Um chip microfluídico para a Versátil Análise Química de células individuais

Summary

Neste artigo apresentamos um chip microfluídico para análise única célula. Ele permite a quantificação de proteínas intracelulares, enzimas, co-factores, e os segundos mensageiros, por meio de ensaios fluorescentes ou imunoensaios.

Abstract

Apresenta-se um dispositivo de microfluidos, que permite a determinação quantitativa de biomoléculas intracelulares em várias células individuais em paralelo. Para este efeito, as células são passivamente preso no meio de uma microcâmara. Após a activação da camada de controlo, a célula é isolado a partir do volume em torno de uma pequena câmara. O volume circundante podem ser trocados sem afetar a célula isolada. No entanto, aquando da abertura e fecho curto da câmara, a solução na câmara pode ser substituído dentro de algumas centenas de milisegundos. Devido à reversibilidade das câmaras, as células podem ser expostas a soluções diferentes sequencialmente, de uma forma altamente controlável, por exemplo por incubação, lavagem, e finalmente, a lise celular. Microchambers hermeticamente seladas permitir a retenção do ligado, minimizar e controlar a diluição após a lise celular. Uma vez que a lise e análise ocorrer no mesmo local, de alta sensibilidade é mantida porque não mais dilution ou perda dos analitos ocorre durante o transporte. Por isso, o projeto MicroChamber permite a análise confiável e reprodutível de números muito pequenos de cópia de moléculas intracelulares (atomoles, zeptomoles) liberadas a partir de células individuais. Além disso, muitos microchambers podem ser dispostos num formato de matriz, permitindo a análise de muitas células de uma só vez, uma vez que os instrumentos ópticos adequados são usadas para a monitorização. Nós já usou a plataforma para estudos de prova de conceito para analisar proteínas intracelulares, enzimas, cofatores e segundos mensageiros em forma quantificável relativo ou absoluto.

Introduction

Muitos estudos no passado revelaram diferenças célula-a-célula dentro de uma população de células grandes ^1-3, em particular os processos de sinalização ^4, ou as quantidades de biomoléculas intracelulares, tais como proteínas, metabolitos ^{5,6, 7,8} e cofactores. Estas heterogeneidades são considerados fundamentalmente importante para a adaptação e evolução de ⁹ células, mas também desempenham um papel chave na emergência e tratamento de doenças como o cancro ^10-13. Portanto, os estudos sobre o nível de uma única célula são de grande interesse na pesquisa biológica e farmacológica, principalmente se esses estudos r....

Protocol

1. SU-8 Fabricação mestre

Prepare dois moldes mestres para os canais (fluídicos e controle, para esquemas e dimensões veja a Figura 2) com o seguinte protocolo, mas com diferentes padrões de máscara. O processo é mostrado na Figura 3a.

1. Começar por aquecimento de uma bolacha de silício de 4 polegadas por 10 min a 180 ° C. Carregue o wafer desidratado em um spin-coater e use o seguinte protocolo para spin-coating SU-8 de 2015:
   1. Gire wafer a 100 rpm por 20 s (tampa aberta de spin-coater, dispensar SU-8 durante esta etapa, feche a tampa depois da dispensa).
   2. Wafer de rotação a 500 rpm....

Results

Nossa plataforma é capaz de analisar uma variedade de intracelular, bem como moléculas segregadas presentes em ou produzidos por células individuais. Aqui, nós gostaríamos de apresentar diferentes estudos exemplo para sublinhar a variedade de possíveis ensaios. Vamos dar um exemplo, para uma enzima secretada (Figura 5a), bem como uma enzima intracelular (Figura 5b) e de proteína (Figuras 5c e d). Para mais exemplos, como cofatores ou pequenas moléculas,.......

Discussion

Tecnologia microfluídica abriu novas e fascinantes possibilidades de análise de uma única célula. Em particular, a possibilidade de capturar e imobilizar células individualmente por ferramentas microfluídicos tem permitido estudos sistemáticos de curto e longo prazo sobre as propriedades de uma única célula e resposta. Além disso, a encapsulação de células em microgotículas de alta frequência, gerados por um circuito integrado, permitiu estudos de secreção de células individuais, que não podem ser realizados com os disp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Nome da empresa de reagentes Número de		catálogo	Comentários (opcional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.1H,1H,2H,2H-Perfluorodecil-dimetilcloro-silano
	ABCR (Karlsruhe, Alemanha)	AB103608
4-metilumbeliferilo β-D-N,NSigma	Aldrich	M9763
Acetona	Merck VWR (Darmstadt, Alemanha)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemanha)	n.a.AZ
726 desenvolvedor	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Alemanha)	n.a.
Albumina de soro bovino	Sigma Aldrich	A-4503
Albumina de soro bovino, biotina	Sigma Aldrich	A-8549
Tampão de dissociação celular	Invitrogen	13151-014
Hexametildisilazano (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Ácido clorídrico	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Alemanha	)109634
Cloreto de magnésio hexa-hidratado	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlim, Alemanha)	n.a.PBS
	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG SuSoS enxertado	, (Dü bendorf, Suíça)	n.a.PLL-g-PEG
biotina enxertada	SuSoS, (Dü bendorf, Suíça)	n.a.Cloreto
potássio	Fluka	60132
Proteína G, biotina	Sigma Fine Chemicals	41624
Bolacha de silício	Si-Mat (Kaufering, Alemanha)	n.a.Sylgard
184 Kit de elastômero de silicone (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hidroximetil)-aminometano	Biorad
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPAMENTO:
Nome do Material	Número de catálogo	da empresa	Comentários (opcional)
0.22 µ m Filtro de seringa PES	TRP	99722
perfurador de biópsia de 1/1,5 mm	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µ m	Partec	04-004-2325
Centrífuga Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.Placa
de aquecimento HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Suíça	alinhador de máscara n.a.MA-6
	Karl Suess	n.a.Multizoom
AZ100M microscópio	Nikon Corporation	n.a.Photomask
	Microlitho, Essex, Reino Unido	n.a
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.a.Spin
coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.Spin
Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.Step
profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.Bomba
de seringa neMESYS	Cetoni	n.a.