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Artigo de método

Ensaios de viabilidade para células em cultura

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DOI:

10.3791/50645

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20 de janeiro de 2014

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1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Neste artigo

Resumo

Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.

Resumo

Contagens de células do manual sobre um microscópio são um meio sensível de avaliar a viabilidade celular, mas são consumidoras de tempo e, por conseguinte, caros. Ensaios de viabilidade computadorizados são caros em termos de equipamento, mas pode ser mais rápido e mais objetivo do que a contagem de células manuais. O presente relatório descreve o uso de três desses ensaios de viabilidade. Dois destes ensaios são infravermelhos e um é luminescente. Ambos os ensaios infravermelhos dependem de um Imager 16 bits Odyssey. Um ensaio de infravermelho usa a mancha DRAQ5 para núcleos combinados com a mancha Sapphire para citosol e é visualizado no canal 700 nm. O outro ensaio de infravermelhos, uma In-Cell Ocidental, utiliza anticorpos contra as proteínas do citoesqueleto (α-tubulina ou do microtúbulo associado à proteína 2) e rotula no canal de 800 nm. O terceiro ensaio de viabilidade é um ensaio luminescente utilizada para o ATP, mas que utilizam um quarto do volume recomendado para economizar no custo. Estas medições são todos linear e correlacionam-se com o número de cells chapeado, mas variam em sensibilidade. Todos os três ensaios de contornar microscopia demorado e amostrar todo o bem, reduzindo assim o erro de amostragem. Finalmente, todos os ensaios facilmente pode ser completada dentro de um dia do final da experiência, o que permite um maior número de experiências para ser executadas dentro de intervalos de tempo curtos. No entanto, todos eles contam com a suposição de que o número de células permanecem em proporção à intensidade do sinal depois de tratamentos, uma suposição de que, por vezes, não é cumprida, especialmente para ATP celular. Além disso, se as células de aumentar ou diminuir de tamanho após o tratamento, esta pode afectar a potência do sinal, sem afectar o número de células. Conclui-se que todos os ensaios de viabilidade, incluindo as contagens manuais, sofrem de uma série de ressalvas, mas que testes computadorizados de viabilidade são bem vale o investimento inicial. Usando todos os três ensaios em conjunto produz uma visão abrangente da estrutura e função celular.

Introdução

O ensaio de viabilidade mais comum nas ciências biológicas envolve a contagem de células. Isto é evidenciado por uma análise das principais (mais recentes) 200 publicações que apareceram no PubMed com qualquer uma das palavras-chave "in vitro" ou "cultura" em 2013/04/29 e 2013/04/30. Dessas publicações, 23,5% usaram ensaios de contagem de células, incluindo a contagem de número de células manuais, o número de células automatizado conta com software de imagem, e azul exclusão Trypan. O ensaio vivo / morto foi utilizada em 1% destas publicações. O número de publicações com o MTT (brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) para ensaio de viabilidade metabólica foi de 11%. Esta pesquisa da literatura também mostra que o número de publicações, utilizando ensaios tais como o MTT em conjunto com os ensaios de contagem de células foi de 3,5%. Apesar da tendência de usar um teste de viabilidade, por si só, avaliar a função celular em combinação com o número de células parece ser a melhor escolha para avaliar i celularntegrity. A contagem celular por si só não é suficiente, porque as células remanescentes poderão não ser funcional ou saudável, embora eles estejam presentes no poço 1,2. Por outro lado, as medidas funcionais, tais como o ATP pode aumentar ou diminuir, na ausência de mudanças paralelas no número de células. O desacoplamento de leituras metabólicas a partir do número de células sugere que o ATP e ensaios MTT nunca deve ser usada como o único ensaio de viabilidade. No presente relatório, três ensaios de viabilidade que pesquisamos ambas as estruturas celulares e função metabólica são descritos, para uma visão mais abrangente da integridade celular de um ensaio por si só, qualquer pode pagar.

