Quantificação simultânea de celulares e extracelulares Componentes de biofilmes

Summary

Um protocolo para a quantificação e comparação simultânea de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes é apresentado. A metodologia envolve o uso de microscopia confocal de varredura a laser, software de análise e visualização estrutural de biofilme e software de análise estatística.

Abstract

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) é uma ferramenta poderosa para investigação de biofilmes. Muito poucas investigações quantificaram com sucesso a distribuição simultânea de mais de dois componentes dentro dos biofilmes porque: 1) a seleção de corantes fluorescentes com sobreposição espectral mínima é complicada e 2) a quantificação de múltiplos fluorocromos representa um problema multifatorial. Objectivos: Relate uma metodologia para quantificar e comparar distribuições tridimensionais simultâneas de três componentes celulares / extracelulares de biofilmes cultivados em substratos relevantes. Métodos: O método consiste em etapas distintas e interconectadas envolvendo crescimento de biofilme, coloração, imagem CLSM, análise e visualização estrutural de biofilme e análise estatística de parâmetros estruturais. Biofilmes de Streptococcus mutans (cepa UA159) foram cultivados por 48 horas em amostras estéreis de compósitos de resina Point 4 e TPH³. As amostras foram posteriormente imersas por 60 segundos em enxaguatórios bucais Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO) ou água (grupo controle; n = 5 / grupo). Os biofilmes foram corados com fluorocromos para substâncias poliméricas extracelulares, proteínas e ácidos nucléicos antes da imagem com CLSM. Os parâmetros estruturais do biofilme calculados usando o software de análise de imagens ISA3D foram o biovolume e a espessura média do biofilme. As análises estatísticas de modelos mistos compararam os parâmetros estruturais entre os grupos enxaguatório bucal e controle (software SAS; α=0,05). O software Volocity permitiu a visualização de distribuições 3D de componentes de biofilme sobrepostos (fluorocromos). Resultados: O BIO do enxaguatório bucal produziu estruturas de biofilme que diferiram significativamente do controle (p<0,05) em ambos os compósitos de resina, enquanto o LTO não produziu diferenças (p>0,05) em nenhum dos produtos. Conclusões: Esta metodologia quantificou e comparou de forma eficiente e bem-sucedida distribuições 3D simultâneas de três componentes principais dentro de biofilmes de S. mutans em substratos relevantes, superando assim dois desafios para a avaliação simultânea dos componentes do biofilme. Este método também pode ser usado para determinar a eficácia de agentes antibacterianos/anti-incrustantes contra vários componentes do biofilme, conforme mostrado usando enxaguatórios bucais. Além disso, este método tem ampla aplicação porque facilita a comparação de estruturas 3D / arquitetura de biofilmes em uma variedade de disciplinas.

Introduction

Os biofilmes são comunidades microbianas estruturadas que são encapsuladas em uma matriz extracelular autoproduzida e estão ligadas a superfícies biológicas ou inertes¹. Os biofilmes representam um estilo de vida comum para muitas bactérias e se formam pela transição em estágios de células flutuantes (planctônicas) para comunidades multiespécies complexas. A resistência inerente dos biofilmes aos agentes antimicrobianos está na raiz de muitas infecções bacterianas persistentes e crônicas^1,2, como demonstrado pelos biofilmes orais (placa dentária). Microrganismos cariogênicos, como estreptococos mutans, processam sacarose e outros carboidratos para produzir uma matriz extracelular e gerar ácidos que podem desmineralizar a estrutura dentária e causar cárie dentária. A maioria das matrizes de biofilme são biopolímeros constituídos por componentes celulares e extracelulares, como exopolissacarídeos (EPS), proteínas e ácidos nucléicos^3,4.

A microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), a técnica mais amplamente utilizada para imagens de fluorescência, transformou radicalmente a imagem óptica na biologia porque tem a capacidade de coletar imagens 3D de estruturas biológicas hidratadas sem fixação^5,6,7. Essa técnica não destrutiva envolve a coleta de imagens de seções finas dentro de uma região de interesse no espécime de tal maneira que a contribuição da luz fora de foco seja removida. A qualidade e a resolução das imagens capturadas pelo CLSM estão além do que é possível usar a microscopia de fluorescência de campo amplo. Uma grande desvantagem do CLSM é que a varredura de imagens ocorre em uma taxa mais lenta do que com técnicas de microscopia de campo amplo, nas quais imagens inteiras são coletadas simultaneamente⁵. No entanto, com uma seleção cada vez maior de fluorocromos, lasers e filtros, o CLSM tornou-se uma das técnicas predominantes para imagens multiespectrais^5,7.

Estudos anteriores mostraram que o CLSM é uma ferramenta útil para examinar a estrutura ou arquitetura de biofilmes usando uma ou duas marcas ou corantes fluorescentes para fornecer uma melhor compreensão da distribuição de EPS e células dentro dos biofilmes e, especialmente, dentro da matriz extracelular^7,8. Em teoria, a coloração/marcação fluorescente de vários componentes é desejável para explorar a estrutura detalhada e a colocalização de componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes. No entanto, a análise simultânea de vários componentes dentro dos biofilmes pode ser desafiadora porque: 1) a seleção de corantes fluorescentes com sobreposição espectral mínima é complicada e 2) a quantificação de múltiplos fluorocromos representa um problema multifatorial. A colocalização usando múltiplos fluorocromos requer o uso de colorações altamente específicas com interferência espectral mínima para evitar quaisquer efeitos de sangramento, que ocorrem quando dois fluorocromos têm sobreposição significativa em seu pico espectral, fazendo com que um seja mais fortemente excitado do que o outro⁹. Idealmente, fluorocromos com espectros de excitação que não se sobrepõem forneceriam os melhores resultados, no entanto, é muito difícil encontrar manchas que atendam a esse critério. Em vez disso, a seleção de manchas é otimizada pela escolha de fluorocromos cujos espectros de emissão têm sobreposição mínima, permitindo que as manchas sejam visualizadas uma a uma dentro de uma banda de comprimento de onda de observação limitada⁹.

A sobreposição de imagens de fluorescência é provavelmente o método mais amplamente utilizado para avaliar a distribuição simultânea de fluorocromos. A colocalização dos vários componentes aparece como uma sobreposição de cores diferentes por meio de múltiplos canais criados pelos fluorocromos que estão sendo examinados¹⁰. As ferramentas para exibir imagens de fluorescência de múltiplos canais como imagens coloridas mescladas estão disponíveis na maioria dos softwares CLSM e softwares de análise de imagens biológicas. Embora a sobreposição de imagens seja útil para a avaliação espacial da colocalização, as imagens só podem ser examinadas qualitativamente por análise visual. Isso fornece uma quantidade limitada de informações, pois essas representações geralmente não são úteis para quantificar a colocalização sob diferentes condições experimentais nem determinam se a colocalização excede a coincidência aleatória¹¹. Muito poucas investigações até agora usaram métodos quantitativos para analisar a estrutura tridimensional de biofilmes e componentes de biofilme, e menos ainda quantificaram o efeito de tratamentos antibacterianos ou medidas anti-incrustantes nos componentes do biofilme.

O objetivo deste estudo foi relatar uma metodologia para quantificação e comparação das distribuições tridimensionais concorrentes de três componentes celulares e extracelulares de biofilmes. O método consiste em etapas distintas, mas interconectadas, envolvendo crescimento de biofilme, coloração, imagem CLSM de biofilmes, análise e visualização estrutural de biofilme e análise estatística de parâmetros estruturais. O ensaio de crescimento de biofilme permite o crescimento de biofilme em substratos relevantes e produz estruturas de biofilme que são reprodutíveis. A combinação de novas colorações simultâneas de componentes de EPS, proteínas e ácidos nucléicos com a medição de parâmetros estruturais de biofilme 3D resulta em distribuições quantificáveis de componentes dentro de biofilmes. A análise estatística dos parâmetros estruturais do biofilme facilita a avaliação dos biofilmes em condições experimentais específicas (por exemplo, após tratamento com enxaguatórios bucais), conforme descrito na próxima seção.

