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Artigo de método

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DOI:

10.3791/50644

⸱

19 de outubro de 2013

 , 
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Neste artigo

Resumo

O peixe-zebra, um pequeno peixe tropical, tornou-se um modelo popular para estudar a função do gene durante o desenvolvimento de vertebrados e doença. A expressão espacial e temporal dos genes alvo pode ser determinada pela In situ Hibridação. Nosso protocolo melhorado permite a detecção de transcritos abundantes de baixo com baixo sinal de fundo não específico.

Resumo

Este artigo incide sobre todo o monte de hibridização in situ (desejo) de embriões de peixe-zebra. A tecnologia VONTADE facilita a avaliação da expressão do gene, tanto em termos de distribuição do tecido e fase de desenvolvimento. Protocolos são descritas pela utilização de desejo dos embriões de peixe-zebra utilizando sondas de ARN anti-sentido marcadas com digoxigenina. As sondas são gerados através da incorporação de nucleótidos ligados com digoxigenina, através de transcrição in vitro de modelos de genes que foram clonados e linearizado. Os córions de embriões colhidos em estádios de desenvolvimento definidos são removidos antes da incubação com sondas específicas. Seguindo um processo de lavagem para remover o excesso de sonda, os embriões foram incubados com o anticorpo anti-digoxigenina conjugado com fosfatase alcalina. Com o emprego de um substrato cromogénico para a fosfatase alcalina, a expressão do gene específico pode ser avaliada. Dependendo do nível de expressão do gene de todo o processo pode ser completado dentro de 2-3 dias.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um poderoso modelo animal para o estudo do desenvolvimento dos vertebrados, a doença, o comportamento e no rastreio de drogas 1-3. Embriões de peixe-zebra pode ser obtido em grandes quantidades a partir de um único cruzamento. Fertilização e desenvolvimento ocorre ex utero e os embriões opticamente claras desenvolver rapidamente. Eventos críticos de desenvolvimento ocorrem durante as primeiras 48 horas pós-fertilização (hpf). Isto inclui o aparecimento de órgão primórdios e o início de citodiferenciação. Knockdown ou sobre-expressão de proteínas pode ser alcançada através da microinjecção de embriões com anti-sentido morfolino (MO), os oligonucleótidos ou ARNm, respectivamente, no estádio de uma ou duas células (0,75 HPF).

O desejo de embriões zebrafish facilita o estudo da expressão espaço-temporal de genes específicos de interesse. Aplicação da técnica DESEJO seguindo microinjeção de embriões com mRNA ou MO para o excesso de express ou os níveis de proteína específicas knockdown revela regulação diferencial de outros genes.

As mudanças nos padrões de expressão de genes pode ser correlacionada com as alterações fenotípicas e revelar a função de genes alvo durante a organogénese precoce. Uma vez que as sondas podem ser preparadas e armazenadas de antemão, a técnica pode ser aplicada a ISH para revelar os padrões de expressão de genes para pelo menos 20 genes de cada vez utilizando placas de seis poços e fizeram cestas personalizadas.

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Protocolo

1. Todo-mount Hibridização In Situ de embriões Zebrafish

1.1 Preparação de Embriões

  1. Coletar embriões em estágios de desenvolvimento necessários. Por favor, veja Kimmel et al. 5 para descrição estágio embrionário.
  2. Remover córions manualmente usando uma pinça (Dumont Relojoeiros Fórceps não. 5).
  3. Fix embriões em uma solução a 4% de paraformaldeído (PFA), composto em PBS (Tampão fosfato salino) durante a noite a 4 ° C.
  4. Lavar embriões com PBS, pelo menos 3 x durante 5 min cada, à temperatura ambiente.
  5. Loja embriões em 100% de metanol (MeOH) à temperatura de -20 ° C até ser utilizado para a futura aplicação de técnicas, incluindo todo o monte de hibridação in situ.
  6. Congelar embriões encenado em nitrogênio líquido para extração e armazenamento de RNA a -80 ° C.
  7. Extrair o RNA a partir de embriões encenado e sintetizar ADNc para amplificação por PCR e clonagem subsequente.