Dois dos nossos ensaios requerem um imageador infravermelho que mede a fluorescência em 700 nm e 800 canais. O ruído é baixo nos comprimentos de onda infravermelhos, levando ao aumento de sinal-para-ruído relações 3. O gerador de imagens Odyssey que usamos tem uma gama dinâmica 4,5 log e uma profundidade de bits de 16, Translating a 2 16 ou 65.536 tons de infravermelho. Isto pode ser contrastado de imagens a cores de 8 bits, que só oferece 2 8 ou 256 tons de cor para cada comprimento de onda. Assim, a imagem de 16 bits tem resolução mais fina. Deve notar-se que as imagens de infravermelhos originais são frequentemente pseudocolored verde (800 nm) e vermelha (700 nm) em relatórios publicados para apresentação. Imageadores Odyssey são comumente usados ​​tanto para Western blot e In-Cell Westerns 4-7. Em-Cell Westerns em células fixadas em formaldeído usar anticorpos primários contra qualquer proteína de interesse e classificá-los por sua vez, com anticorpos secundários fluorescentes infravermelhos. Esta técnica é conhecida por ser particularmente útil para terminais de fosforilação 6. Na nossa No celular Westerns, que corar as células fixas para as proteínas do citoesqueleto α-tubulina ou a microtúbulos neuronal proteína associada 2 (MAP2) no canal de 800 nm. Estas proteínas são suficientemente abundante para originar elevadas relações sinal-para-ruído. Também manchar nossos pratos no 700nm canal para núcleos com a mancha DRAQ5 e para o citoplasma com a mancha Sapphire. Ambas as proteínas do citoesqueleto e os DRAQ5 + safira manchas assim reflectir estruturas celulares.

O ensaio terceiro viabilidade mede a função metabólica e é chamado de "celular Titer Glo." Neste ensaio baseado luciferase, os valores de luminescência estão em proporção direta com os níveis de ATP. Os ensaios de ATP são comumente usados ​​para quantificar as células viáveis ​​8-12. No entanto, a inclusão da palavra "título" no nome do ensaio é um tanto inapropriado porque saída ATP por célula pode mudar como uma função do tratamento a toxina e é, por conseguinte, não é sempre, em proporção ao número de células 8. Níveis de ATP também pode ser afetada por ritmos circadianos 13 e 14 por divisão celular e diferenciação celular 15. No entanto, o ensaio de ATP mostrado aqui é simples de executar e útil porque o ATP é uma medida robusta de metabólicaviabilidade 16-21, se não o número de células em si. Usando este ensaio para complementar o infravermelho no celular Westerns, portanto, produz uma visão mais abrangente da integridade celular do que qualquer um ensaio sozinha.

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Protocolo

Um esquema dos protocolos está ilustrada na Figura 1.

1. Celular chapeamento

Células da placa em placas de 96 poços com diferentes densidades de plaqueamento (Figura 2). Para verificações de linearidade na linha de células do neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k e células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Para verificações de linearidade em neurônios de rato primários corticais, placa de 25k, 50k, 100k e 200k células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Se as linhas de células primárias ou células de interesse aparência saudável em diferentes densidades de plaqueamento, a placa e cerca de a densidade celular óptima para esse tipo de célula.

Nota: No presente estudo, as células N2a foram semeadas em 100 ul de mídia e neurônios corticais primárias em 200 mL de mídia em placas que são projetados para menor evaporação. Para obter informações detalhadas sobre manipulação de células, a mídia, os soros, antibióticos e tratamentos de toxinas, consulte Unnithan et al. para N2a cells 8 e Posimo et al. de culturas primárias do córtex 22.