Protocol

1. Preparação de meios e reagentes

1. Faça 300 ml de meio de cultura noturno (THY; 3% de caldo Todd Hewitt preparado de acordo com as instruções do fabricante suplementado com 0,3% de extrato de levedura em água ultrapura) e autoclave. Armazene em temperatura ambiente por até 2 meses.
2. Faça 1 L de ágar THY (3% de caldo Todd Hewitt, 0,3% de extrato de levedura e 1,5% de ágar em água ultrapura), autoclave e deixe esfriar a 60 ° C antes de despejar em placas de Petri. Conservar a 4 °C até 3 meses.
3. Faça 150 ml de meio de crescimento de biofilme (0,5X TY suplementado com 10 mM de sacarose; 1,5% de triptona, 0,5% de extrato de levedura e 10 mM de sacarose em água ultrapura) e esterilize com filtro. Armazene em temperatura ambiente por até 1 mês.
4. Faça 1 L de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ em água ultrapura) e autoclave. Armazene em temperatura ambiente por vários meses.
5. Faça 600 ml de tampão Tris HCl 10 mM suplementado com 10 mM CaCl₂ em água ultrapura (tampão TC; pH 7,2) e autoclave. Armazene em temperatura ambiente por vários meses.
6. Autoclave 1 L de água ultrapura. Armazene em temperatura ambiente por vários meses.

2. Fabricação de amostras

1. Fabrique amostras em forma de disco de compósitos de resina dentária Ponto 4 (PF) e TPH³ (TP) em um molde de aço inoxidável feito sob medida em dois incrementos. Cada incremento é fotopolimerizado por 40 segundos usando uma unidade de fotopolimerização LED. Os dois produtos têm composições e níveis de carga ligeiramente diferentes e, portanto, produzem diferentes topografias de superfície sobre as quais os biofilmes serão cultivados.
   1. Amostras de substratos relevantes podem ser fabricadas usando protocolos estabelecidos de outras disciplinas em vez da etapa 2.1.
2. Finalize e polir as amostras para um acabamento superficial final aceitável, por exemplo, usando um moedor-polidor semiautomático. Enxágue as amostras polidas com água ultrapura e seque com ar comprimido.
3. Esterilize as amostras usando gás óxido de etileno ou um método alternativo de esterilização.

3. Crescimento do biofilme

1. Inocular uma única colónia de S. mutans em 4 ml de meio de cultura durante a noite (passo 1.1). Incubar durante a noite a 37 °C durante 16-18 horas. A densidade óptica (OD₆₀₀) da cultura deve ser de ≥0,9.
   1. É melhor usar uma colônia de culturas de placas que foram passadas 2x de um estoque original, pois isso resulta em um crescimento de biofilme mais consistente.
2. Criar uma diluição de 1:100 utilizando a cultura durante a noite (etapa 1.1) em 10 ml de meio de biofilme (etapa 1.3).
3. Transfira amostras compostas de resina estéril (por exemplo, PF, TP) para placas estéreis de 12 poços.
4. Adicionar 2,5 ml de meio de cultura diluído (passo 3.2) aos alvéolos para tratamento (enxaguatório bucal) e grupos de controlo. Adicione 2,5 ml de meio de crescimento de biofilme estéril não inoculado aos alvéolos de controle de esterilidade.
5. Cultive os biofilmes em condições microaerofílicas. Coloque as placas em um shaker a 100 rpm dentro de uma incubadora a 37 ° C por 24 horas.
6. Após 24 horas, aspirar assepticamente o meio de todos os alvéolos e lavar duas vezes com PBS estéril (passo 1.4; 2,5 ml/alvéolo), aspirando o PBS após cada lavagem. Reabastecer 2,5 ml de meio de crescimento de biofilme fresco em cada alvéolo e incubar por mais 24 horas em condições idênticas às da etapa anterior, para um tempo total de crescimento do biofilme de 48 horas.
7. Em vez das etapas acima, biofilmes de outras espécies podem ser cultivados em substratos usando protocolos estabelecidos.

