A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

Resumo

Multi-eletrodo gravações de patch-clamp constitui uma tarefa complexa. Aqui nós mostramos como, através da automatização de muitas das etapas experimentais, é possível acelerar o processo conducente à melhoria qualitativa no desempenho e número de gravações.

Resumo

A técnica de patch-clamp é hoje o método mais bem estabelecido para gravar a atividade elétrica dos neurônios individuais ou seus compartimentos subcelulares. No entanto, a realização gravações estáveis, mesmo a partir de células individuais, continua a ser um processo demorado de considerável complexidade. Automação de muitos passos em conjunto com display de informação eficiente pode ajudar muito experimentalistas na realização de um maior número de gravações com maior confiabilidade e em menos tempo. A fim de alcançar as gravações em grande escala que concluiu a abordagem mais eficaz não é de automatizar totalmente o processo, mas para simplificar os passos experimentais e reduzir as possibilidades de erro humano, enquanto que incorpora de forma eficiente a experiência do experimentador e o feedback visual. Com esses objetivos em mente, desenvolvemos um sistema assistido por computador que centraliza todos os controles necessários para uma experiência multi-eletrodo patch-clamp em uma única interface, um commercgamepad sem fio ei ra me nt disponível, durante a exibição de experimento relacionado informação e orientação pistas na tela do computador. Descrevemos aqui os diferentes componentes do sistema que permitiu reduzir o tempo necessário para atingir a configuração de gravação e substancialmente aumentar as chances de gravação com sucesso um grande número de neurónios em simultâneo.

Introdução

A capacidade de gravar e estimular vários sites com precisão micrômetro é extremamente útil para experimentalmente alcançar uma melhor compreensão dos sistemas neuronais. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para este fim, mas nenhuma permite a resolução submillivolt conseguida pela técnica de patch-clamp, essencial para o estudo da actividade de sublimiar e potenciais pós-sinápticos individuais. Aqui vamos cobrir o desenvolvimento de um sistema de patch-clamp assistida por computador doze eletrodo destinado a registar simultaneamente e estimular um grande número de células individuais com uma precisão suficiente para o estudo da conectividade neuronal. Embora muitas outras aplicações pode ser concebida para um tal sistema, que se presta especialmente bem para o estudo da conectividade sináptica dado que o número de ligações possíveis dentro de um grupo de neurónios aumenta proporcionalmente ao quadrado do número de neurónios em causa. Por conseguinte, enquanto um sistema com três eléctrodos permite testar oocorrência de até seis ligações e na maioria das vezes a gravação de um único, a gravação doze neurónios permite testar a ocorrência de até 132 ligações e frequentemente mais de uma dúzia de observação (Figura 1). A observação de dezenas de ligações simultaneamente torna possível analisar a organização de redes pequenas e inferir propriedades estatísticas da estrutura de rede que não pode ser de outra forma sondado ^1. Além disso, a estimulação precisa de numerosas células também permite a quantificação do recrutamento de células pós-sinápticas ^2.

Protocolo

1. Preparação Equipamento

1. Manipuladores de controle de um computador
   1. Conecte cada caixa controlador micromanipulador para um computador através de portas seriais (RS-232).
   2. Implementar os comandos para posicionamento, consulta e ajustar as configurações para ser enviado através da porta serial. Problemas de velocidade e compatibilidade de hardware Dado C / C + + é recomendada como a linguagem de programação.
   3. Padronizar o sistema de referência de modo a que os manipuladores de zero é a posição mais próxima possível no que diz respeito aos motores e movimento positivo é dirigido para fora a partir dos motores.
   4. Posicione o microscópio em sua posição central de 2 mm acima da amostra de plano focal (coordenadas [0, 0, 2000]).
   5. Loja, para cada manipulador, as coordenadas do local que permita que a ponta de uma pipeta a ser observada no centro do campo de visão do microscópio. Este é o ponto de referência inicial para cada eletrodo.
2. Visuaposições dos eletrodos Lize. Ele é muito útil para ser capaz de controlar a posição de cada eletrodo durante um experimento. A representação gráfica é a forma mais intuitiva de realizar isto. Para o efeito os sistemas de referência de cada eletrodo e que do microscópio deve ser correspondido. Uma maneira simples de fazer isso é:
   1. Traga a ponta de um eléctrodo para o centro do campo de visão.
   2. Guardar a posição de cada eixo do manipulador e cada eixo do microscópio.
   3. Executar com o eixo x do manipulador de um movimento relativamente grande (1 mm).
   4. Localize a ponta mais uma vez movendo-se apenas ao microscópio.
   5. Calcula-se a diferença na posição do microscópio, uma vez que foi passado medido. Estas são as projeções do movimento do eixo do eletrodo sobre o eixo do microscópio.
   6. Repita os passos de 2,3-2,5 para o Y e Z do manipulador eletrodo. Isto permite que uma matriz de projecções com o microscópio eixos a ser determinado ( Figura 2) também chamada matriz de co-seno:
      