    1. Repetir o chapeamento sobre uma segunda placa de 96 poços. Uma placa será ensaiada para o ATP (Figura 2A) e a outra com os ensaios de infravermelho (Figura 2B). Não se pode usar o mesmo prato para o ATP e ensaios de infravermelhos, porque as células devem ser lisadas aberto para medições de ATP intracelular.
    2. Certifique-se para a chapa, pelo menos, três poços adicionais para subtracção do fundo em ensaios de infravermelhos na densidade de revestimento óptima (coluna 2, a Figura 2B).
  2. Adicionar meio sem células ou, mais barata, de água estéril para as cavidades exteriores em filas A e H e, nas colunas 1 e 12. Evite confiar em dados de poços ao longo das bordas, como viabilidade é muitas vezes menor aqui de efeitos da evaporação e temperatura media gradientes. Tais problemas com microplacas são comumente chamados efeitos de borda 23,24. Não manter esses poços vazioporque então as linhas B e G e as colunas 2 e 11 sofrem com o efeito de borda.
    Os efeitos de borda podem ser reduzidas através da incubação de uma placa recentemente semeado à temperatura ambiente em condições ambientais antes da transferência para a incubadora de CO 2 24. Além disso, um estudo recente da Carralot descreve um método de correção de matemática para microplacas utilizando uma única coluna de controle 23. Oliver e seus colegas usaram um especialmente projetado forçado microtitulação ar placa incubadora para reduzir gradientes térmicos 25. Se o efeito de borda é uma preocupação significativa, câmaras de estabilidade da microplaca (BT & C Incorporated) podem ser adquiridos para criar um microambiente homogêneo, com alta umidade e até mesmo gradientes de temperatura.
  3. Se forem necessários mais poços do que mostrado na Figura 1, pois diluições de reagentes adicionais ou mais densidades chapeamento será testado, use os poços de ponta para o fundo subtração.
  4. Espere durante a noite para fixaçãode células e ensaio da manhã seguinte, como descrito abaixo.

