Tridimensional Confocal análise de marcadores Microglia / macrófagos de polarização em Experimental Brain Injury

Resumo

Uma maneira de ganhar novos insights sobre a complexidade da resposta inflamatória do cérebro é apresentado. Descrevemos protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional para investigar o padrão de co-expressão de marcadores fenotípicos microglia / macrófagos em um modelo de rato de isquemia focal.

Resumo

Depois de acidente vascular cerebral microglia / macrófagos (M / M) sofrer ativação rápida, com alterações morfológicas e fenotípicas dramáticas que incluem expressão de antígenos de superfície novas e produção de mediadores que se formam e mantêm a resposta inflamatória. Algumas evidências indicam que M / M são células altamente plástico que pode assumir anti-inflamatória (M2) de activação pró-inflamatória (M1) ou alternativo clássico após lesão cerebral aguda. No entanto, uma caracterização completa de M / M expressão do marcador fenótipo, sua co-localização e evolução temporal no cérebro ferido ainda está desaparecida.

Protocolos de coloração por imunofluorescência especificamente marcadores relevantes de activação M / M pode ser realizada no cérebro isquémico. Apresentamos aqui os protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar o padrão de localização e de co-expressão de marcadores fenotípicos M / M, comoCD11b, CD68, Ym1, no modelo de rato de isquemia focal induzida por oclusão permanente da artéria cerebral média (pMCAO). Análise bidimensional da área manchada revela que cada marcador é associado a uma morfologia M / M definido e tem uma dada localização na lesão isquémica. Padrões de M / M fenótipo marcador co-expressão pode ser avaliada por imagem confocal tridimensional na área isquémica. As imagens podem ser adquiridos ao longo de um volume definido (10 m z-eixo e um tamanho de 0,23 mM passo, o que corresponde a um volume de 180 x 135 x 10 mm) com um modo de varrimento sequencial para minimizar os efeitos de passagem de purga e de evitar a sobreposição de comprimento de onda. As imagens são, então, processado para obter representações tridimensionais, por meio de software Imaris. Visão sólida de três representações tridimensionais permite a definição de expressão do marcador em grupos de células. Nós mostramos que M / M têm a capacidade de se diferenciar para uma multiplicidade de fenótipos, dependendo da localização do local da lesão e time após a lesão.

Introdução

Após lesão cerebral aguda, microglia são rapidamente ativadas e passam por morfológica dramática e fenotípica muda ^1-3. Esta resposta intrínseca está associada ao recrutamento de macrófagos nascido de sangue que migram para o parênquima cerebral ^4,5 feridos. O papel da microglia e macrófagos que não são antigenicamente distintos (doravante referido como M / M) em lesão cerebral ainda é debatido. Um número crescente de estudos indicam que, à semelhança do que descrito para macrófagos periféricos, microglia e cérebro recrutados macrófagos pode assumir diferentes fenótipos cujos extremos correspondem ao clássico tóxico pró-inflamatória (M1) ou de protecção (M2) fenótipo anti-inflamatório. Os diferentes estados de activação, incluindo a secreção de factores pro-ou anti-inflamatórios, a libertação de moléculas neurotróficas e actividade lisossomal são caracterizadas por um padrão específico de marcadores fenotípicos, cuja expressão depende da temporaisevolução do ambiente circundante. A caracterização destes fenótipos M / M no cérebro feridos ainda é escasso. Nós usamos um modelo murino bem estabelecida de pMCAo para analisar a expressão M / M e evolução após o AVC. Protocolos de imunofluorescência base aqui apresentados visam a obtenção de uma visão sobre o aparecimento de marcadores específicos M / M fenótipo, sua localização e co-expressão celular na área isquêmica. Nós investigamos algumas moléculas associadas a diferentes estado de ativação ou fenótipo, ou seja, CD11b, um marcador de superfície expressa por leucócitos e um marcador amplamente utilizado de M / M ativação / recrutamento ^6-8, CD68 um marcador de lisossomos ^6,7 e Ym1 uma secreção proteína expressa pelo alternativamente ativados (M2) e macrófagos associados a recuperação e restauração da função ^9-10.

Quando dois marcadores são expressos pela mesma célula, mas em diferentes compartimentos subcelulares, colocalização si só pode não ser tanto informative. Neste caso, a análise de co-expressão pode ser realizada utilizando único plano e vista por representações tridimensionais. Nós aqui descrevemos um protocolo para obter uma análise do marcador co-expressão completa tridimensional.