4. Tratamentos antibacterianos/enxaguatórios bucais

1. Aspirar o meio após o crescimento do biofilme estar completo.
2. Adicione 2,5 ml de enxaguatório bucal Biotène PBF (BIO) ou Listerine Total Care (LTO), ou outra modalidade de tratamento, em poços para os grupos de tratamento e adicione 2,5 ml de água ultrapura estéril ao poço do grupo de controle. Mergulhe as amostras por 60 segundos, de acordo com as instruções do fabricante, enquanto agita as placas em um agitador orbital a 150 rpm. Aspire imediatamente o enxaguatório bucal e a água ultrapura dos poços.
3. Lave as amostras 5x por 15 segundos por lavagem com água ultrapura estéril no agitador orbital a 150 rpm, aspirando água após cada etapa de lavagem.
4. Em vez das etapas acima, outros agentes antibacterianos podem ser testados usando protocolos estabelecidos.

5. Coloração

1. Prepare as diluições de corantes para análise de biofilme.
   1. Prepare uma solução-mãe de 5 mg/ml de Concanavalina A, conjugado Alexa Fluor 647 (AF) em bicarbonato de sódio 0,1 M pH 8,3. Conservar a -20 °C em alíquotas descartáveis durante vários meses, uma vez que não é aconselhável congelar e descongelar. Utilizando esta solução-mãe de AF, preparar uma diluição de 250 μg/ml em tampão TC.
   2. Preparar uma diluição de 10 μM utilizando a solução-mãe (SY) de 5 mM Syto 9, fornecida pelo fabricante, em tampão TC. Conservar a restante solução-mãe de SY a -20 °C durante vários meses.
   3. Prepare uma diluição de 10x usando a solução estoque (SR) de 5.000x Sypro Red, conforme fornecido pelo fabricante, em água ultrapura estéril. Conservar a restante solução-mãe de SR a -20 °C durante vários meses.
2. Lave todos os biofilmes 2x com tampão TC (2,5 ml/poço) usando um movimento de giro manual, permitindo que a segunda lavagem permaneça na placa por 30 min em temperatura ambiente. Aspire.
3. Coloque uma gota de 50 μl de coloração AF em cada amostra de biofilme. Manchar por 30 min em temperatura ambiente, protegido da luz. Lavar 2x com tampão TC (2,5 ml/poço), aspirando após cada lavagem.
4. Siga com uma gota de 50 μl de coloração SY em cada amostra de biofilme. Manchar por 30 min em temperatura ambiente, protegido da luz. Lavar 2x com água ultrapura estéril (2,5 ml/poço), aspirando após cada lavagem
5. Finalmente, coloque uma gota de 50 μl de coloração SR em cada amostra de biofilme. Manchar por 30 min em temperatura ambiente, protegido da luz. Lavar 3x com água ultrapura estéril (2,5 ml/poço), aspirando após cada lavagem.
6. Transfira as amostras para uma placa de 6 poços, colocando uma amostra por poço em 6 ml de água ultrapura estéril para facilitar a microscopia confocal.

6. Imagem usando microscopia confocal de varredura a laser

1. Adquira imagens de cada componente (coloração) dentro dos biofilmes dos grupos de tratamento e controle usando um microscópio confocal de varredura a laser configurações mostradas na Tabela 1. Utilizou-se neste estudo uma lente de mergulho 63X com abertura numérica de 0,9 e distância de trabalho de 2,2 mm.
   
   Tabela 1. Configurações do microscópio de varredura a laser confocal.

2. Defina o tamanho da varredura para 250 μm x 250 μm e uma resolução mínima de pixels de 512 x 512 para adquirir imagens CLSM em uma resolução adequada para análise quantitativa.
3. Use a coloração SY para definir os pontos superior e inferior da pilha de imagens de biofilme e, em seguida, defina a etapa z para ser adequada para análise quantitativa (0,6 μm para este estudo). Antes de coletar uma digitalização, otimize os parâmetros de imagem e mancha (ou seja, tensão e deslocamento PMT) usando a opção QLUT. Uma tabela de pesquisa de cores foi usada para atribuir pseudo-cores a cada coloração (verde para SY, vermelho para SR e azul para AF), a fim de tornar cada componente do biofilme mais distinguível na reconstrução 3D.
4. Colete imagens CLSM a 400 Hz usando varredura sequencial no modo "entre pilhas" para otimizar a captura de imagens de várias manchas no mesmo biofilme.

