Geneticamente codificados Molecular Probes para estudar G receptores acoplados à proteína

Resumo

Nós geneticamente codificam o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina em várias posições orientadas nos GPCRs e mostram a versatilidade do grupo azido em diferentes aplicações. Estes incluem uma tecnologia de fotorreticulação alvo para identificar resíduos na bolsa de ligação ao ligando de um GPCR, e específica do local de modificação bioorthogonal de GPCRs com uma etiqueta de péptido epitopo ou sonda fluorescente.

Resumo

Para facilitar os estudos estruturais e dinâmicas de G do receptor acoplado à proteína (GPCR) de sinalização complexos, novas abordagens são necessários para introduzir sondas informativas ou etiquetas em receptores expressos que não perturbam a função do receptor. Usamos âmbar tecnologia de supressão de codões para codificar geneticamente o aminoácido não natural, p-azido-L-fenilalanina (AZF) em várias posições orientadas nos GPCRs heterologamente expressos em células de mamíferos. A versatilidade do grupo azido é aqui ilustrado em diferentes aplicações para estudar GPCRs no seu ambiente celular nativo, ou sob condições de detergentes solubilizadas. Em primeiro lugar, nós demonstramos uma tecnologia de foto-reticulação com base nas células-alvo para identificar os resíduos no bolso de ligação ao ligando de GPCR em que um marcado com trítio pequena molécula ligante é reticulado com um ácido azido-amino geneticamente codificado. Nós, então, demonstrar a modificação específica do site de GPCRs pelo bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligadura reaçãoção que tem como alvo o grupo azido utilização de derivados de fosfina. Discute-se uma estratégia geral para o alvo de marcação de péptidos com epitopo das proteínas de membrana expressos em cultura e a sua detecção usando uma abordagem baseada em ELISA de célula inteira. Finalmente, mostra-se que AZF-GPCRs pode ser marcado selectivamente com sondas fluorescentes. As metodologias são discutidos em geral, na medida em que podem, em princípio, ser aplicada a qualquer posição do aminoácido em qualquer expressa GPCR para interrogar os complexos de sinalização activas.

Introdução

Heptahelical receptores acoplados à proteína (GPCRs) compreendem uma superfamília de proteínas de membrana altamente dinâmicos que medeiam sinais extracelulares importantes e diversas. No paradigma clássico, a activação do receptor é acoplada com alterações conformacionais induzidas pelo ligando. ^{1, 2} avanços recentes em biologia estrutural dos GPCRs têm fornecido uma visão significativa sobre os mecanismos moleculares da sinalização transmembrana. ^3-5 No entanto, para compreender com maior precisão o químico mecanismo funcional e dinâmica estrutural de sinalização GPCR, um kit de ferramentas de abordagens é necessária para incorporar sondas mol....

Protocolo

1. Site-specific Constituição genética de Unnatural Aminoácidos em GPCRs

1. Manter células HEK293T em DMEM (4,5 g / L de glicose, glutamina 2 mM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C numa atmosfera de _{CO2 a} 5%.
2. Transfectar as células cultivadas a 60-80% de confluência numa placa de 10 cm usando o reagente Lipofectamine Plus.
   1. Para 750 mL de DMEM, adicionar 10 ul de reagente Bonés, 3,5 ug de cDNA de GPCR (pMT4. Rho ou pcDNA 3.1. CCR5) contendo o codão de terminação âmbar, numa posição desejada, 3,5 ug de ARNt supressor de cDNA (pSVB.Yam) e 0,35 ug de mutante cDNA ARNt sintetase amino-acilo para o p-azido-L-f....

Resultados

Utilizamos a metodologia de mutagênese aminoácido não natural para o site especificamente introduzir sondas moleculares em um GPCR usando o âmbar códon tecnologia de supressão. O esquema da Figura 1 esboça os passos salientes da metodologia e os vários pedidos de incorporar o versátil UAA, p-azido-L-fenilalanina (AZF), para GPCRs. Expressão da AZF-GPCRs em células de mamíferos permite fotoreticulação alvejado a ligantes, e marcação peptídeo epítopo ou modificações fluorescentes de um GPCR alvo .......