1.2 Síntese de sondas de RNA marcadas com digoxigenina

  1. Amplificação por PCR e clonagem de genes para o modelo da sonda. Reacção de PCR instalação com volume total de 50 ul, como mostrado na Tabela 1. É mais DNA genómico ou de cDNA menos na reacção de PCR como molde. Incluir 10 min tempo de extensão a 72 ° C após o último ciclo de certificar-se de que os produtos da reacção de PCR são de comprimento completo e 3 'adenilada, a fim de facilitar a clonagem TOPO.
Reagente Volume
Molde de ADN 100 ng
PCR Buffer (10x) 5 ul
de dNTP (10 mM) 2 ul
Os iniciadores (10 mM) 1 uM cada
Adicionar água para um volume final de 49,7 mL
Taq polimerase (5 unidades / & #956, l) 0,3 mL
Volume de reação 50 ul

Tabela 1. Reacção de amplificação por PCR.

  1. Verificar se o tamanho do produto de PCR utilizando electroforese em gel de agarose. O tamanho estimado do produto de PCR para a síntese da sonda está próximo de 1 kb.
  2. Tome especial cuidado para evitar a contaminação nuclease realizando o experimento em condições estéreis e usar água livre de nuclease. No caso de produtos múltiplos são observados, purificar em gel do produto de PCR de tamanho apropriado antes de prosseguir com a clonagem TOPO, utilizando o Kit de Clonagem TA. Optimizar a reacção de PCR para a eliminar o aparecimento de manchas e de múltiplas bandas.
  3. Realizar a reacção a clonagem TOPO, tal como indicado na Tabela 2. Combinar TOPO Vetor e produto de PCR e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
Reagente As células quimicamente competentes Células competentes Electro Produto da reacção de PCR fresco 1-4 mL 1-4 mL Solução Salina 1 ul Solução Salina diluído 1 ul Água Até ao volume total de 5 ul Até ao volume total de 5 ul TOPO vector 1 ul 1 ul Volume final 6 mL 6 mL

Tabela 2. Reacção clonagem TOPO.

  1. Incorporar / introduzir o produto de clonagem TOPO em um células competentes tiro. To processo é chamado de transformação.
  2. Incubar as células transformadas a 37 ° C durante pelo menos 1 hora a 260 rpm para garantir a expressão dos genes de resistência a antibióticos. Placa da mistura de transformação (50-100 ul) em pré-aquecido Luria Bertani (LB), as placas de agar contendo 50 ug / ml de ampicilina e X-gal. Incubar a 37 ° C durante a noite.
  3. Determinar a presença do inserto com base no aparecimento de colónias brancas ou luz azul. O vector TOPO contém o gene lacZ que codifica β-galactosidase. Na presença de X-gal, a produção de β-galactosidase de forma a cor azul. DNA ligado no plasmídeo perturba a formação de β-galactosidase e as colónias brancas funcionais são produzidos. As colónias brancas ou luz colónias azuis confirmar a presença da inserção.
  4. Escolha as colónias brancas a partir da placa de ágar utilizando pontas de pipetas estéreis e colocá-las no tubo estéril de 10 mL contendo 4 mL de meio LB e a cultura a 37 ° C na incubadora agitaçãotor durante a noite a 200 rpm.
  5. Purifica-se o ADN de plasmídeo utilizando o kit de ADN de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Linearizar ADNc seguinte de purificação de plasmídeo por digestão de 5 ug de ADNc para cada sonda com a enzima de restrição apropriada que tem um único sítio, localizado a 3 '(para as sondas de sentido) ou 5' (para sondas anti-sentido) para a inserção.
  7. Purifica-se o ADN linear utilizando o método de extracção com fenol / clorofórmio. Adicionar um volume igual de rotação com fenol / clorofórmio, o vértice vigorosamente durante 30 segundos, durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir a fase aquosa superior tubo limpo e adicionar um volume igual de clorofórmio. Girar durante 3 minutos a 13.000 rpm a 4 ° C. Transferir a fase aquosa superior tubo limpo. Adicionar acetato de sódio a 10% (3 M) e 2,5 vezes o volume de etanol a 100% para precipitar o ADN e armazenar a -20 ° C durante a noite. Girar durante 15 min a 13.000 rpm a 4 ° C. Remover o etanol e lavar o sedimento com etanol a 75%. O protocolo pode ser parada e o DNA pode ser stored a -20 ° C, é reiniciada no dia seguinte. Girar durante 10 min a 10.000 rpm a 4 ° C. Remover o sobrenadante e secar cuidadosamente a pelete durante 2 minutos à temperatura ambiente. Ressuspender o sedimento em 10 mL de água tratada com DEPC e incubar a 55 ° C durante 20 min. Quantificar a concentração de ADN usando o espectrofotômetro UV.
  8. Avaliar a pureza por electroforese em gel de agarose utilizando 1 fil de DNA em gel de agarose a 1% e que funciona para cerca de 30 min.
  9. Configure reacção de marcação RNA. Utilizando um frasco de reacção livre de RNase, adicionar 1-5 ug de ADN purificado a estéril, livre de RNase, água bidestilada tratada com DEPC para um volume de 13 ul. Resfriar o tubo de reação sobre o gelo e adicione os seguintes reagentes (ver Tabela 3):
Reagente Volume
NTP mistura rotulagem (10x) 2 ul
Lustre Transcriçãoer (10x) 2 ul
Protector de inibidor de RNase 1 ul
RNA polimerase SP6 ou
RNA polimerase T7 2 ul
Volume final 20 ul

