Estabelecimento de um<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudar o comportamento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Em humanos THP-1 macrófagos

Resumo

O presente artigo descreve um protocolo para estabelecer um sistema modelo de cultura de células in vitro para estudar a interação de um patógeno humano intracelular facultativo de fungos Candida glabrata com macrófagos humanos, que será uma ferramenta útil para aumentar o nosso conhecimento dos mecanismos de virulência de fungos.

Resumo

Um sistema de modelo de cultura de células, se um mímico de perto as condições ambientais do hospedeiro, pode servir como uma alternativa barata, reprodutível e facilmente manipulável para sistemas de modelo animal para o estudo de um passo específico de uma infecção patogénica microbiana. Uma linha celular monocítica humana THP-1, o qual, após tratamento do éster de forbol, subdivide-se em macrófagos, anteriormente tem sido utilizado para estudar as estratégias de virulência de vários agentes patogénicos intracelulares, incluindo o Mycobacterium tuberculosis. Aqui, discutimos um protocolo para adoptar um modelo in vitro de cultura de células sistema usando THP-1 macrófagos para delinear a interação de um oportunista levedura Candida glabrata patógeno humano com células fagocíticas host. Este sistema modelo é simples, rápido, passíveis de telas de mutantes de alto rendimento, e não requer equipamentos sofisticados. A THP-1 experiência típica a infecção dos macrófagos leva aproximadamente 24 horas, com um adicional de 24-48 horas para permitir intracelular recuperadolevedura de crescer em meio rico para formadoras de colônia análise de viabilidade com base em unidade. Como outros sistemas in vitro do modelo, uma possível limitação dessa abordagem é a dificuldade em extrapolar os resultados obtidos para um circuito de célula imunológica altamente complexo existente no hospedeiro humano. No entanto, apesar disso, o protocolo atual é muito útil para elucidar as estratégias que um fungo pode empregar para evitar / neutralizar resposta antimicrobiana e sobreviver, adaptar e proliferar no ambiente pobre em nutrientes das células do sistema imunológico do hospedeiro.

Introdução

Espécies de Candida são a principal causa de infecções fúngicas invasivas risco de vida em pacientes imunocomprometidos ^1. Candida glabrata, um patógeno nosocomial emergente, é o segundo ou terceiro mais frequentemente isoladas espécies de Candida de pacientes unidade de terapia intensiva, dependendo da localização geográfica ^1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, uma levedura de brotamento haplóides, é mais estreitamente relacionado com os Saccharomyces não modelo levedura patogênica cerevisiae do que patogênica Candida spp. incluindo C. albicans ^4. Coerente com isso, C. glabrata carece de algumas características de virulência de fungos-chave, incluindo o acasalamento, a actividade proteolítica secretada e plasticidade morfológica ^4-5.

Embora C. O glabrata não formam hifas, pode sobreviver e replicar-se em macrófagos de ratinho e humanos ^6-8 sugerindo que desenvolveu mecanismos de patogénese únicas. Não existe informação suficiente sobre as estratégias que C. glabrata emprega para sobreviver ambiente intracelular de macrófagos pobres em nutrientes e neutralizar respostas do hospedeiro não oxidativos montados por células do sistema imunológico do hospedeiro ⁵ oxidativo e. Um sistema modelo de macrófagos pertinente é um pré-requisito para delinear a interação de C. glabrata com células fagocíticas do hospedeiro através de abordagens de genômica e proteômica funcional. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e os macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de origem humana e de murino, respectivamente, têm sido anteriormente utilizados para estudar a interacção de C. glabrata com células do sistema imunológico do hospedeiro ^7,9. No entanto, a dificuldade na obtenção de PBMC e BMDMs, a sua duração de vida limitada e variação intrínseca entre diferentes doadores de mamíferos restringir a utilização destas células como sistemas modelo versáteis.

Aqui, descrevemos um método para o estabelecimento de um sistema in vitro para estudar a intracellulcomportamento de ar C. células glabrata em macrófagos derivados da linha celular monocítica humana THP-1. O objetivo geral deste protocolo foi a promulgar um sistema modelo de cultura de células simples, barato, rápido e reprodutível, que pode ser facilmente manipulado para estudar diferentes aspectos da interação patógeno-hospedeiro.

Células THP-1 foram anteriormente usadas para decifrar a resposta imune do hospedeiro contra uma vasta gama de agentes patogénicos, incluindo as bactérias, vírus e fungos ^10-12. Monocíticas THP-1, as células são fáceis de manter e podem ser diferenciados, após tratamento do éster de forbol, para os macrófagos, que imitam os macrófagos derivados de monócitos de ser humano e expressam marcadores de macrófagos adequados ^13. As principais vantagens do THP-1, do sistema modelo de macrófagos são a facilidade de utilização e a falta de equipamento sofisticado requisito.