   7. Inverter esta matriz para torná-lo possível calcular os movimentos, em três dimensões, necessários pelo manipulador eléctrodo para atingir uma dada posição no microscópio sistema de coordenadas:
      
   8. Usando o ponto inicial de referência e a matriz de co-seno determinar a posição de cada eléctrodo no microscópio coordenadas.
   9. Apresentar graficamente, com base no microscópio coordenadas, a posição de cada um dos eléctrodos em intervalos regulares. Optamos por usar C / C + + bibliotecas desenho (GDI +) para desenhar posições dos eletrodos a cada 40 milissegundos.
   10. Repita os passos 1.2.1 - 1.2.7 cada vez ângulos do manipulador são alteradas ou se são necessárias mudanças de posição de vários milímetros, por exemplo, quando o tipo de eletrodo é alterado.
3. Ativar o armazenamento do positions de características relevantes no tecido, como as células ou pontos de referência anatômicos, em microscópio coordena.
4. Adquirir vídeo e sobrepor informações relevantes.
   1. Mecanicamente alinhar o eixo-x de movimento do microscópio, com o eixo horizontal da câmara do microscópio.
   2. Instale no computador um framegrabber com vídeo ao vivo e capacidade de sobreposição e um kit de desenvolvimento de software (SDK).
   3. Implementar a operação de exibição de vídeo ao vivo com o SDK.
   4. Converter o sistema de coordenadas do microscópio para o sistema de referência da câmara pela tradução adequada e escamação.
   5. Desenhe as características relevantes em coordenadas de câmera e sobreposição no vídeo ao vivo a imagem resultante em intervalos regulares de cerca de 40 ms (Figura 3).
5. Amplificadores de controle.
   1. Use o software amplificador para controlar as configurações do amplificador da interface.
6. Control osciloscópios.
   1. Conecte os osciloscópios ao PC usando portas seriais.
   2. Determine a escala do osciloscópio, acoplamento e resolução temporal para as diferentes etapas do processo de patch-clamp em tensão-clamp (por exemplo, eletrodo na banheira, formação de selo, a configuração de célula inteira) e corrente-clamp.
   3. Envie os comandos de configuração do osciloscópio apropriadas sempre que os comandos de amplificação são emitidos a partir da interface.
7. Pressão pipeta de controle.
   1. Montar um sistema de controlo de pressão de acordo com a Figura 4.
      1. Use uma fonte de alimentação de 12 V / 5 V para fornecer a cada componente eletrônico de forma adequada.
      2. Ligue a saída de uma bomba de membrana para o buffer de pressão positiva (um recipiente de 100 ml).
      3. Ligar a entrada de uma bomba de membrana para o buffer de pressão negativa (um recipiente de 100 ml).
      4. Ligue o tubo porta-pipeta para um sensor de pressão no pressure sistema de controlo e uma válvula pneumática, que liga para o compartimento de pressão principal.
      5. Ligar cada um dos tampões de pressão para uma válvula ligada ao compartimento de pressão principal.
      6. Conectar uma válvula de pressão entre o compartimento principal e a atmosfera.
      7. Conectar um sensor de pressão para o compartimento de pressão principal.
      8. Conectar um sensor de pressão de cada tampão.
      9. Ligar o sistema de controlo de pressão de uma placa de aquisição de dados.
      10. Conecte cada sensor de pressão para uma entrada analógica.
      11. Conecte cada válvula para uma saída digital.
   2. Retirar deslocamento de todos os sensores, abrindo as válvulas excepto as ligar às bombas de membrana e subtraindo a medida de pressão à pressão atmosférica.
   3. Implementar o controle da pressão
      1. Definir na interface de um controle para ativar ou de-ativar o controle de pressão positiva para cada pipeta.
      2. Definir uma pressão positiva mínima para a pipetas de cerca de 70 mbar.
      3. Periodicamente (a cada 0,5 seg) detectar sempre que a pressão em pipetas sob controle de pressão ativo cai abaixo do limiar definido.
      4. Após a passagem da cabeceira abrir o tampão de pressão positiva para o compartimento de pressão principal e esse compartimento para a pipeta em questão durante períodos breves (20 ms) até que a pressão nas pipetas é acima do limiar. Feche todas as outras válvulas.
      5. De-ativar ainda mais o controle da pressão, como a aproximação final para uma célula de interesse é iniciada.
   4. Aplique uma pressão negativa para a formação selo
      1. Feche todas as válvulas e abra a válvula tampão pressão negativa em relação à pressão do compartimento principal e esse compartimento para a pipeta em questão para a duração do experimentador requer por manter um botão pressionado.
8. Centralize comandos para um dispositivo de interface humana.
   1. Conecte um wirele disponível comercialmentess gamepad para o PC.
   2. Implementar leitura de status de joystick. Por exemplo, usar as bibliotecas do DirectX para C / C + + para realizar leituras a cada 5 ms.
   3. Compare o estado atual com o estado anterior para detectar quais botões foram pressionado, liberado ou permanecer pressionado desde passo última vez.
   4. Atribuir funções a cada botão no gamepad. Um exemplo deste mapeamento é mostrado na Figura 5.

