FCB.
      4. Repetir.
    6. Retirar o sobrenadante final de lavagem FCB de cada aliquota e ressuspender em 100 ul de FCB. Adicionar o anticorpo primário conjugado com fluorocromo desejado usando diluição sugerido pelo fabricante. Incubar as células em gelo com o anticorpo durante 30 min.
      Nota: Se os anticorpos primários conjugado com fluorocromo não estão disponíveis, podem ser utilizados anticorpos primários não conjugados.
    7. Para cada fluorocromo utilizado (por exemplo, FITC, PE), incubar uma aliquota de células com 100 ml FCB contendo IgG do mesmo isotipo, como um controlo negativo.
    8. Incubar uma alíquota de 100 ml FCB não contendo anticorpos como um controle adicional.
    9. Lava-se cada aliquota de células duas vezes com FCB conforme descrito no passo 4.1.5. Após a última lavagem, ressuspender as alíquotas em 100 ml de FCB e prosseguir com a análise do fluxo.
      Nota: Se foram utilizados os anticorpos primários não conjugados: Após este passo de lavagem incuba-se as aliquotas sobre gelo durante 20 min com FCB suplementado com o anticorpo secundário conjugado com fluorocromo apropriado usando diluição sugerido pelo fabricante. Lavar duas vezes, conforme descrito no passo 4.1.5.
  2. Análise de fluxo de ASC: Para a análise do fluxo, um mínimo de 10.000 eventos devem ser contados. Controles não coradas e do mesmo isotipo deve ser usado para definir portas de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). Por isso, os controlos sem anticorpos (isto é, não corados do passo 4.1.8) deve ser utilizado, a fim de eliminar os detritos e ASC mortas. Os controles de IgG do mesmo isotipo da etapa 4.1.7. deve ser utilizado para estabelecer as áreas de fluorescência positiva.

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Resultados

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O esboço protocolo acima descreve um método manual, enzimática para o isolamento de um SVF a partir de um grande volume de amostra lipoaspirado. Dentro deste SVF são populações de células numerosas, incluindo o ASC. Numerosos estudos propõem que este SVF cultura sob condições de cultura de tecidos padrão irá seleccionar uma população de fibroblastos aderentes susceptíveis de ser composto principalmente do tipo ASC. Consistente com isto, temos mostrado, utilizando citometria de fluxo e de imunofluorescência, que os aglom...

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Discussão

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O tecido adiposo para o isolamento de ASC pode vir de várias formas: desde peças sólidas de tecido obtidos por meio de ressecção ou lipoaspiração em pedaços menores obtidos, quer através de extração de seringa ou lipoaspiração assistida por sucção (ou seja, a lipoaspiração). Se mais células SVF (ASC) e, assim, pode ser obtido a partir de amostras de tecido adiposo ressecados ou aspirados está claro como estudos conflitantes foram apresentadas 16, 17. É possível que um ou outro tipo de tecido adiposo ...

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Divulgações

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Os autores deste manuscrito são co-inventores sobre a patente de propriedade da Regentes da Universidade da Califórnia e licenciado para Cytori Therapeutics.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de reconhecer e agradecer aqueles pessoal adicional de pesquisa que contribuíram para o desenvolvimento do protocolo descrito e seu isolamento da ASC, incluindo: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD , Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Zhang Rong, DDS, PhD, Dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, PhD, e Dr. John Fraser, PhD. Os resultados apresentados foram financiados, em parte, por verbas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde, incluindo os NIAMS e Institutos NIDCR.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagent
DMEM (Dulbecco’ s Modificação de Eagle’ s Médio)Mediatech Cellgro10-013-CVcom 4,5 g/ml de glicose, L-glutamina, piruvato de sódio
Penicilina/EstreptomicinaMediatech Cellgro30-002-CI10.000 UI/ml penicilina/10.000 μ g/ml de estreptomicina
Anfotericina BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ g/ml de anfotericina B
10X PBS (solução salina tamponada fosfo)Mediatech Cellgro25-053-CIsem cálcio, sem magnésio
Tripsina/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25% tripsina/2,21mM EDTA
Colagenase tipo IA (de Clostridium histolyticum)SigmaC2674preparação bruta; < 125 unidades de digestão de colágeno/mg sólido
FBS (Soro Fetal Bovino) inativado pelo calorGemini Bioproducts100106fonte USDA,
pipetas sorológicas de 10 ml inativadasGenesee Scientific12-104
Pipetas sorológicas de 25 mlGenesee Scientific12-106
Tubos de centrífuga de polipropileno de 50 mlGenesee Scientific21-106
Placas de cultura de tecidos de 100 mmGenesee Scientific25-202
Placas de cultura de tecidos de 150 mmGenesee Scientific25-203
Unidades de filtro Stericup de 500 mlMembrana MilliporeSCGPU05REPES, 0,22 μ filtros de células m pore
FisherBrand22-363-549100 μ m malha de nylon
dexametasona - solúvelem água SigmaD-2915
L-ácido ascórbico 2 fosfatoSigmaA-8960
β-glicerofosfato sal dissódico SigmaG-9422também conhecido como glicerofosfato
insulinaSigmaI-6634feito de indometacina de pâncreas bovino
SigmaI-7378
apo-transferrinaSigmaT-4382
TGFβ 1R& D Systems240-B-002humano recombinante
Red OSigmaO-0625
Alcian BlueSigmaA-5268
nitrato de prataSigmaS-0319
ácido clorídricoFisher ScientificA144
ParaformaldeídoFisher Scientific30525-89-4fornecido como estoque
[cabeçalho]
Equipamento necessário
Classe II A/B Capuz de biossegurançaThermo Scientificgarante que o capuz tenha linhas de vácuo para aspiração
Centrífuga de bancadaHermle LabnetZ383Rotor basculante para tubos de 50 ml necessário, capaz de 1200xg Banho-maria
Fisher Scientific IsotempS52602Qcapacidade de 5-10L, capaz de 37C
Auxiliares de pipeta automatizadosDrummond Pipeta Aid XL4-000-105
CO2 IncubadoraThermo ScientificForma 310com camisa direta de calor ou água
pelo calor óleo de 16%

Referências

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