2. Luminescentes ATP Assay

  1. Seguir as recomendações do fabricante celular Titer Glo o para a reconstituição do substrato com o tampão e para os tempos de incubação.
    1. Remover 50 ou 150 mL de mídia a partir dos 100 ou 200 mL de mídia chapeamento, respectivamente. Um pouco menos de 50 uL irá permanecer para trás no poço. Adicionar 25 ul dos reagentes (substracto mais tampão) para colunas 2-6 (Figura 2A), numa diluição de 1:2.
      Nota: Diferentes volumes de material deixado para trás após a remoção poderia diluir ou concentrar os reagentes do ensaio ATP diferencialmente através de poços. Tome cuidado para assegurar que o nível de líquido em todas as pontas de pipeta multicanal é equivalente. Medir o líquido restante em alguns poços em toda a placa com uma pipeta imediatamente antes da adição dos reagentes de ensaio do ATP para assegurar a precisão. Se existe alta variabilidade das taxas diferenciais de Evapor mídiação ao longo da superfície da placa, remover todos os meios antigos e adicionar o mesmo volume de meio fresco ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) a todos os poços imediatamente antes da adição de reagentes para o ensaio do ATP. Se as placas sofrem de níveis variáveis ​​de evaporação, tente mudar para as placas de baixa evaporação de Costar Corning. Nos últimos placas, os 60 poços interiores mostradas na Figura 2 apenas sofrem de uma média de 0,995 ± 0,41% mídia evaporação durante a noite. Existe, portanto, uma variabilidade negligenciável em volume de suporte, no momento da análise.
    2. Nas colunas 7 a 11, as linhas de B a D, ao remover a mídia o suficiente para deixar 50 ul trás, conforme detalhado acima, e adicionar 50 mL de reagentes em uma diluição de 1:1.
    3. Nas colunas 7 a 11, as linhas de E a G, deixa as células em 100 ul de meio e adicionar 100 ul de reagentes, de novo em uma diluição de 1:1. A empresa recomenda que 100 ul de reagentes devem ser diluídas 1:1 em 100 ul de meio.
      Nota: A fimpara economizar em custos, é possível cortar estas recomendações, tanto em volume quanto em diluição. No entanto, antes de fazer isso, assegurar que não reduzir a linearidade e sensibilidade do ensaio.
    4. Uma vez que um volume específico e fator de diluição dos reagentes são considerados satisfatórios, ficar com eles em todos os experimentos posteriores. Os critérios para os dados satisfatórios são descritos na secção Resultados.
    5. Reagentes reconstituídos não utilizados podem ser novamente congelados e utilizados em uma data posterior para economizar em custos. De acordo com o fabricante, os reagentes podem ser reconstituídos armazenada a -20 ° C durante 21 semanas, com a perda de ~ 3% de actividade.
  2. Colocar a placa num agitador orbital durante 2 min ou um agitador de nutação durante 10 minutos. Se uma parte da placa está a ser ensaiado para uma medição diferente e não pode ser agitado, agitar o meio com simples pipetagem para cima e para baixo apenas nos poços de interesse. No entanto, as bolhas excessivas geradas durante esta etapa irá interferir com lumisaída NESCent.
    1. 10 minutos após a adição dos reagentes, transferir 60 ul de o conteúdo do poço em placas de 96 poços brancos. Valores de luminescência são mais elevados em placas brancas do que em placas claras ou pretas, porque eles refletem a luz para cima em direção ao detector.
      Nota: Em nossa experiência, as células sobrevivem melhor na baixa evaporação, placas Costar claras do que outras placas. Estas placas específicas não são vendidos com paredes brancas. Em segundo lugar, as placas opacas de paredes claras e de fundo são mais caros do que as placas completamente claros. Se alguém transfere o líquido luminescente para placas brancas, as placas brancas podem ser lavados e reutilizados, economizando o custo de usar novas placas brancas para cada experimento. Transferência de líquido é, portanto, a opção mais barata no longo prazo.
    2. Pop quaisquer bolhas de ar antes da leitura da placa com uma agulha ou, preferencialmente, com ar forçado a partir de uma lâmpada de pipeta de transferência de plástico. Ler a placa num luminómetro com um tempo de integração de 1 segundo (o recome empresands 0,25-1 seg tempo de integração como suficiente). Ler a placa de 10-12 minutos após a adição dos reagentes de ensaio do ATP. O tempo é crítico para a comparação entre os diferentes blocos, porque o sinal luminescente é transiente, com uma taxa de decomposição rápida, como mostrado por Gilbert e colegas 26.
  3. Calcule a média dos valores de luminescência das 3 ou 6 poços em cada grupo e trama como uma função do número de células em um gráfico de dispersão (ver Figura 3). Primeiro fundo subtrair valores médios de luminescência dos poços vazios apropriadas (poços 2B - 2G, poços 11B - 11D, 11E e poços - 11G) a partir de cada ponto de dados correspondente. Haverá três grupos diferentes para cada densidade de revestimento nesta experiência inicial (Figura 2A). Os níveis de ATP pode ser correlacionada linearmente com densidades celulares em um ou todos esses grupos. Prossiga com a maior diluição de reagentes que ainda dá resultados satisfatórios para economizar em custos. Os critérios para os resultados satisfatórios são descritos in seção Resultados.
    Nota: Com os meios de comunicação utilizados no presente estudo, os valores de fundo com este ensaio não são altos e é possível ignorar os poços branco. No entanto, o fabricante Promega relata diferenças de luminescência com diferentes meios de cultura. O presente estudo utiliza Hyclone Fetal Clone III, uma versão sintética do soro fetal bovino para células N2a e soro de vitelo para culturas corticais primárias. De acordo com o fabricante, o soro de vitelo diminui os valores de luminescência, mas não diminuem a sensibilidade do ensaio. No entanto, se esta é de grande preocupação, diluir os reagentes de ensaio de ATP em PBS em vez de meios de comunicação, no momento do ensaio.
    1. Se as células parecem crescer de forma desigual em colunas durante a noite, tente testando-os dentro de 6 horas de chapeamento. No entanto, ter em mente que a densidade no tempo habitual de ensaio (por exemplo, 24 horas após o tratamento) é a densidade a qual deve ser conseguida linearidade.