2. Patch-clamp Procedimento

1. Preparar as fatias de cérebro da região de interesse.
2. Coloque uma fatia do cérebro de interesse, com a região de interesse no centro da faixa de deslocamento do microscópio.
3. Seleção celular
   1. Identificar células de interesse por navegar com o microscópio. Guarde a posição das células com base no microscópio sistema de coordenadas com um direito do mouse clique sobre o monitor de vídeo ao vivo na parte superior da célula de interesse.
   A interface gráfica apresenta as células seleccionadas, assim como as micropipetas para uma visão geral e global do software irá adicionar um marcador na posição de célula que vai ser revestida sobre as imagens. Além disso uma imagem do celular é capturado para referência futura no arquivo 'celular #. Jpg'.

Atribuição de células para pipetas

1. Depois de selecionar as células de interesse, atribuir pipeta que irá gravar cada célula. A interface gráfica fornece controles de atribuição que deve ser definido. Visualize uma prévia da configuração final selecionando a opção 'Mostrar posições finais.
2. Selecione cada pipeta para que a pré-visualização posição final é desejado ou marque a caixa 'Selecionar tudo'. Desativar a exibição de posição atual para melhor visualização, se necessário.

Prepare as Pipettes

1. Encha as pipetas (6-8 mohms são geralmente melhor se muitas pipetas são usados) wiª solução intracelular e carregá-los em seus titulares. Coloque os headstages em suas fixações, mas não deslizar para a frente para evitar tocar o banho com a ponta da pipeta.
2. Ativar o controle de pressão positiva e selecione todas as pipetas para garantir que as dicas permanecerá limpo. Deslize com cuidado cada headstage no lugar.

Localizando as pontas de pipeta

1. Posicione o microscópio para uma posição central, com foco três milímetros acima da fatia, premindo o botão R2, mantendo o botão 'A'. Use a posição correspondente para cada manipulador como armazenado a partir da experiência anterior, premindo o botão L2, mantendo o botão A.
   Nota: Neste ponto não deve ser uma sombra distintivo de uma pipeta em vista ou um pequeno movimento ao longo do eixo da pipeta deve ser suficiente para observá-lo na maioria dos casos. Compensação para as pequenas diferenças na forma pipeta tem de ser realizada manualmente.
2. Traga a ponta da pipeta em foco. Coloque a ponta no ponto central de vermelho da exibição de vídeo, sem mover o microscópio (que ainda deve estar na posição [0, 0, 2000]).
3. Informar o software que a pipeta está no centro da tela, pressionando o botão Z, mantendo o botão C. Após cada ponta da pipeta está localizado, enviar essa pipeta para trás de modo que o seguinte pode ser localizado, premindo o botão L1, mantendo o botão A.

Aproximando-se as células

1. Uma vez que todas as pontas de pipetas foram localizados com precisão e cada pipeta é atribuída a uma célula, posicionar automaticamente as pipetas perto das suas respectivas células. Simplesmente clique com o botão direito no centro do grupo de células e selecione a opção 'cluster' no menu pop-up. Na janela de opções do cluster que irá aparecer, selecione todas as pipetas que deseja posicionar neste momento e clique em 'Vá com todas as pipetas verificados. Repita esta operação para cada conjunto de células de interesse.
2. Perform a aproximação final manualmente. A posição das pipetas relativos às células podem ser especificados de forma diferente, mas normalmente é simplesmente de 200 mM para longe da célula do eixo da pipeta e 200 um acima dela, em sentido vertical, o que é suficiente para manter a ponta da pipeta de fora do tecido . Aguarde até que o posicionamento das pipetas está acabado e mover o microscópio no sentido de uma pipeta, premindo o botão R1 enquanto pressiona o botão C.
3. Recalibrar cada posição pipeta, concentrando-se o microscópio sobre a sua ponta em qualquer lugar do monitor de vídeo e pressionando o botão B enquanto segura o botão C. A grade quadrada deve aparecer brevemente indicando a posição identificada da pipeta. Se a posição não está correta, posicione a ponta no ponto central da exibição de vídeo e pressione o botão Z, mantendo o botão C.