7. Análise Estrutural de Biofilme

1. Analise as imagens CLSM coletadas usando software de análise de imagem para biofilmes. As etapas a seguir descrevem o uso do software ISA3D¹² para calcular os parâmetros estruturais das imagens de biofilme coletadas.
   1. Copie os arquivos de imagem CLSM de cada biofilme para a pasta Imagens, conforme especificado no manual do software. Certifique-se de que a convenção de nomenclatura para arquivos CLSM exigida pelo software seja seguida. O software permite a análise de arquivos dentro de subpastas em modo de lote, facilitando assim a análise de biofilmes de grupo de tratamento e controle na mesma execução.
   2. Insira as dimensões dos eixos x, y e z das imagens CLSM nos campos dxy e dz da caixa de diálogo principal. Selecione as configurações de mapeamento de limiar e distância, conforme descrito no manual do software (Otsu e Quasi-Euclidean foram usados para este estudo, respectivamente). Insira um nome adequado para o arquivo de resultados e execute o programa. Um arquivo de resultados será produzido na pasta ISA.
   3. Visualize o arquivo de resultados para obter valores para vinte parâmetros estruturais 3D¹², como biovolume e espessura média do biofilme (medido neste estudo), que quantificam a distribuição 3D de cada componente (mancha) dentro do biofilme.

8. Visualização da estrutura do biofilme

1. Crie uma reconstrução de componentes sobrepostos (manchas) dentro de cada biofilme usando um software de análise de imagem. As etapas a seguir descrevem o uso do software Volocity para criar reconstruções 3D.
   1. Crie uma biblioteca para cada biofilme copiando arquivos de imagem CLSM para o software, conforme descrito no manual.
   2. Use a opção de menu Renderizador 3D para produzir uma imagem 3D reconstruída a partir das imagens CLSM de cada biofilme (o formato HR Opacity foi usado para este estudo).
   3. Gire a imagem 3D para orientar todos os biofilmes de maneira semelhante em relação aos eixos das coordenadas x, y e z. Capture um instantâneo da reconstrução do biofilme corretamente orientado e, em seguida, exporte o instantâneo em TIFF, JPEG ou outro formato adequado.
2. Realize a análise visual da distribuição simultânea de EPS, proteínas e componentes de ácidos nucleicos dentro de biofilmes nas imagens reconstruídas.
3. Use o coeficiente de correlação de Pearson e o coeficiente de sobreposição de Manders para realizar uma análise de colocalização de vários componentes do biofilme (a colocalização não foi medida neste estudo).

9. Análise estatística

1. Use análises estatísticas de modelos mistos separados para comparar os valores médios dos parâmetros estruturais entre os grupos de enxaguatório bucal e controle (α = 0,05). Para este estudo, foi utilizado o software SAS para realizar a análise estatística.

Results

Os resultados representativos para os tratamentos (enxaguatórios bucais) e o grupo controle não tratado são mostrados na Tabela 2 e nas Figuras 1 e 2. A Tabela 2 apresenta os valores médios e desvios-padrão dos parâmetros estruturais do biofilme biovolume (μm³) e espessura média do biofilme (μm) que foram calculados usando o software ISA3D. Os parâmetros estruturais dos biofilmes tratados com enxaguatório bucal que diferiram significativamente dos biofilmes do grupo controle (p<0,05) têm valores de média e desvio padrão destacados em vermelho. Os resultados das análises estatísticas dos modelos mistos demonstraram que o BIO de enxaguatório bucal produziu estruturas de biofilme que diferiram significativamente do controle (p<0,05) em ambos os compósitos de resina, enquanto o LTO de enxaguatório bucal não produziu diferenças significativas (p>0,05) em nenhum dos compósitos de resina. Os resultados mostram claramente que os componentes do biofilme celular e extracelular remanescentes após os dois tratamentos com enxaguatório bucal diferiram. Deve-se notar também que os biofilmes de S. mutans cultivados nos dois substratos (PF e TP) diferiram na estrutura 3D, embora tenham sido cultivados em condições semelhantes e ambos os substratos tenham sido polidos com abrasivos semelhantes.