Protocolo

1. Imunofluorescência

O protocolo seguinte é realizada em crio-secções cerebrais coronais, obtidos a partir de ratinhos transcardially perfundidos (20 ml de PBS, 0,1 mol / litro, pH 7,4, seguido por 50 ml de paraformaldeído 4% gelada em PBS). Após a perfusão, os cérebros foram cuidadosamente removidos e transferidos para 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante a noite para crioprotecção. Os cérebros são então rapidamente congelados por imersão em isopentano a - 45 ° C durante 3 minutos antes de ser selado em frascos e armazenada a -70 ° C até à sua utilização. Criocortes cerebrais coronais (20 um) são cortados em série e submetido a protocolos de imunofluorescência ^{11, 6.}

Todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente antes do uso. Por favor note que as diluições de trabalho apresentados de anticorpos e soro resultou de estudos realizados, a fim de obter o melhor desempenho. Quando diferentes anticorpos e soro são utilizados, o protocolo deve ser validado.

Note que, porque os anticorpos primários, tanto anti-CD11b e anti-CD68 são feitos em ratos, para evitar sinal de cruz por anti-rato Alexa 546, foi utilizado um alta diluição de anti-CD11b seguido de amplificação do sinal fluorescente com kit TSA (Cy5 tiramida). Criámos a diluição de trabalho ideal para anti-CD11b realizando o protocolo descrito, exceto para a etapa 1.17 e usando pelo menos sete diluições diferentes de anti-CD11b como relatado na tabela 1. Como resultado, 1:30.000 foi escolhido ser o único diluição realização: 1) sinal visível com Cy5 no comprimento de onda de excitação 646 nm, 2) nenhum sinal com Alexa 546 no comprimento de onda de excitação de 532 nm. Desta forma, Alexa 546 sinal fluorescente está associada selectivamente com CD68.

As diluições óptimas de anti-CD11b e anti-CD68 podem variar dependendo do tipo de tecido e deve ser definida antes do início do protocolo de co-marcação.

1. Lavar criocortes cerebrais duas vezes com PBS.
2. Emcriocortes Cubate por 5 min em PBS contendo 1% _de H ₂ O ₂ (etapa necessária uma vez que a amplificação de fluorescência precisa de incubação com peroxidase de rábano, com estreptavidina-HRP, ver passo 1.12).
3. Criocortes Lavar 2x com PBS.
4. Incubar durante 60 min criocortes em PBS contendo 10% NGS e 0,3% de Triton.
5. Incubar criocortes a 4 ° C durante a noite em PBS contendo rato primária Ab anti-CD11b [1:30.000], 10% NGS e 0,3% de Triton.
6. Lavar 2x criocortes (5 min) com PBS.
7. Incubar durante 60 min criocortes em PBS contendo secundário biotinilado anti-rato Ab [1:200] e 1% de NGS.
8. Criocortes Lavar 2x com PBS.
9. Lavar criocortes com TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: TRIS 0,1 M-HCl, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20).
10. Incubar criocortes durante 1,5 horas em TNB (tampão Tris-HCl-NaCl-Blocking: TRIS 0,1 M-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% de reagente de bloqueio a partir de kit adequado (ver tabela de reagentes)).
11. Wash crioseções 3x vezes com TNT.
12. Incubar criocortes em TNB contendo estreptavidina-HRP [1:100].
13. Criosecções Lavar 3x com TNT.
14. Incubar criosecções por 8 minutos em Amplificação diluente contendo Cyanine 5 tiramida [1:300].
15. Criocortes Lavar 3x com PBS.
16. Incubar durante 60 min criocortes em PBS contendo 10% NGS e 0,1% de Triton.
17. Incubar criocortes a 4 ° C durante a noite em PBS contendo primário Rato Ab anti-CD68 [1:200], 3% de NGS e 0,3% de Triton.
18. Criocortes Lavar 3x com PBS.
19. Incubar criocortes durante 60 min em PBS contendo fluorconjugated secundário Ab Alexa 546 anti-rato [1:500] e 1% de NGS.
20. Criocortes Lavar 3x com PBS.
21. Incubar criocortes durante 10 min em PBS contendo Hoechst 1 ug / ml.
22. Criocortes Lavar 3x com PBS.
23. Monte criosecções em Prolong Gold.

2. Aquisição de imagens tridimensionais por microscopia confocal

O microscópio utilizado foi um microscópio IX81 equipado com uma unidade de digitalização FV500 confocal com 3 linhas de laser: Ar-Kr (488nm), He-Ne vermelho (646nm), e verde He-Ne (532nm) e um diodo de UV.

