Descreve-se um protocolo para o isolamento e purificação de neutrófilos de medula óssea do rato por centrifugação de gradiente de densidade e de neutrófilos para rotulagem com corantes CellTracker. Isso representa um método simples, rápido, reprodutível e econômica para a obtenção de um grande número de neutrófilos para estudos funcionais a jusante ou de transferência e controle de experimentos adotivos.
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Artigo de método
Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os neutrófilos são células efetoras críticos do sistema imune inato. Eles são rapidamente recrutados em locais de inflamação aguda e exercem efeitos protectores ou patogénicos, dependendo do meio inflamatório. No entanto, apesar de o papel indispensável dos neutrófilos na imunidade, a compreensão detalhada dos fatores moleculares que medeiam efeitos efetoras e imunopatogênico 'neutrófilos em diferentes doenças infecciosas e inflamatórias ainda está faltando, em parte por causa de sua meia-vida curta, as dificuldades com a manipulação destes células ea falta de protocolos experimentais confiáveis para a obtenção de um número suficiente de neutrófilos para estudos funcionais jusante e experimentos de transferência adotiva. Portanto, os métodos simples, rápido, econômico e confiável são altamente desejáveis para a colheita de um número suficiente de neutrófilos de rato para avaliar funções, tais como fagocitose, morte, produção de citocinas, degranulação e tráfico. Para esse fim,apresentamos um protocolo de gradiente de densidade reprodutíveis baseado centrifugação, que pode ser adaptada em qualquer laboratório para isolar um grande número de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade. Além disso, apresenta-se um protocolo simples, que utiliza tintas, CellTracker para rotular os neutrófilos isolados, que podem então ser transferidos adoptivamente para ratinhos receptores e rastreadas em vários tecidos, pelo menos, quatro horas após a transferência usando citometria de fluxo. Utilizando esta abordagem, a rotulagem diferencial de neutrófilos de ratinhos de tipo selvagem e o gene deficiente, com diferentes corantes CellTracker pode ser empregue com sucesso para realizar estudos de repovoamento competitivo para avaliar o papel directo de genes específicos no tráfico de neutrófilos do sangue para os tecidos alvo in vivo .
Introdução
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos. Eles são o principal componente celular do sistema imune inato e agir como uma primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Pacientes com neutropenia adquirida e imunodeficiências primárias que afetam os números de neutrófilos e / ou função desenvolver infecções bacterianas e fúngicas invasoras que ameaçam a vida, destacando a importância dessas células na defesa do hospedeiro 1. O reconhecimento imunológico dos patogénios invasores no local da infecção pelo seu padrão de reconhecimento de receptores de cognato resulta na indução de uma resposta imune inata orquestrada, o que....
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Protocolo
1. Isolamento de rato Células da Medula Óssea
- Eutanásia camundongos usando o protocolo cuidados com os animais da instituição comitê-aprovado e pulverizar a superfície animal com etanol 70%.
- Realizar uma incisão da pele, em meados dos abdómen e remover a pele a partir da parte distal do rato, incluindo a pele que cobre as extremidades inferiores.
- Cortar os músculos dos membros inferiores usando tesoura e deslocar cuidadosamente o acetábulo do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur.
- Remova os músculos remanescentes do fêmur e da tíbia utilizando um bisturi e tesoura e separar o fêmur da tíbia no joelho cuidado exercitar pa....
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Resultados
Este protocolo é otimizado para a colheita de células da medula óssea de camundongos e posterior separação de neutrófilos a partir dessas células por centrifugação em gradiente de densidade, utilizando meios de separação Histopaque celulares disponíveis no mercado. Os neutrófilos isolados utilizando este método pode ser usado para uma variedade de estudos funcionais a jusante ex vivo e para experiências de transferência adoptiva em ratinhos receptores.
O rendimento típico da recolha.......
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Discussão
Apresentamos aqui um protocolo seguro, simples, rápido e económico para o isolamento de grandes números de neutrófilos na medula óssea de ratinhos com elevado grau de pureza e viabilidade usando uma abordagem de centrifugação em gradiente de densidade. Quando este protocolo é realizado correctamente, ~ 6-12 x 10 6 neutrófilos pode ser recuperado a partir de um rato não infectado e tantos como ~ 30-40 x 10 6 neutrófilos podem ser isolados a partir de um rato após a infecção, 6. Os neutróf.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Investigação intramuros do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID), Instituto Nacional de Saúde (NIH), EUA.
Todos os animais foram mantidos em uma associação americana para a Acreditação de Laboratório Animal Care credenciados biotério do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) e alojados em conformidade com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob os auspícios de um protocolo aprovado pelo Animal Care e do Comitê de Uso do NIAID.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X com L-glutamina e HEPES 25 mM | Cellgro | 10-041-CV& | nbsp; |
| Soro Fetal Bovino (Inativado pelo Calor) | GemCell | 100500 | |
| Penicilina/Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml de estreptococos) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| Cloreto de sódio a 0,2% e 1,6% | JT Baker | 3624 | Soluções de cloreto de sódio preparadas com água destilada e filtrada estéril |
| Filtrado estéril Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 precisa ser levado a 18-26 &graus; C antes |
| do uso Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 precisa ser levado a 18-26 ° C antes de usar |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio | Cellgro | 210-40-CV& | nbsp; |
| Álcool Etílico (200 provas) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, diacetato de 5-clorometilfluoresceína) | Invitrogen | C-7025 | Faça soluções de estoque de 10 mM em DMSO, alíquota e armazene a -80 &graus; C |
| CellTracker Laranja (CMTMR, 5-(e 6)-4-Clorometilbenzoil Amino Tetrametilrodamina) | Invitrogen | C-2927 | Faça soluções de estoque de 10 mM em DMSO, alíquota e armazene a -80 &graus; C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use na diluição de 1:100 |
| LIVE/DEAD Kit de Coloração de Células Mortas Azuis Fixável | Sondas Moleculares | L-23105 | Use na diluição 1:1000 |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Solução de Paraformaldeído, 4% em PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Tabela 1. Reagentes para isolamento, marcação e rastreamento de neutrófilos transferidos adotivamente. | |||
| Materiais | |||
| C57BL/6 camundongos | Taconic | ||
| Tubos de centrífuga de 15 ml | Corning | 430053 | |
| Tubos de centrífuga de 50 ml | BD Falcon | 352070 | |
| Pipetas sorológicas de 25 ml | Celltreat | 229225B | |
| Pipetas sorológicas de 10 ml | Celltreat | 229210B | |
| Pipetas sorológicas de 5 ml | Celltreat | 229205B | |
| Pipetas Pasteur (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| Seringas de 12 ml | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 pol. Agulhas (agulhas de deslizamento de precisão) | BD | 305122 | |
| Filtros de células de 100 mm | BD Falcon | 352360 | |
| Placas de Petri bactericidas | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Instrumentos de dissecação de ratos (Tesoura, fórceps, bisturi) | Instrumentos de Pesquisa Biomédica | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instrumentos esterilizados antes do uso |
| Equipamento | |||
| Capuz de cultura de tecidos | The Baker Company | SG403 | |
| Centrífuga refrigerada | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 &graus; C banho-maria agitado | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Tabela 2. Lista de Materiais e Equipamentos utilizados neste protocolo. |
Referências
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
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Reimpressões e permissões