Tabela 3. Reacção de marcação de ARN.

  1. Misturar suavemente, em seguida, o reagente de recolha na parte inferior de uma breve centrifugação a 2.000 rpm durante 30 segundos à temperatura ambiente e incubam-se a mistura de reacção durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Remover o ADN molde por adição de 2 ul de ARNase isento de ADNase I. Incubar durante 30 min a 37 ° C e parar a reacção por adição de 2 ul de 0,2 M EDTA (pH 8,0).
  3. Precipitar os produtos da reacção por adição de 2,5 mL de LiCl 4M e 100 ul de etanol 75%. Misturar a solução e manter a -20 ° C durante 45 min or armazenada a -20 ° C durante a noite e o protocolo é reiniciada no dia seguinte.
  4. Centrifugar a suspensão durante 30 min a 13.000 rpm a 4 ° C, em seguida lavar o sedimento com 500 ul de etanol a 70% conservado a -20 ° C, centrifugar durante mais 10 minutos, seco durante 2 minutos, e voltar a suspender em 50 ul e incubar aos 30 min, a 37 ° C.
  5. Verifique a qualidade da sonda e integridade executando 1-2 ml em gel de agarose 1% para cerca de 30 min. Isto é confirmado pela presença de um único produto executado no tamanho esperado para o gel.
  6. Quantificar a concentração da sonda através da medição da quantidade de RNA usando espectrofotometria. O rendimento desta reacção é de cerca de 10 ug de ARN (100-200 ng / ul).