O protocolo aqui apresentado é facilmente adaptável para estudar a interação de outros fungos patógenos humanos com hosAs células T do sistema imunológico. O processo actual pode também ser empregue para identificar os factores de virulência para o agente patogénico de interesse, utilizando telas de mutantes de elevada capacidade. Esta prova de conceito foi exemplificado pelo uso bem sucedido de THP-1 sistema de modelo de cultura para identificar um conjunto de 56 genes que são necessários para a sobrevivência de C. glabrata em macrófagos humanos ^8.

Protocolo

Recomenda-se a realizar C. experimentos de infecção glabrata em um laboratório com nível de contenção de biossegurança 2 (BSL-2).

1. Preparação de células THP-1 monocamada de macrófagos.
2. Preparação de C. suspensão de células glabrata.
3. A infecção de células THP-1 com os macrófagos C. células glabrata.
4. A medição da taxa de fagocitose e replicação intracelular através do ensaio de formação de colónias unidade.
5. Monitoramento da replicação intracelular por microscopia confocal a laser.

1. Preparação de células THP-1 macrófago monocamada

1. THP-1 é uma linha celular monocítica humana derivada a partir do sangue periférico de um menino de 1 ano de idade, sofrendo de leucemia monocítica aguda ^14. THP-1, uma linha de células em suspensão, é habitualmente mantida a 37 ° C em humidade a 5% de CO ₂ em meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% FBS (soro fetal bovino). O tratamento com forbol 12-myristate 13-acetato (PMA, um éster de forbol) resulta na diferenciação terminal de células THP-1 monocitárias em macrófagos. É importante ressaltar que o tratamento PMA não afeta a viabilidade das células e células diferenciadas não se dividem.
2. Semente de aproximadamente 1,5 x 10 ⁶ monócitos THP-1 em placas de 100 mm de cultura em meio RPMI-1640 completo (meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro, 2 mM de glutamina e antibióticos 1x, 10 mL / prato) e deixar crescer as células a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 2 dias.
3. Uma vez que as células THP-1 chegaram a uma densidade de 8 x 10 ⁵ células / ml, transferir a placa de cultura para a cultura de células de fluxo laminar vertical e agitar suavemente para ressuspender as células que se estabeleceram.
4. Pipetar a suspensão de células para fora, colocar num tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 1000 rpm (130 x g) durante 4 min. Elimine o sobrenadante e suspender de THP-1 sedimento celular em 5 ml, pré-aquecido, de meio completo RPMI-1640 fresco.
5. Enumerar as células com um hemocitômetro e diluir o cell suspensão para uma densidade final de 10 ⁶ células / ml com meio completo pré-aquecido RPMI-1640
6. Adicionar 1 ml de estoque de 160 mM PMA (12-miristato de solução de 13-acetato de forbol preparada em dimetil-sulfóxido) para 10 ml de THP-1 de suspensão celular (concentração final 16 nM) e misture bem. Repartir 1 ml de suspensão celular em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades e incubar placa na incubadora mantida a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 12 horas.
7. Remover o meio velho, adicionar 1 ml de pré-aquecido de RPMI-1640 completo e permitir que as células recuperar durante 12 horas a 37 ° C em 5% de CO _2.
8. Observar células sob um microscópio invertido para garantir que células THP-1 monocítica ovais em suspensão foram diferenciadas em macrófagos achatados, em forma de fuso e aderentes. Estas células diferenciadas estão agora prontos para conduzir C. estudos de infecção glabrata.

2. Preparação de C. glabrata & #Suspensão celular; 160

C. glabrata estirpe selvagem Bg2 será utilizado para infectar células THP-1 macrófagos. C. glabrata células são rotineiramente cultivadas em meio YPD líquido (extracto de levedura (1%), peptona (2%), dextrose (2%)) médio. Meio YPD sólida é preparada por adição de 2% de agar antes da autoclavagem médio.

1. Para preparar uma cultura de C. glabrata, escolhe-se uma única colónia da placa de agar com um lacete estéril, descartável e inocular em 10 ml de meio YPD líquido e incubar durante 14-16 horas, com agitação (200 rpm) a 30 ° C.
2. Centrífuga esta cultura (1 ml) a 4000 rpm (1800 xg) durante 5 min, em cima de uma mesa de microcentrífuga, lavar as células três vezes com PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4) estéril e suspender sedimento celular em 1 ml de PBS.
3. Medida _OD600 de C. suspensão de células glabrata e dilui-se com um volume adequado de PBS estéril para obter uma densidade de 2 x 10 ⁶ células / ml _(DO600= 0,1). Em alternativa, a densidade de células desejada pode ser conseguida por meio da contagem de células de levedura usando um hemocitómetro.