3. Infrared Ensaios

  1. Na manhã após o plaqueamento, fixar as células na segunda placa à temperatura ambiente numa hotte. Certifique-se de usar luvas para esta etapa e dispor do fixador como lixo químico porque o formaldeído é uma substância cancerígena. Adiciona-se 4% de formaldeído e 4% de sacarose em tampão de fosfato 0,1 M para os meios de comunicação existente em uma diluição de 1:01. A mídia também pode ser lavado com PBS antes de fixar em full-força fixador. Qualquer técnica funciona bem.
    1. Incubar em fixador por 20 minutos e depois retire o fixador e lavar 3x em 200 mL PBS.
  2. Armazenar a placa em PBS com azida de sódio a 0,2% a 4 ° C, se o teste não terá lugar no mesmo dia. Caso contrário, prosseguir com o ensaio e colocar as células em solução de bloqueio para minimizar a ligação não específica de anticorpos.
    1. Diluir o soro Odyssey bloco 01:01 peixe em PBS e adicionar 0,3% de Triton X-100 como um permeabilizador célula. Adicione solução de bloqueio suficiente, bem como Antibo primário e secundáriody soluções de modo que 35 ul pode ser pipetado para cada poço. No entanto, se uma grande quantidade de bolhas são observadas durante a pipetagem, fazer> 50 ul de cada poço, de outra forma as bolhas descem para dentro das células e anticorpos bloco de ligação. Bolhas de sabão excessivas aparecerá como uma mancha circular imaculada no meio do poço. Tente ajustar a pipeta se isso ocorrer.
    2. Incubar nesta solução de bloqueio durante 30-60 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: 5% de albumina de soro bovino ou soro normal das mesmas espécies como o anticorpo secundário também pode ser utilizado como o bloqueio de soluções para economizar no custo do bloco de soro de peixe. Bloqueio de soluções pode afetar o desempenho do anticorpo. Assim, o bloco óptimo para cada anticorpo é melhor determinado empiricamente.
      Nota: Alguns pesquisadores colocam na célula placas ocidentais em shakers durante incubações. No entanto, isso não é necessário.
  3. Faça os anticorpos primários: 1:10.000 diluição de anti-α-tubulina(Monoclonal mouse, Tabela 1) e 1:2.000 diluição para anti-MAP2 (mouse monoclonal, Tabela 1). Estes anticorpos são específicos para as proteínas de interesse nestes modelos celulares; especificidade é essencial para qualquer mancha imunocitoquímica.
    Nota: MAPA 2 é um marcador de neurônios e é apropriado para culturas neuronais / glial mistos. As culturas pós-natal mostrados aqui também contêm alguns glia (~ 25%), porque os astrócitos aparecem em primeiro lugar no dia embrionário 18, com seus números de pico no período neonatal precoce 27,28. Não se pode distinguir entre astrócitos e neurônios na ATP e DRAQ5 + Safira ensaios. A fim de medir os neurônios e astrócitos separadamente, use MAP2 simultânea e coloração GFAP nos 800 e 700 canais nm, como descrito por Mullett e colegas 4,29, deixando de fora DRAQ5 + Sapphire. No entanto, se todas as células na cultura desejar ser avaliada, usar um marcador pan-celular, tais como α-tubulina, β-actina, ou GAPDH.
    Nota: Estas diluições foram otimizados para o N2a e células corticais primárias e não pode generalizar para todos os modelos. Portanto, experimentar, pelo menos duas diluições de anticorpo primário, um no lado esquerdo da placa e uma no lado direito (ver Figura 2B). Alternativamente, tente 3-4 diluições de anticorpos primários em três cavidades cada. Por exemplo, a diluição recomendada na folha de inserção de anticorpo pode ser conjugada com alterações duplas. Em outras palavras, se a diluição recomendada para imunocitoquímica é 1:500, também tentar 1:250 e 1:1.000 fatores de diluição.