1.3 Todo-mount Hibridização In Situ

  1. DIA 1
    1. Reidratação
      1. Prepare cestas usando malha de nylon (menos de 1 mm tamanho dos poros) e tubos Eppendorf. Construa as cestas por cutting tubos Eppendorf (1,5 ml) para remover as extremidades cónicas. Para identificar cestas individuais usam diferentes tubos coloridos e remova a parte superior jantes de metade deles.
      2. Corte pequenos pedaços de malha de nylon para cobrir as extremidades do corte dos tubos Eppendorf. Cole as extremidades de corte dos tubos para a malha de nylon, aquecendo-os em um prato quente elétrico (conjunto entre médio e alto) em um exaustor. Depois arrefeceu-se remover o excesso de malha de nylon dos cestos e armazená-los em 100% de metanol, à temperatura ambiente.
      3. Preparar diluições sucessivas de metanol em PBS (75% [vol / vol [metanol, a 50% [vol / vol] de metanol e 25% [vol / vol] de metanol) utilizando os primeiros três poços das placas de seis poços, seguido por 100% PBST (solução salina tamponada com fosfato contendo 0,1% de Tween-20) durante os próximos três poços.
      4. Assunto embriões in loco o processo de hibridação com os cestos feitos sob encomenda, como mostrado na Figurea 1a e b. Utilizar soluções RNase até a hibridizaçãopasso ção em placas de 6 poços (4 mL / poço). Para alcançar este objectivo, o lugar até 6 cestos no primeiro poço. Cesta lugar com borda em primeiro lugar seguido por cestas sem bordas em cores diferentes dispostas consecutivamente. Usando este regime de até 6 padrões de expressão genética pode ser determinado simultaneamente.
      5. Coloque embriões desidratados do mesmo estágio de desenvolvimento para a mesma cesta (ver Figura 1).
      6. Rehidratar embriões movendo cestas de um poço na placa de seis poços com o seguinte (5 minutos para cada etapa). Use seis poços cheios com tampão apropriado. Os embriões são submetidos a uma vez cada diluição. Desta forma os embriões são lavados 6x, 5 min / lavagem. Reidratação dos embriões desidratados é alcançado através da substituição de metanol com PBS e, em seguida, por lavagem 3x com PBST 100%.
    2. Permeabilização Digest os embriões reidratado com proteinase K (10 ug / ml) à temperatura ambiente para tornar os tecidos permeáveis, como mostrado na Tabela 4 .
      Fase embrionária (horas após a fertilização) Período de digestão (Proteinase K)
      Até 6 15 seg
      6-12 30 seg
      12-18 3 min
      24 12-15 min
      48 25-30 min
      72 40 min
      96-120 50 min

      Tabela 4. Reacção permeabilização.