Discussão

Descrevemos aqui uma metodologia robusta para incorporação site-specific de uma sonda reativa, AZF, em GPCRs e demonstrar três aplicações úteis deste instrumento para estudar a estrutura ea dinâmica de GPCRs. Nosso método para o site especificamente incorporar UAAs contorna um problema fundamental com uma estratégia alternativa baseada na rotulagem quimicamente ^{32, 33} ou anexar photocrosslinkers ³⁴ para um único mutante cisteína acessível. Embora, químicos que têm como alvo grupos tiol de cisteína .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plasmídeo pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
pcDNA.RS plasmídico para azF			(Ye et al., 2009)
Plasmídeos pMT4.Rho e pcDNA 3.1.CCR5			Opcionalmente contêm o códon de parada âmbar (TAG) em uma posição desejada
Células			Células aderentes
Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	10566
Tampão com Fosfato Salino	Gibco	14200
Soro Fetal Bovino	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamina Plus	Invitrogen	Lipofectamina: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-fenilalanina	Chem-Impex International	6162
			Tabela 1. Incorporação genética específica do local de aminoácidos não naturais em materiais GPCRs
Lâmpada UV-A Maxima ML-3500S	Spectronics Corporation		azF é ativada por luz de 365 nm
Solução de Sal Tamponada de Hank (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Albumina de soro bovino	Roche	3117405001
		marcado com trítio	Do colaborador (Grunbeck et al., 2012)
1% (p/v) n-dodecil-β-D-maltosídeo	Anatrace	D310LA
		1D4-sepharose	1D4 mAb imobilizada em resina sepharose 2B ativada por CNBr
1% (p/v) dodecil sulfato de sódio (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% de géis SDS	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE realizado em aparelho NuPAGE
Aparelho Trans-Blot SD Aparelho	Biorad		para transferência semi-seca
Membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) Immobilon		IPVH00010
Leite sem gordura	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Fluido de cintilação
Frascos de cintilação	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Contador de Cintilação Líquida	Perkin Elmer		Contador de Cintilação
Beta Anti-rodopsina 1D4 mAb	Nacional de Cultura de Células	personalizado
IgG anti-camundongo conjugada com peroxidase de rábano (HRP) KPL	, Inc.	474-1806
Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico	Thermo Scientific	34080
Filme Hyblot CL AR	Denville	E3018
			Tabela 2. Materiais de fotoreticulação direcionados
0,25% Tripsina	Invitrogen	15050065
BANDEIRA-triarilfosfina	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poli-D-lisina	Sigma	P6407
Placa de 96 poços	Costar	3601	Fundo transparente, alta ligação EIA/RIA
Phosphate Buffered Saline (Cálcio, Magnésio)	Gibco	14040
16% Paraformaldeído	EMS	28908
KPL, Inc.	conjugada com HRP	474-1516
IgG anti-coelho	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Peróxido de hidrogênio	DE Healthcare Products	97-93399
Leitor de placas multipoços de fluorescência CytoFluor II	Perseptive Biosystems
			Tabela 3. Marcação direcionada de peptídeo-epítopo e materiais ELISA de superfície celular
Fluoresceína-fosfina			(Huber et al., submetido em 2012)
Nonapeptídeo (peptídeo C9)	AnaSpec	62190	Peptídeo imitando o epítopo 1D4 NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (p/v) n-dodecil-β-D-maltosídeo	Anatrace	D310LA
		1D4-sepharose	1D4 mAb imobilizada em resina sepharose 2B ativada por CNBr
NuPAGE Novex 4 - 12% de géis SDS	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE realizado em aparelho NuPAGE
Scanner de fluorescência Confocal Typhoon 9400	GE Healthcare	descontinuado	Scanner com laser de comprimento de onda de 488 nm
			Tabela 4. Materiais de rotulagem fluorescentes

HEK 293T Ligante Resina Centro .Resina