A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Summary

Dois métodos complementares baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentadas, que permitem a quantificação, no nível de uma única célula, da dinâmica da expressão de genes induzidos pela activação de uma via de MAPK em levedura.

Abstract

A quantificação da expressão gênica no nível da célula única descobre novos mecanismos de regulação obscurecidos em medições realizadas a nível da população. Dois métodos baseados em citometria de fluxo e microscopia são apresentados para demonstrar a forma como esses dados podem ser adquiridos. A expressão de um repórter fluorescente induzida após a activação da MAPK alta osmolaridade glicerol via em levedura é usada como um exemplo. As vantagens específicas de cada método são realçados. A citometria de fluxo mede um grande número de células (10.000) e proporciona uma medida direta da dinâmica da expressão proteica independente da cinética de maturação lenta da proteína fluorescente. Imagiologia de células vivas por microscopia por contraste é limitada para a medição da forma amadurecida do repórter no menor número de células. No entanto, os conjuntos de dados gerados por esta técnica pode ser extremamente ricos graças às combinações de vários jornalistas e à informação espacial e temporalobtido a partir de células individuais. A combinação destes dois métodos de medição pode oferecer novos insights sobre a regulação da expressão de proteínas por vias de sinalização.

Introduction

A sinalização por meio de cascatas de transdução de muitas vezes termina com a expressão de proteínas. A caracterização desse perfil de expressão é um elemento chave para a compreensão da função das vias biológicas. A identificação do espectro de sobre-regulada de proteínas e sua dinâmica de activação pode ser alcançada por diversas técnicas, tais como as micro-matrizes, transferências de Northern ou Western blot ^1-3. No entanto, essas técnicas de média a resposta de uma população inteira de células. Para compreender a regulação fina da expressão de proteínas, é desejável reunir as medições ao nível da célula individual. O ideal é que estas medidas também ....

Protocol

1. Medidas Microscopia

1. Inocular 5 ml de meio sintético com levedura.
2. Crescer as células a 30 ° C durante a noite.
3. Medir a OD ₆₀₀ da cultura durante a noite a na manhã seguinte.
4. Dilui-se a cultura durante a noite em 5 ml de meio sintético de OD ₆₀₀ de 0,05.
5. Crescer a cultura diluída a 30 ° C durante pelo menos 4 horas.
6. Preparar 3 vezes concentrado (0,6 M) de NaCl em meio sintético.
7. Prepara-se uma solução de 1 mg / ml de Concanavalina A (ConA) em PBS.
8. Filtrado ~ 200 mL de solução para o poço de ConA corrediça.
9. Deixe descansar por 30 min.
10. Remover so....

Results

Microscopia

As células de levedura que ostentam a expressão repórter p-STL1 qV (ySP9 ⁷⁾ foram ligados ao fundo do poço de deslizamento e colocado sob o microscópio. As células foram estimuladas pela adição de meio de pressão directamente para dentro do poço, durante o decurso da sessão de imagem. Isso nos permite adquirir algumas imagens das células antes da indução da via e seguir o seu destino após a estimulação. No presente caso, as células foram seguidos durante ~ 2 hora.......

Discussion

Microscopia

O tratamento do poço com ConA é um passo essencial para assegurar uma imagem adequada das células. Porque ConA tem uma baixa solubilidade em PBS (5 mg / ml), o processo de filtração permite a remoção de grandes agregados que se encontram presentes na solução não filtrada e interferem com a imagem latente. Células prender de forma relativamente forte à superfície tratada e a adição da solução de indução não deve perturbar a localização das células, o que permite um acompanhamento con.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente
Levedura Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cicloheximida	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Tóxico
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quádruploV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quádruplo V enus
Material
Microscópio	Nikon	Ti-Eclipse
Software de controle de microscópio	Micro-manager	Ver 1.4.11
Câmara de incubação	LIS	The Box
Luz de fluorescência fonte	Lumencor	SpectraX
Câmera	Hamamatsu	Flash 4.0
Citômetro de fluxo	BD	FACS calibur
Sonicator banho	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tubo	BD Falcon	352054