3. A infecção de células THP-1 de macrófagos C. Células glabrata

1. Adicionar 50 ul C. suspensão de células glabrata THP-1 nos macrófagos (10 ⁶ células semeadas por poço de uma placa de cultura de 24 poços) para obter um MOI (multiplicidade de infecção) de 0,1 e Incubar a placa a 37 ° C com 5% de CO _2.
2. Para determinar as contagens de levedura viáveis, diluir 50 ul C. glabrata de células em suspensão de 100 vezes em PBS estéril e placa 100 uL de meio sólido de YPD. Incubar as placas a 30 ° C, e contar manualmente o número de colónias de levedura que aparecem após 1-2 dias. Esses números serão, doravante, ser referido como 0 hr C. glabrata UFC (unidades formadoras de colônia).
3. Depois de 2 horas coculturing de células THP-1 com C. células glabrata, meio de cultura de descarte invertendo placa de 24 poços de cultura de tecidos ina reservatório e lavar cuidadosamente três vezes com PBS estéril pré-aquecido para remover C. extracelular nonphagocytosed células glabrata. Lavagens gentil com PBS são absolutamente essenciais para realizar a remoção completa de todo o fermento extracelular, sem causar qualquer dano ao THP-1 macrófagos monocamada.

4. Medição de fagocitose e Taxa de replicação intracelular via Colony Forming Assay Unit

1. Lyse C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos, em 1 ml de H ₂ O estéril durante 2 min, raspe para remover os detritos de macrófagos do poço e recolher o lisado celular num tubo de microcentrífuga. Verificação microscópica da lise dos macrófagos completo é fundamental para a recuperação de todas as leveduras internalizadas.
2. Prepara-se uma diluição de 100 vezes do lisado em PBS estéril, placa de 100 ul de meio sólido de YPD e incubar as placas a 30 ° C.
3. Após 1-2 dias, a contagem manual do número de C. glabrata colônias que apreceu em meio YPD, multiplique com o fator de diluição (2 horas UFC) e calcular a taxa de fagocitose, que se refere à percentagem de C. glabrata células que são ingeridas por THP-1, macrófagos, após co-incubação de 2 horas com a seguinte fórmula.
   Fagocitose% = [(UFCs em 2 h) / (CFU em 0 h)] X 100
4. Para medir a taxa de replicação intracelular de C. glabrata células THP-1 em macrófagos, recolher levedura intracelular em diferentes momentos pós ie infecção. 4, 6, 8, 10, 12, e 24 horas, repetindo os passos 3,3-4,3.
5. Calcule vezes sobrevivência / replicação de C. glabrata em células THP-1, macrófagos, dividindo o total de UFC em qualquer ponto no tempo, com os de 2 horas (de levedura fagocitado).

5. Monitoramento de replicação intracelular Usando confocal Laser Microscopia

1. Seguindo os passos descritos na secção 1, as sementes tratadas com PMA 5 x 10 ⁵ células THP-1 em cada poço de dois lâminas de câmara de quatro poços e incuba-se a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 12 horas.
2. Substituir meio velho pré-aquecido com meio RPMI-1640 completo e permitir que as células se recuperar a partir do tratamento de PMA durante 12 horas.
3. Prepare GFP (proteína fluorescente verde)-marcado C. suspensão de células glabrata, conforme descrito na Seção 2 e infectar a THP-1 macrófagos para um MOI de 1. Se C. glabrata estirpes expressando GFP não está disponível, as células de levedura marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceína) pode ser utilizado para monitorar eventos precoces pós infecção viz. taxa de fagocitose e maturação phagolysosomal em 2 horas.
4. Incubar durante 2 horas a 37 ° C com 5% de CO _2, inverte-los cuidadosamente para descartar meio e lavar 3x com estéril, pré-aquecido PBS.
5. Adicionar 500 mL pré-aquecido RPMI-1640 completo medihum para cada câmara de uma corrediça e incube-a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 22 horas.
6. Para corrigir 2 horas C. glabrata infectadas THP-1, macrófagos, adicionar 500 mL de 3,7% de formaldeído (em PBS) a cada uma das câmaras da outra corrediça e incubar-la à temperatura ambiente durante 20 min no escuro.
7. Lavar deslizar três vezes com PBS, adicionar 500 ul de Triton-X (0,7%), e incuba-se à temperatura ambiente durante 5 min no escuro.
8. Lavar 3x slides com PBS, remova câmara de cultura de slides e ar seque-o por 3-5 min no escuro.
9. Monte cuidadosamente uma lamela utilizando meio Vectashield montagem contendo DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) no slide evitando a formação de bolhas. Remova suavemente o excesso de líquido com Kimwipe e selar bordas lamela com unha polonês. Slides loja no escuro a 4 ° C até o uso.
10. Repita os passos 5,4 e 5,6-5,9 para processar células THP-1 24 horas após a infecção.
11. Células de imagem usando um confo de varredura a lasermicroscópio cal (objetiva 60X de imersão em óleo, a excitação a 405 nm e 488 nm para DAPI e GFP mancha, respectivamente).