    3. Postfixation e PBST Lava
      1. Fix embriões por incubação em paraformaldeído a 4% (p / vol) em 1x PBS, durante 20 min.
      2. Remover paraformaldeído residual por lavagem 3x embriões, 5 min / lavagem em PBST 1x.
    4. A acetilação Preparar a mistura de acetilação (125 ul de trietanolamina e 27 ul de anidrido acético em 10 ml de ddH 2 O) e os embriões a incubar duas vezes durante 10 minutos cada. Para minimizar a atividade de fosfatase endógena, prepare a mistura de acetilação fresco quando necessário. Para remover o excesso de reagentes, os embriões lavar duas vezes em PBST (10 min / lavagem)
    5. A pré-hibridação Prehybridize embriões por transferência de embriões a partir de cestas de 1,5 ml tubos Eppendorf estéreis e incubação com 200 mL mistura de hibridização por 2-4 horas em um banho de 70 ° C de água.
    6. De pré-adsorção do anticorpo remover cerca de 50 embriões dos cestos e transferi-las para um tubo Eppendorf de 1,5 ml estéreis. Incubar com anticorpo anti-DIG-AP (1:500) do anticorpo utilizando um tampão de bloqueio (1x PBST, 2% de soro de vitela [vol / vol], 2 mg / ml de albumina de soro bovino [BSA]) à temperatura ambiente durante 2-4 horas, e armazenar a 4 ° C durante a noite. Remover da incubadora na manhã umad permitir embriões atingir a temperatura ambiente.
    7. A hibridação Adicionar 100-200 ng de sonda para os embriões pré-hibridizados e incubar durante a noite a 70 ° C em banho-maria.
  2. DIA 2
    1. SSC (Citrato de Saline de sódio) Lavagens
      1. Colocar tubos de 50 ml da mistura de hibridização (HM), 2x SSC e 0,2 x SSC, num copo com água num banho de 70 ° C e a água aquecida previamente durante pelo menos 20 min. Remover a mistura da reacção de hibridação contendo a sonda, adicionar 1 ml de mistura de hibridação pré-aquecido para os tubos e incubar durante 15 min a 70 ° C. Encha as placas de seis poços, com várias diluições de HM pré-aquecido em 2x SSC, substituindo o HM 100% através de 50% a 25% de HM para remover o excesso de reagentes.
      2. Enquanto espera, encher placas de seis poços com 2x SSC durante as lavagens e mantê-los a 70 ° C.
      3. Após 15 min lugar os embriões a partir do tubo para as cestas mantido na placa seis bem cheio com a diluiçãos de HM com 2x SSC e lavar os embriões hibridadas movendo o carrinho de um poço para o outro (15 min cada em um banho de água a 70 ° C). Lavar embriões 2x, 15 min / lavagem, em 100% de 2x SSC a 70 ° C.
      4. Conjunto outro banho-maria a 65 ° C. Encha as placas de seis poços com 0,2 x SSC durante elevado rigor lavagens para evitar a hibridação inespecífica de transcrição com a sonda.
      5. Depois, os embriões são lavados duas vezes com 2x SSC a 70 ° C, segui mais duas lavagens de 30 min em 0,2 x SSC a 65 ° C.
    2. Lavagens PBST Prepara placas de seis poços, com diluições sucessivas de 0,2 x SSC em PBST, como segue: 75% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) de 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0.2x SSC, e os restantes dois poços com 100% PBST. Lavar os embriões hibridadas movendo o carrinho de um poço para o outro (5 minutos para cada etapa, à temperatura ambiente, utilizando um balancim).
    3. A pré-incubação de embriões pré-incubar durante 3-4 horas à temperatura ambiente em blotampão cking (1x PBST, 2% de soro de vitela [vol / vol], 2 mg / ml de BSA).
    4. A incubação com anticorpo anti-DIG embriões Incubar com uma solução de anticorpo anti-DIG-AP (1:5000) em tampão durante a noite a 4 ° C com agitação suave bloqueio.
  3. DIA 3
    1. Lavagens PBST Preparar as placas de seis poços com 4 ml / poço PBST. Lavar incubados embriões movendo os cestos na placa de seis poços contendo PBST 6x, por períodos de 15 min. Os embriões podem ser armazenadas a 4 ° C e o protocolo é reiniciada no dia seguinte.
    2. Prestaining Prestain os embriões por lavagem 2x durante 15 min com prestaining tampão à temperatura ambiente com agitação suave, antes da incubação na presença de BCIP (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo) e NBT (nitroazul de tetrazólio). BCIP e NBT são os substratos utilizados para o desenvolvimento da cor da actividade da fosfatase alcalina. Uma vez que as sondas são presos com fosfatase alcalina ªe desenvolvimento de cor púrpura indica a expressão do gene alvo. Os embriões podem ser armazenadas a 4 ° C e o protocolo é reiniciada no dia seguinte.
    3. Coloração
      1. Incubar embriões à temperatura ambiente, no escuro, com BCIP e NBT durante 30 min.
      2. Monitorar a reação de coloração a cada 30 minutos usando um microscópio estereoscópico. Os tempos de reacção variam de 15 min-16 h, dependendo do nível de expressão do gene. Os tempos de resposta mais curtos para genes altamente expressos e mais tempo para genes fracamente expressas. Sentido de sondas irá detectar o sinal, se o gene de interesse expressa anti-sentido complementar (AS) transcrições.
    4. Parar a reacção depois de a intensidade da coloração desejada é alcançada, parar a reacção por transferência de cestos contendo embriões a poços contendo a solução de paragem (1x PBS, pH 5,5, EDTA 1 mM, 0,1% de Tween). Isso irá evitar o desenvolvimento da cor. Enxágüe os embriões para 10 min 2x em um roqueiro com suave agacreditação à temperatura ambiente.
    5. Postfixation
      1. Incubar os embriões em paraformaldeído a 4% (p / vol) em PBS durante 20 min.
      2. Lavar os embriões (5 minutos / lavagem), três vezes com PBST de forma a remover paraformaldeído residual. Armazenar os embriões fixados em solução de parada no escuro a 4 ° C.
    6. Montagem, observação e aquisição de imagens
      1. Transferir os embriões numa placa de seis poços, contendo 100% de glicerol usando o volume mínimo possível de PBS. Colocar a placa de seis poços em um balancim e agitar suavemente durante a noite à temperatura ambiente no escuro.
      2. Coloque embriões em 100% de glicerol e, em seguida, observar o sinal sob um microscópio estereoscópico.
      3. Aquisição de Imagens e salvar como formato de arquivo TIFF ou qualquer outro tipo que permite a produção de imagens de alta qualidade através da utilização de software de imagem como o Photoshop (Figuras 3-6).