A distribuição simultânea de EPS, proteínas e ácido nucléico dentro de biofilmes pode ser visualizada por meio das reconstruções 3D geradas usando o software Volocity. As Figuras 1 e 2 demonstram reconstruções representativas de biofilmes do grupo controle cultivados em compósitos de resina PF e TP, respectivamente. A coloração azul representa EPS dentro de biofilmes de S. mutans, a coloração verde demonstra ácidos nucléicos e a coloração vermelha mostra proteínas. O espaço intermediário pode ser ocupado por água ou outros componentes de biofilmes marcados não fluorescentes.

Figura 1. Uma reconstrução 3D representativa do biofilme de S. mutans cultivado em resina composta de PF no grupo controle (não tratado com enxaguatório bucal). A sobreposição simultânea das três colorações em um único biofilme permite a visualização simultânea de componentes de EPS (coloração azul), ácido nucléico (coloração verde) e proteína (coloração vermelha) dentro de biofilmes de S. mutans. (1 unidade = 24 μm). Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 2. Uma reconstrução 3D representativa do biofilme de S. mutans cultivado em compósito de resina TP no grupo controle (não tratado com enxaguatório bucal). A sobreposição simultânea das três colorações em um único biofilme permite a visualização simultânea de componentes de EPS (coloração azul), ácido nucléico (coloração verde) e proteína (coloração vermelha) dentro de biofilmes de S. mutans. (1 unidade = 24 μm). Clique aqui para ver a figura maior.

Compósito de resina Ponto 4 TPH3 enxaguante bucal componente BV (μm³) MT (μm) BV (μm³) MT (μm) Biotène PBF Ácidos nucléicos 279.517±53.291 9.32±2.80 195.033±42.014 7,45±3,70 Eps 344.902±56.386 35.22±17.19 197.840±62.351 9.83±7.26 Proteínas 298.796±62.868 54.21±21.65 216.033±66.654 24.33±39.64 Listerine Cuidado Total Ácidos nucléicos 355.707±110.444 26.45±14.21 273.296±47.323 13.43±2.89 Eps 494.099±180.592 64,90± 26,68 329.150±47.145 34.35±30.32 Proteínas 348.416±161.316 58.68±47.28 Rolamento 303.150±54.705 34.18±41.46 Controle (não tratado) Ácidos nucléicos 388.375±42.152 51.15±40.66 327.809±39.400 17.08±1.65 Eps Nº 660.448±173.197 91.37±74.84 Rolamento 363.850±67.612 28.33± 15.07 Proteínas Rolamento 517.274±119.475 127.96±73.84 353.161±56.518 21.17±4.41

Tabela 2. Valores médios e desvio-padrão do Biovolume (VB) e da espessura média do biofilme (MT) dos biofilmes tratados com BIO ou LTO, ou deixados sem tratamento (grupo controle). Os parâmetros estruturais dos biofilmes tratados com enxaguatórios bucais que diferiram significativamente dos biofilmes do grupo controle (p<0,05) têm valores de média e desvio padrão destacados em vermelho.

