Potenciação de longo prazo da Via Perfurante-giro denteado Synapse em Livremente Comportando Ratos

Resumo

Modelos de camundongos transgênicos e knockout de doenças neurológicas são úteis para estudar o papel dos genes em neurofisiologia normal e anormal. Este artigo descreve metodologias que podem ser usados ​​para estudar a potenciação a longo prazo, um mecanismo celular que pode ser a base de aprendizagem e de memória, em transgénicos e knockout livremente comportando modelos de rato de neuropatologia.

Resumo

Estudos da potenciação de longa duração de eficácia sináptica, um fenômeno sináptica dependente de atividade que tem propriedades que o tornam atraente como um potencial mecanismo celular subjacente aprendizagem e armazenamento de informações, têm sido muito utilizados para elucidar a fisiologia de vários circuitos neuronais no hipocampo, amígdala e outras estruturas límbicas e corticais. Com isto em mente, os modelos de camundongos transgênicos de doenças neurológicas representam plataformas úteis para conduzir potenciação de longa duração (LTP) estudos para desenvolver uma maior compreensão do papel dos genes na comunicação sináptica normal e anormal em redes neuronais envolvidos na aprendizagem, emoção e informação processamento. Este artigo descreve as metodologias para indução de forma confiável LTP no rato comportando livremente. Estas metodologias podem ser utilizadas em estudos sobre transgênicos e knockout comportando livremente modelos do rato de doenças neurodegenerativas.

Introdução

O desenvolvimento da tecnologia para manipular genes produziu modelos de ratos transgênicos e knockout de quase todas as doenças neurodegenerativas e neurológicos. Isso exigiu a tradução de técnicas de pesquisa eletrofisiológicos anteriormente utilizados em espécies de roedores maiores para o modelo animal mouse. Uma tal técnica de investigação neurofisiológicos é o uso de potenciação de longo prazo (LTP), para testar a eficácia das conexões sinápticas nas redes neuronais envolvidas em várias doenças neuropatológicas. Este protocolo descreve técnicas para a investigação eletrofisiológica confiável de LTP em comportar livremente ratos. A vantagem deste protocolo sobre os outros é que é simples e fácil de implementar, é também um pouco menos dispendioso, uma vez que não requer nem a utilização de sistemas de micro-unidade caros controlados por computador nem transistor de efeito de campo headstages, e, para o nosso conhecimento, é o primeiro protocolo de vídeo de registros eletrofisiológicos crônicas to estudo LTP em comportar livremente ratos. Para este fim, descrevemos no artigo metodologias simples para estudar a potenciação a longo prazo em murganhos comportando livremente. Estas metodologias podem ser facilmente traduzido para modelos transgênicos e knockout rato de distúrbios neuropatológicos.

Protocolo

Este protocolo é apropriado para os ratinhos de 3 e 18 meses de idade e peso corporal aproximado de 30-50 g). Ratos podem ser obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Todos os protocolos cirúrgicos e experimentais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o Trinity College e estavam de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação Animal e Procedimentos Cirúrgicos