Estabelecer a configuração anexado à célula

1. Confirme se a célula de interesse para a pipeta atual é corretamentemarcado. Caso contrário, se mover ao microscópio para coincidir com a célula de interesse, com o ponto central vermelho. Marcar a célula pressionando o botão Y, mantendo botão C. Pressione L2, mantendo o botão C para posicionar a pipeta de 200 mM de distância de sua célula atribuído, o microscópio passará automaticamente para a posição correspondente.
2. Ajuste a posição da pipeta para que coincida com o ponto vermelho. Ajustar o deslocamento pressionando o botão R1 enquanto pressiona o botão X. pipeta
3. Ative o pulso de teste pressionando o botão L1, mantendo o botão X. aproximar lentamente a pipeta para sua célula atribuído.
4. Ao observar a formação de uma depressão na superfície da membrana da célula aplicam-se um breve pulso de pressão negativa, premindo o botão Y, mantendo o botão Z para permitir que a pressão aplicada para alcançar a célula. Um potencial de realização de cerca de-65mV deve estabelecida neste ponto pressionando o botão L2, mantendo o botão X.

A configuração de célula inteira

1. Uma vez que um Giga-selo é formado, para cada célula, começa ruptura das membranas pela aplicação de pressão negativa.

Realize gravações

1. Use o sistema de estimulação / aquisição para realizar as suas gravações. Aplicar pulsos ou trens de pulsos em uma célula individual em um tempo e observar as respostas sobre as células restantes para mapear a conectividade entre as células gravadas.

Recede pipetas

1. Uma vez que as gravações terminarem, recuar pipetas lentamente do tecido clicando com o botão direito do mouse no botão de rádio de mesa. Selecione "Recede-> Pipettes 500 mm 'para ter as pipetas recuar a uma curta distância ao longo de seus eixos. Observe a deriva no potencial das células (limpar as pontas, aplicando um pouco de pressão positiva pode ajudar).
2. Para diminuir pipetas todo o caminho de volta, definir a velocidade de posicionamento para 'Fast' e repetir a mesma operação, mas escolha a opção 'Todos'. Remover o usadopipetas, deslizando suavemente os headstages e desapertando as pipetas dos respectivos detentores. É útil para evitar torções titulares em suas órbitas pois isso pode interferir muito com a posição da ponta da pipeta.

Resultados

Seguindo os métodos descritos acima, conseguimos realizar a gravação de células inteiras de até doze neurônios simultaneamente, praticamente duplicando o maior número de neurónios em simultâneo, até agora fixada patch. Exemplos de redes de ligações sinápticas directas entre neurónios piramidais gravada na camada V do córtex somatossensorial de ratos são apresentados na Figura 6.

A determinação de perfis de probabilidade de ligação como função da distância inter-somática para...

Discussão

Uma questão imediata geralmente surge sobre a taxa de sucesso do procedimento foi descrito. Para altas taxas de sucesso preparação é essencial. Pipettes deve ter aberturas de ponta que são adequadas para os seres células gravadas. Filtração da solução intracelular para evitar pipetas entupidos também é importante. São impecáveis, pipetas acabadas de tirar são outra exigência. A distribuição binomial é o modelo mais simples que pode ser usado para entender como essas questões afetam o rendimento final. É razoável esperar...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio	Olympus	BX51WI	40X Manipuladores de Objetiva de Imersão
	Luigs Neumann	SM-5	Protocolo serial usado
Amplificadores	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK usado
Camera	Till Photonics	VS 55	Saída analógica BNC
Framegrabber	Tradução de dados	DT3120	SDK usado
Osciloscópios	Tektronix	TDS 2014	Comunicação serial
Aquisição de dados	InstruTECH	ITC 1600
Aquisição de dados	National Instruments	PCI-6221	Biblioteca usada (.dll)
Válvula de pressão	SMC	SMC070C-6BG-32
Sensor de pressão	Honeywell	24PCDFA6G
Membrana bomba	Schego	Optimal