1. Selecione os lasers de excitação, dependendo dos comprimentos de onda dos corantes fluorescentes a ser animado (He-Ne vermelho para Cy5, CD11b, He-Ne verde para Alexa546, CD68 eo diodo UV para a Hoechst, núcleos).
2. Escolha a melhor combinação espelho dicróico para a coleta de sinal luminoso.
3. Configure a resolução da imagem em um mínimo de 800 x 600 pixels.
4. Identificar uma área de interesse, utilizando epi-fluorescência e aumentar progressivamente a ampliação para a objetiva de 40X.
5. Mudar para Laser Scanning Microscopy (LSM) modalidade.
6. Execute varreduras repetitivas para ajustar o fotomultiplicador (PMT) eo ganho para cada canal. Lasers podem ser ativados individualmente para facilitar a configuração. Manter ganho tão baixa quanto possível, para evitar sinais não específicos indesejados.
7. Com repetitive verificação em execução, mover o foco de controlo para definir extremos superior e inferior do eixo z (comprimento total do eixo z = 10 mm).
8. Pare de varredura repetitivo.
9. Definir tamanho do passo. Ele deve ser o mais próximo possível ao tamanho do pixel (0,225 mm) para se obter uma proporção de 1:1 de tamanho padrão ao longo do eixo z.
10. Activar filtro de Kalman, pelo menos, duas vezes.
11. Ative o modo de varredura seqüencial para evitar efeitos sangram-through.
12. Vá a meio caminho ao longo do eixo z e executar uma varredura seqüencial xy. Confira o set-up da PMT e ganho (boa relação sinal / ruído). Se não for satisfatória, repita o passo 2.6.
13. Execute aquisição xyz.
14. Exportar dados como arquivo multitiff. Cada arquivo multitiff normalmente contém 3 canais de cores (azul, verde e vermelho) e 44 planos focais.

3. Ver tridimensional de Aquisições confocal e Rendering tridimensional

Fazer upload de arquivos para o software multitiff Imaris e processá-los da seguinte forma:

1. Software Open.
2. Selecione a vista superar.
3. Faça o upload do arquivo multitiff.
4. Selecione a cor desejada para cada canal.
5. Remover o ruído de fundo, aumentando o valor mínimo no painel de exibição de ajuste. Ajuste cada canal individualmente.
6. Vá para a vista de seção. Mover ao longo do eixo z procurando co-localização (pixels amarelos).
7. Clique sobre uma área de amarelo para ver se a co-localização está presente ao longo do eixo z (ou seja, pertencem a um objecto sólido). Projecções do eixo Z são visíveis na parte direita e na parte inferior da figura.
8. Tome um instantâneo.
9. Volte para superar vista.
10. Colheita 3D para isolar uma célula ou um grupo de células.
11. Selecione um canal no painel de ajuste de exibição.
12. Selecione o superam / ​​superfícies algoritmo construtor. Etapas algoritmo:
    1. Selecione canal.
    2. Definir limite (use o mesmo valor mínimo em tele exibir o painel de ajuste).
    3. Definir redimensionamento.
    4. Definir suavização (melhor = 0,200).
    5. Definir aparência de cor.
    6. Fim algoritmo.
13. Repita o passo 3,12 para cada canal.
14. Desmarque canais de fluorescência no painel de ajuste de exibição e selecione todas as três superfícies.
15. Mova o volume para encontrar a melhor vista.
16. Tome um instantâneo.

Resultados

Um exemplo dos resultados obtidos quando os protocolos de rotulagem e aquisições confocal são realizadas na região isquémica é ilustrado nas Figuras 1A e 1B. Uma vista bidimensional de imagens adquiridas mostra que, em vinte e quatro horas após a isquemia (D), o marcador CD68 lisossomal (verde) é expresso em células hipertróficas amebóides CD11b (vermelho) presentes no núcleo isquémico. Na zona de fronteira células positivas (B) CD11b exibir corpos celu...

Discussão

Apresentamos aqui protocolos baseados em imunofluorescência, seguido por análise confocal tridimensional como uma abordagem poderosa para investigar a localização e co-expressão de marcadores do fenótipo M / M para a área isquêmica (para uma análise mais detalhada, ver ref ^6). Este método combina a coloração específica de marcador relevante de activação M / M e um imagem confocal tridimensional. O ajuste fino de anticorpos no soro, e fluorconjugated diluições de trabalho permite melhor sinal-ruído dos marcado...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Materials
Rat Anti-mouse CD11b	Gentilmente fornecido pelo Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milão, Itália
Rat Anti-mouse CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Rabbit Anti-mouse Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H– chst 33342	Life technologies	H21492
Núcleos Anti-Neurais de Camundongo (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Anticorpo anti-rato de cabra biotinilado	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 System	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rato alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti mouse Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-coelho Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Vetores de soro de cabra normal	Laboratories	S-1000
Tritin X-100	Sigma	T8787
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma	P4417-100
Equipment
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 microscópio confocal	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Pacotes de software GraphPad Prism versão 4.0	GraphPad Software Inc.