1. Prepare coquetel contendo anestesia de cetamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / mL) e acepromazina (0,5 mg / ml). Injectar 1 mL / kg de peso corporal no quadrante inferior direito do abdómen completada por injecções 0,2 ml / kg a cada 45 minutos depois disso a manter uma profundidade de anestesia estável utilizando o reflexo de retirada do pedal.
2. Prepare rato anestesiado para a cirurgia raspando a pele em seu crânio com um barbeador elétrico. A área raspada deve incluir no meio dos olhos para o meio das orelhas. Certifique-se de não fazer a barba a Whiskers como eles fazem parte do sistema sensorial barril mouse.
3. Use cotonetes para aplicar álcool isopropílico seguido de Betadine para a área raspada na cabeça. Em seguida, também usando cotonetes, aplicar uma pequena quantidade de óleo mineral sobre os olhos para evitar os globos oculares de secagem.
4. Use punhos da orelha de ratos infantis em vez de barras de ouvido regulares para montar a cabeça do animal sobre o aparelho quadro estereotáxico. Para fazer isso, a primeira montagem da orelha esquerda no punho da orelha esquerda. Então aliviar suavemente a orelha direita para a braçadeira direita, apoiando suavemente a cabeça do animal com uma mão e fazer avançar o manguito ouvido com a outra mão. Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento sob o corpo do animal e configurá-lo para 86 ° F para manter a temperatura corporal.
5. Em seguida, verifique se há rigidez bilateral ao tentar mover o lado da cabeça para o outro. O animal está correctamente montada na armação estereotáxica quando a cabeça é rígido e não pode ser movida de lado a lado, mas pode facilmente rodar para cima e para baixo.
6. Delicadamente, coloque ofocinho de rato na barra de nariz / dente montagem certificando-se que os incisivos estão descansando suavemente, mas de forma segura dentro da abertura da lâmina da barra nariz / dente.
7. Usando um bisturi estéril, fazer uma incisão na linha média a partir de meados dos olhos para o meio das orelhas. Certifique-se que o bisturi é ser realizada em um ângulo de 45 ° e aplicar pressão suficiente para cortar através da fáscia subjacente, mas não através do crânio como que vai causar sangramento excessivo.
8. Use cotonetes para separar a fáscia e expor o crânio. Crânio marcos bregma e lambda deve ser claramente visível (Figura 1A). Assegure-se que o animal se encontra na posição crânio plana, ajustando a barra de nariz / dente de tal modo que bregma e lambda são marcos na mesma posição do dorso-ventral (DV) (+ 0,1 mm).
9. Aplicar uma pequena quantidade de soro fisiológico estéril para a área exposta e usar cotonetes para limpar suavemente o crânio. Então espere 2-3 min para o crânio completamente o ar secoantes de prosseguir.
10. Montar uma agulha no braço estereotáxico esquerda para medir a posição de DV bregma e lambda. O posicionamento DV destes dois pontos de referência deve estar dentro de 0,1 milímetros um do outro. Se não, a barra de nariz da estrutura estereotáxica pode ser ajustado para cima e para baixo para alcançar este objectivo.
11. Posicione a agulha no bregma para gravar seu ântero-posterior (AP), lateral (LAT) e medições dorsoventral (DV). Verifique se a agulha toca apenas o crânio e não penetrá-la.
12. Use um mouse atlas do cérebro, tais como "O Rato do cérebro em estereotáxica Coordenadas" ^1, para determinar as coordenadas para as estruturas-alvo: medial via perfurante (MPP) no feixe angular e giro denteado (DG) do hipocampo, em relação a lambda e bregma, respectivamente (ver também Tabela 1). Em seguida, use uma caneta de ponta fina ou lápis para marcar esses pontos no crânio.
13. Além disso, marcar mais dois pontos no lado contralateral do crânio. Estes pontos which servirá de terra (GND) e de referência (REF) deve ser cerca de 3 mm a partir da linha média e posicionada longitudinalmente em relação umas às outras (Figura 1A, também a Tabela 1).
14. Retire o marcador agulha do braço estereotáxico esquerda e substituí-lo por uma broca dental elétrico equipado com um monte estereotáxica. Posicione a broca sobre cada ponto marcado e fazer pequenos furos rebarba de aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Quando a perfuração, use um movimento para cima e para baixo repetitivo e verificar com freqüência se a broca penetrou no crânio para expor a superfície do cérebro.
15. Delicadamente, mas com firmeza, dirigir um eletrodo parafuso (# 0-80 1/8 em parafusos de aço inoxidável, com fenda cabeça oval) em cada um dos buracos contralateral (GND e REF) de tal forma que apenas tocar a superfície cortical, sem penetrá-lo (Figura 1A ). Estes dois eletrodos parafuso servir como base e referência.
16. Mount estimulantes e gravação eletrodos em electrode titulares nos braços estereotáxica esquerdo e direito, respectivamente.
17. Conecte os terminais do eletrodo estimulando a um estimulador eletrofisiológico com isolamento atual e do terminal de eletrodo de registro a um amplificador diferencial eletrofisiológico (ganho = 1.000, filtro de banda = 1 Hz-3 kHz) e, em seguida, para um osciloscópio digital para inspeção visual de respostas evocadas. Além disso, conecte GND e terminais do eletrodo REF para o amplificador diferencial.
18. Suavemente e abaixe lentamente tanto estimulante e eletrodos de registro em incrementos de 0,5 mm enquanto monitorando visualmente a resposta evocada a um choque de estímulo 600-800 uA. Continue a baixar cada um dos eléctrodos, até que eles atinjam a sua posição respectiva DV-alvo e um sinal estereotipado é observado no osciloscópio (Figura 1B).
19. Depois disso, use cimento acrílico dental para fazer uma tampa para manter os terminais do eletrodo no lugar, qualquer cimento odontológico que toca a pele deve ser apagadoimediatamente. Uma vez que o cimento dentário é completamente curado transferir o animal a partir do quadro estereotáxico para uma gaiola limpa roedor. Use uma lâmpada de aquecimento ou uma almofada para manter a temperatura do núcleo.
20. Monitorar o animal a cada hora até que ele recupere a consciência. Uma injecção de flunixina pode ser administrado como um analgésico.