    1. Diluir anticorpos em 1:1 bloco Odyssey: PBS e adicionar 0,3% de Triton-X. Para poupar no custo, tentar fazer os anticorpos na solução de bloqueio, que foi aplicada às células, no passo 3.2.1, removendo esta solução no final do período de incubação. Manter as células em PBS ao fazer isto, não deve secar.
    2. Incubar em anticorpos primários ou 1-2 horas, à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Para fracamente binding anticorpos e proteínas que não são abundantes, incubações durante a noite pode ajudar a aumentar o sinal.
      Nota: Deixar, pelo menos, três poços em solução para subtracção do fundo de bloqueio a cada concentração de anticorpo secundário (poços 2B-2E e poços 2E-2G na Figura 2B). Não exponha esses poços a qualquer anticorpo primário que seja. Eles revelam a extensão da ligação não específica por o anticorpo secundário e são úteis para o cálculo de razões de sinal-para-ruído. Se existe uma preocupação de que os anticorpos secundários irão levar a elevados níveis de ligação não específica, também incluem os poços de controlo que não são expostas ao anticorpo primário ou secundário, mas recebem o mesmo número de lavagens. A diferença entre estes poços e os poços "secundário" só revelará a extensão da ligação não específica causada pelo anticorpo secundário sozinho. Em nosso teste em células de rato N2a, a intensidade do sinal com o anticorpo secundário anti-mouse sozinho foi 0,557 ± 0,032, sinal com anti-coelhoanticorpo secundário sozinho foi de 0,533 ± 0,041, o sinal sem anticorpo secundário foi 0,357 ± 0,003, e o sinal com os anticorpos primário e secundário foi de 11.867 ± 0.911. Nós, portanto, não têm observado altos níveis de ligação não específica, mesmo quando se utiliza anticorpos secundários anti-rato em células de camundongo. Existem vários fabricantes de para anticorpos secundários infravermelhos; recomendamos comprar apenas os altamente cross-adsorvidos. Note-se que a concentração de anticorpos IgG secundários podem variar, dependendo da fonte.
  4. Lavar os anticorpos primários com três lavagens de 200 ul de PBS por poço, de 10 minutos cada. Os anticorpos primários podem ser salvas a 4 ° C por algumas semanas em azida de sódio a 0,2% e reutilizado até pequenas partículas ou fragmentos tornam-se aparentes quando as soluções são mantidos até a luz. Isso só é feito para economizar em custos. Se o custo não é um problema, produzir anticorpos frescas para cada uso.
  5. Diluir o anticorpo secundário por 1:1.000 ou 1:2.000 em 1:1 bloco Odyssey: PBS com 0,3% de Triton X (Figura 2B). Adicionar a diluição 1:1000 para a metade superior da placa e 1:2000 para a metade inferior da placa. Estas concentrações podem ser ainda mais reduzidos para economizar em custos, mas verificar se há linearidade antes de cometer a isso.
    Nota: Certifique-se de adicionar a solução de anticorpo secundário apropriado para o fundo de poços de subtração (coluna 2 na Figura 2B).
    1. Se uma segunda proteína vai ser ensaiada em lugar de DRAQ5 + safira, células de etiquetas para α-tubulina ou MAP2 com 700 nm de cabra anti-IgG de ratinho e a segunda proteína no canal de 800 nm, com anticorpos primários a partir de outras espécies de rato. O canal 800 nm tem menos fundo do que o canal 700 nm e deve ser reservado para a proteína mais crítico de interesse.
    2. Incubar em anticorpos secundários durante 1 hora à temperatura ambiente numa gaveta, longe da luz.
  6. Lavar anticorpos secundários com 3 lavagens de 200 mL PBS por poço, 10 min cada.