Resultados

Analisa Infecção tratados com PMA THP-1 macrófagos com C. tipo selvagem glabrata (em peso), as células revelaram que as células wt foram fagocitados por macrófagos, a uma taxa de 55-65%, após co-incubação de 2 horas. Além disso, C. glabrata células foram capazes de resistir a morte por THP-1 macrófagos e passou por uma moderada 5 - para aumento de 7 vezes no UFC após 24 horas de coculturing com THP-1 macrófagos ^8. Replicação intracelular de células de tipo selvagem, transfo...

Discussão

Sistema imune inata desempenha um papel importante no controle de infecções causadas por fungos oportunistas. Os macrófagos contribuem para antifúngicos defesa por ingestão e destruição do patógeno. Assim, a elucidação de fatores que são necessários para a sobrevivência e / ou neutralizar as funções antimicrobianas de macrófagos permitirão uma melhor compreensão das estratégias de virulência de fungos. Neste contexto, nós estabelecemos um sistema in vitro de modelo de cultura celular, utilizando macrófagos deri...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coleção de Cultura THP-1	American Type TIB	202	Linha celular de leucemia monocítica aguda humana
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	Para manter células THP-1
Phorbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich	P 8139	Cuidado: YPD perigoso
	BD-Difco	242710	Para células Candida glabrata em crescimento
Formaldeído	Sigma-Aldrich	F8775	Para fixação de macrófagos THP-1 infectados com C. glabrata
Tampão salino tampolado com fosfato (PBS)			Tampão (137 mM NaCl, 10 mM Fosfato, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) para lavagens
Citrato salino-sódico (SSC)			Tampão (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sódio para concentração de 20x) para lavagens
Tampão			Tampão (50% formamida, 5x Denhardt' s solução, 5x SSC, 1% SDS) para hibridização
Meio de montagem VECTASHIELD	Vector Labs	H-1200	Para montagem de lâminas para microscopia confocal
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	Para radiomarcação de etiquetas de assinatura Placas de cultura de
tecidos de 100 mm	Corning	430167	Para cultura de células THP-1
Placa de cultura de tecidos de 24 poços	Corning	3527	Para realizar estudos de infecção por C. glabrata em macrófagos THP-1
Lâmina de vidro tratada com cultura de tecidos de 4 câmaras	BD Falcon	REF354104	Para imagem C. glabrata macrófagos THP-1 infectados
Hemocitômetro	Rohem Índia		Para enumeração de células
Microcentrífuga de mesa	Beckman Coulter	Microfuge 18	Para centrifugação de células em microtubos
Centrífuga de mesa	Remi	R-8C	Para centrifugação de células em tubos de 15 ml
Espectrofotómetro	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	Para monitorizar a absorvância de células de levedura
Incubadora de placas	Labtech	Refrigerado	Para cultivar células C. glabrata
Incubadora Shaker	New Brunswick	Innova 43	Para cultivar células C. glabrata
Incubadora de CO2  Thermo	Electron Corporation	Forma série 2	Para cultura de células THP-1
Microscópio confocal	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	Para observar macrófagos THP-1 infectados com C. glabrata
Microscópio composto	Olympus	CKX 41	Para observar a máquina de PCR de macrófagos C. glabrata e THP-1
	BioRad	DNA Engine	Para amplificar tags únicas de entrada e saída de DNA genômico
Forno de hibridização	Labnet	Problot 12S	Para hibridização
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	Para escanear membranas hibridizadas
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	Para desnaturação de etiquetas de assinatura radiomarcadas Unidade de documentação de
gel	Alphainnontech	Alphaimager	Para visualizar DNA corado com brometo de etídio em géis de agarose