2. Duas vezes eu n Hibridização In Situ

  1. Para conseguir a dupla marcação com o método descrito acima a partir de 1,1 - 1.3.1.7 é usado, mas inclui a incubação simultânea de ambos digoxigenina e fluoresceína sondas marcadas durante a hibridação.
  2. Siga o mesmo procedimento para o pós hibridização lava nomeadamente SSC e PBST lavagens (etapas 1.3.2.1 e 1.3.2.2) e incubações de bloqueio (etapa 1.3.2.3). Realizar as reacções de anticorpos e coloração sequencialmente, tal como descrito abaixo.
  3. Incubar com anticorpo de embriões AP-coupled-anti-digoxigenina (1:5000) a 4 ° C com agitação suave.
  4. Lave e incubar com BCIP-NBT (etapas 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
  5. Após detecção, lavar duas vezes com PBST embriões à temperatura ambiente durante 20 min.
  6. Incubar os embriões a 65 ° C em PBST com EDTA 1 mM, durante 30 min para inactivar o anticorpo anti-digoxigenina.
  7. Incubar embriões em 100% de metanol, seguido por re-hidratação de 75%, 50%, e 25% de metanol with PBST e volta para PBST por 1 hora.
  8. Incubar durante a noite com embriões AP-coupled fluoresceina (1:2000) em tampão de bloqueio, a 4 ° C com agitação suave.
  9. Lavar embriões com PBST (passo 1.3.3.1) e os embriões pré-mancha 2 vezes durante 15 minutos com tampão de pré-coloração (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) à temperatura ambiente com agitação suave, antes da incubação na presença de vermelho rápido . O protocolo pode ser interrompido e os embriões podem ser armazenados a 4 ° C com agitação suave e retomada no dia seguinte.
  10. Dissolver um comprimido vermelho rápido em 2 ml de tampão de coloração imediatamente antes da utilização.
  11. Comece a reacção de coloração, colocando os embriões no tampão de coloração com reagente vermelho rápido.
  12. Parar a reacção de coloração, quando a intensidade da coloração desejada seja atingida. Pode levar de algumas horas à temperatura ambiente para um ou dois dias durante a noite, quando a coloração a 4 ° C. Parar a reacção imediatamente se a intensidade de coloração não se desenvolve mais ou começa a mostrar não específicadade em relação ao sentido de controlo.
  13. Siga os procedimentos descritos acima para as etapas restantes, ou seja, fixação pós montagem, de observação e de aquisição de imagem (steps1.3.3.5 e 1.3.3.6).

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Resultados

Usando o protocolo com 50 embriões por cesto (por gene de / por condição experimental), o padrão de expressão do gene, que podem ser obtidos numa experiência. Quase todos os embriões mostram padrões de expressão semelhantes para um determinado gene. Os exemplos representativos da coloração em hibridação in situ são mostrados nas Figuras 3-6.

Tanto o sentido e anti-sentido riboprobes foram sintetizados a partir dos cDNAs correspondentes a PC5.1, PC5.2 6...

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Discussão

Nós desenvolvemos métodos melhorados para visualizar o RNA com alta resolução. A nos procedimentos de hibridização in situ são realizados através de simples cestos feitos sob medida com fundo poroso (Figura 1). Os embriões são processadas usando soluções sem RNase em placas de 6 cavidades, à temperatura ambiente e sob condições estéreis.