2. LTP Indução

1. Permitir que o animal de 5-7 dias para se recuperar da cirurgia. Colocar o animal no meio de gravação que consiste de uma gaiola de Faraday (122 centímetros x 43 cm x 43 cm) equipadas com material de isolamento acústico e de um comutador rotativo 5-canal que liga o eléctrodo leva à configuração estimulante / gravação.
2. Permitir que o animal se adapte para 1-2 horas no ambiente de gravação antes de conectar os eletrodos para os instrumentos de estímulo e de gravação (consulte a etapa 1.17).
3. Defina os controles de estimulador para a saída de 400 uA e registrar a amplitude de uma média de 10 respostas evocadas certificando-them pelo menos 10 seg decorrer entre estímulos. Usar o método mostrado na Figura 1C para quantificar a resposta evocada. Repita este procedimento para 600, 800, 1.000, 1.200, e 1.400 uA.
4. Construir uma curva de entrada / saída traçando a amplitude média da resposta evocada versus intensidade de estímulo. A partir deste gráfico determinar a intensidade de estímulo que corresponde a 50% da amplitude máxima de medida. Utilizar a intensidade de 50% para o restante da experiência.
5. Em seguida, utilizando a intensidade do estímulo de 50%, se obter uma linha de base através da gravação da amplitude média de 5 respostas evocadas a cada minuto durante 15 min. Mais uma vez certifique-se de que pelo menos 10 seg decorrer entre estímulos.
6. Posteriormente entregar a estimulação tetânica composto por 10 rajadas de 10 pulsos entregues a 400 Hz com uma taxa de disparo de 5 Hz para a via perfurante medial. Monitorar o animal de perto para sinais de apreensão, incluindo shakes cachorro molhado. Se o animal tem uma convulsão a experiment deve ser encerrado e todos os dados de que animal deve ser excluída dos resultados do estudo.
7. Em seguida, continuar a gravar a amplitude média de 5 respostas evocadas a cada minuto por 30 min posttetanization. Depois disso, comparar esta amplitude à amplitude da linha de base obtido no passo 2.5 calculando a percentagem de alteração a partir da linha de base (Fig. 2).
8. Após a conclusão de experimentos, o animal é sacrificado por meio de inalação de isoflurano, um método que é consistente com as orientações sobre eutanásia da American Veterinary Medical Association.

Resultados

A Tabela 1 mostra as coordenadas para DG e MPP, usado neste protocolo Figura 1A apresenta as marcações para as estruturas alvo no crânio;.. Também são indicados a localização da terra e eletrodos de referência Figura 1B ilustra representante resposta evocada traça tanto pre- e posttetanization no mesmo animal. Note-se que a resposta evocada posttetanization é maior do que a resposta pretetanization que é indicativa de indução de LTP ^2. Figura 1C

Discussão

Neste protocolo, demonstramos um método simples e confiável para o estudo de LTP em DG em ratos comportando livremente. Enquanto muitos estudos de LTP em ratos acordados foram realizados ^3,4, muito poucos têm sido realizados em ratos acordados, principalmente devido à complexidade técnica colocado pela imobiliária craniana limitada em ratos eo peso do headstages eletrodo em relação ao peso médio de camundongos ^5. Os poucos estudos que demonstraram LTP na DG em comportar livremente camundongos utili...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cetamina (100 mg/ml)	Henry Schein	10177
Xilazina (20 mg/ml)	Henry Schein	33197
Acepromazina (10 mg/ml)	Henry Schein	2177
Pó acrílico dental	Lang Dental Manufacturing Co.	1330CLR
Dental acrílico líquido	Lang Dental Manufacturing Co.	1306CLR
Fio de tungstênio (0,127 mm)	World Precision Instruments	TGW0515
Tubo hipodérmico de aço inoxidável (0,286 mm)	World Precision Instruments	832400
Flunixin (50 mg/ml)	Henry Schein	14165
Epoxilyte	Superior Essex	EP 6001-M
Inserção de fio de aço inoxidável (0,2 mm)	Mundo Precision Instruments	792900
Aparelho de armação estereotáxica	Kopf Instruments	Modelo 902
Ear cuffs (fones de ouvido)	Kopf Instruments	Modelo 921
Estimulador eletrofisiológico	Astro-Med, Inc.	Osciloscópio digital S88
	B K Precision Corp.	2542
Unidade de isolamento atual	Astro-Med, Inc.	Amplificador diferencial PSIU-6
	World Precision Instruments, Inc.	DAM-50
Comutador	Plásticos Uma	SLC6
	Stoelting	58650

Broca Dental