Discussion

A aquisição de imagens CLSM deve ser realizada da maneira e formato necessários para a quantificação de biofilmes e para análise de colocalização, de modo que a distribuição da intensidade do sinal em cada imagem seja uma representação confiável da distribuição de cada fluorocromo na pilha de biofilme. A intensidade do sinal deve ser distinguível do ruído e do fundo^10,11, não afetada pela autofluorescência do substrato e com sangramento mínimo devido à interferência espectral entre os fluorocromos usados¹¹. O ruído é uma limitação inevitável da microscopia de fluorescência¹¹, e a qualidade da imagem às vezes pode ser limitada por razões técnicas ou logísticas. A identificação de fluorocromos com sobreposição espectral mínima é fundamental para o sucesso desse método, mas pode ser complicada. Além disso, a quantificação de múltiplos fluorocromos representa um problema multifatorial. Portanto, não é surpreendente que muito poucas investigações tenham quantificado com sucesso a distribuição simultânea de mais de dois componentes dentro das estruturas dos biofilmes.

O objetivo deste estudo foi relatar uma metodologia que consiste em etapas distintas, mas interconectadas, para a quantificação e comparação das distribuições tridimensionais simultâneas de três componentes celulares e extracelulares dentro de biofilmes. O ensaio de crescimento de biofilme descrito permite o crescimento de biofilme em substratos relevantes e produz estruturas de biofilme que são reprodutíveis, conforme demonstrado pelos resultados relatados na Tabela 1. A combinação de novas colorações simultâneas de componentes de EPS, proteínas e ácidos nucléicos com a medição de parâmetros estruturais de biofilme 3D resulta em distribuições quantificáveis de componentes dentro de biofilmes. A análise visual qualitativa da distribuição simultânea de EPS, proteínas e ácidos nucléicos nos biofilmes é possível por meio da reconstrução de manchas sobrepostas em cada biofilme. O software ISA3D¹² contém vários parâmetros estruturais exclusivos, como dimensão fractal, homogeneidade e coeficiente de rugosidade do biofilme, além de parâmetros tradicionalmente medidos, como porosidade e espessura do biofilme, para melhorar a quantificação das estruturas 3D dos biofilmes. A análise estatística dos parâmetros estruturais do biofilme facilita comparações relevantes de biofilmes sob condições experimentais específicas, como eficácia antibacteriana/anti-incrustante (por exemplo, após tratamento com enxaguatórios bucais) ou ao longo do tempo (efeitos temporais).

Esta metodologia quantificou e comparou de forma eficiente e bem-sucedida as distribuições 3D simultâneas de três componentes principais dentro de biofilmes de S. mutans que foram cultivados em substratos relevantes, superando assim dois desafios para a avaliação simultânea dos componentes do biofilme. Este método também pode ser usado para determinar a eficácia de tratamentos antibacterianos ou medidas anti-incrustantes contra vários componentes do biofilme, conforme mostrado usando enxaguatórios bucais neste estudo. Além disso, a maioria dos protocolos descritos acima pode ser substituída por protocolos para a fabricação de substratos relevantes e ensaios de crescimento de biofilme de microrganismos relevantes. Portanto, este método tem ampla aplicação porque facilita a comparação de estruturas/arquitetura 3D de biofilmes in vitro e in vivo em uma variedade de disciplinas, incluindo ciências médicas, odontológicas, geológicas e marinhas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Caldo Bacto Todd Hewitt	Becton, Dickinson and Company	249240
Extrato de Levedura, EMD Granulado	Millipore	1.03753.0500
Bacto Triptona	Becton, Dickinson and Company	211705
OmniPur Sacarose	EMD Millipore	8510
Cloreto de Potássio, reagente ACS, 99.0-100.5%	Sigma-Aldrich	P3911-500G
Fosfato de Potássio, monobásico, ≥ 99,0%, reagente ACS	Sigma-Aldrich	P0662-500G
Cloreto de Sódio	Sigma-Aldrich	S9888-500G
Fosfato de Sódio, Monobásico, Monohidratado	EMD Millipore	SX0710-1
Tris (hidroximetil) aminometano, 99,8 +%, reagente ACS	Sigma-Aldrich	252859-500G
Concanavalina A, Alexa Fluor 647 Conjugado	Invitrogen	C21421
Syto 9	Invitrogen	S34854
Sypro Red	Invitrogen	S12012 ou S6653
Biotè ne PBF Enxaguante Oral	GlaxoSmithKline	N/A
Listerine Total Care	McNeil-PPC, Inc.	N/A