Segregar embriões cestas são feitas de diferentes tubos coloridos Eppendorf. Cestas com ou sem um aro são utilizados para...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Taq PolymeraseInvitrogen10342053
TopoTA - Promotor duplo pCRII-TOPOInvitrogenK4650-01
HQ Mini Kit de purificação de plasmídeoInvitrogenK2100-01
AgaroseRoche11 685 660 001
Not1 e HindIII Enzimas de restriçãoInvitrogen15441-025, 15207-012
Tampão Saturado Fenol,Invitrogen15513039Armazenar a 4 °C. Olhos, pele e trato respiratório irritantes e suspeitos de serem cancerígenos. Deve-se ter cuidado durante o manuseio.
ClorofórmioFisherC607-1Tóxico e suspeito de ser cancerígeno. Trabalhe sob a coifa.
DNAse livre de RNase IRoche4716728001Prepare pequenas alíquotas e armazene a -20 graus C.
Mistura de marcação de DIG-RNA com Sp6, T7 e T3 RNA polimeraseRoche11277073910
RNaseRoche10777-019
3.0 M Acetato de sódio (pH 5.5)Fisher50-751-7355
100% EtanolÁlcoois
Dietil Pirocarbonato (DEPC)Sigma40718-25MLO DEPC é um irritante para os olhos, a pele e as vias respiratórias. Evite o contato com a pele e os olhos. Use óculos de segurança, luvas e máscara.
NaOHFisherSS255-1
EDTA 0,5 M (pH 8,0)Fisher50-751-7404
Sistemas de Aquário de Sal Oceânico InstantâneoN/A
Fosfato Tampolado Salino (PBS)FisherFL-03-0900
Paraformaldeído (PFA)SigmaP6148-1KGPrepare e armazene a -20 graus; C em alíquotas de 40 ml para utilização posterior. O PFA é tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira.
Feniltiocarbomida (PTC)SigmaP7629-25GPTC é altamente tóxico. Use óculos de segurança, luvas e máscara contra poeira.
MetanolFisherA947-4
Dumont (Relojoeiro s) Padrão de pinça nº 5Fine Science Tools
Cluster de cultura de células de seis poçosSarstedt83.1839
Os cestos são feitos de malha de nylon e tubos EppendorfPreparaçãoPara fazer os cestos, corte tubos Eppendorf (1,5 ml) com ou sem bordas para remover a extremidade cônica. Corte a malha de nylon em pequenos pedaços correspondentes ao tamanho de  as extremidades cortadas dos tubos Eppendorf. Coloque os tubos com a malha de nylon cobrindo a extremidade cortada em um elétrico  placa quente até que o tubo e a malha de nylon fiquem juntos (realize na capela de exaustão). Corte o excesso de malha dos cestos e guarde-os em 100% de metanol até o uso.
Monolaurato de polioxietilenoorbitano (Tween 20)SigmaP1379-500ML
Proteinase KFermentasEO0491
Anidrido acéticoSigma242845
TrietanolaminaSigma90279-100ML
Formamida, grau de pureza altaSigmaF9037
AG501-X8 ResinaBio Rad142-6424
ácido cítrico monohidratadoSigmaC0706-500G
sal de heparina sódicaSigmaH3393-25KU
tampão de citrato de sódio salino (SSC)SigmaS6639
tRNA de levedura de padeiro tipo XSigmaR5636-1ML
NaClFisherS640-500
Tris-HClFisherBP153-1
MgCl2FisherS25403
Cloridrato de LevamisolSigma31742
N,N-Dimetilformamida
anidro (DMF)		Sigma227056Teratógeno irritante, tóxico, combustível e suspeito. Manuseie com trajes de segurança adequados, incluindo luvas e óculos de proteção.
5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP)SigmaN6639Proteger esta solução da luz.
Nitroblue tetrazólio (NBT)Sigma840WProteja esta solução da luz.
Albumina de soro bovino, fração purificada V (BSA)SigmaA8806
Fragmentos de Fab Anti-digoxigenina-AP de ovelhaRoche1093274910
GlicerolSigmaG5516-500ML
Placas de cultura de células de 96 poçosSarstedt83.1835
Tg (mnx1: GFP) ml2 / Tg (hb9: GFP) ml2ZIRCTg (mnx1: GFP) ml2
Sistemas de aquário oceânico instantâneoN / A
Kit de clonagem ultrapuro Inibidor de comerciais interna

Referências

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