  7. Faça as soluções DRAQ5 + Sapphire. Para o lado esquerdo da placa, diluir DRAQ5 1:10.000 (0,5 pM concentração final) e safira 1:1000 em PBS com 0,3% de Triton-X (colunas 3-6, Figura 2B). Para a metade direita do prato, diluir DRAQ5 1:20.000 (0,25 mM) e Sapphire 1:2000 (colunas 7-10; Figura 2B).
    Nota: DRAQ5 usado para ser vendido a um estoque de 1 mM em vez de um estoque de 5 mM. Alguns relatórios publicados anteriormente, portanto, utilizados 1:4000 ou 1:2.000 diluições de DRAQ5 8.
    1. Para poupar no custo, se duas placas estão sendo testadas simultaneamente, a mesma solução de safira DRAQ5 + pode ser utilizado em duas placas em sequência, pipetando-o para fora da primeira placa e adicionando-o à segunda. Se as mesmas soluções serão usados ​​duas vezes desta maneira, utilizar-se no prazo de um dia. Soluções DRAQ5 Diluído + Safira não pode ser salvo a 4 ° C ou congelado para uso posterior.
    2. Incubar nestas soluções durante 30 minutos à temperatura ambiente, longe fluz rom. Se o tempo é curto e os DRAQ5 + soluções Safira não pode ser reutilizado em outras placas com diferentes secundários, adicione essas manchas para as soluções de anticorpos secundários no passo 3.5 e incubar por 1 hora.
      Nota: Não adicione DRAQ5 + solução Sapphire para o fundo de poços de subtração (coluna 2 na Figura 2B) como esses poços não deve ser manchado no canal 700 nm.
  8. Lavar as 3x placa com 200 ul de PBS por poço durante 10 minutos cada. Coloque azida de sódio a 0,2% em PBS, a lavagem final, se o prato vai ser coradas com outros anticorpos secundários visíveis alcance quando a imagem de infravermelhos é completa.
  9. Digitalizar a placa em um Odyssey Imager. Comece a digitalizar as placas a intensidade 5 e resolução de 169 milímetros. Ou "qualidade média" ou configurações de "baixa qualidade" são suficientes. A empresa não divulga informações detalhadas filtro de excitação / emissão. No entanto, os filtros de emissão são aproximadamente 20 nm de largura e estão centradas em torno de 720 e 820 nm, de acordo com o fabricante.
    Nota: É possível digitalizar placas enquanto ainda molhado como pesquisadores podem querer continuar a manchá-las com outros marcadores. No entanto, a empresa sugere em seu protocolo on-line que placas secas resultam em menos bem-bem propagação do sinal. Se você digitalizar os dois molhada e depois seca para comparar os dados, certifique-se de remover todo o PBS do bem, porque sais remanescentes após a evaporação pode levar a alta fluorescência de fundo ao longo das bordas.
    1. A Odyssey Imager verifica-se e através da parte inferior da placa. As placas de diferentes fabricantes podem exigir diferentes deslocamentos de foco porque o fundo das cavidades pode variar na sua espessura e profundidade na placa. Tente digitalizar em deslocamentos diferentes de foco e ver onde a maior relação sinal-ruído e mais nítida (a maioria em foco) sinal é alcançado: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 milímetros. Tentar também para medir a profundidade do poço a partir do fundo de uma placa com uma régua para confirmar a findings no Odyssey. Lembrar que o plástico na parte inferior do poço, pode adicionar a altura adicional para as medidas da régua. As placas Costar utilizados no presente estudo exigir um deslocamento de 4,0 milímetros foco.
    2. Use a função Ocidental Em-Cell no software para colocar a grade do tamanho certo para a imagem da placa e exportar os dados para o Microsoft Excel. Examine os valores "integrados intensidade" dos mesmos poços em diferentes deslocamentos de foco para encontrar os mais altos valores de fluorescência. O deslocamento de foco que produz a maior relação sinal-ruído (sinal em poços imunoistoquímica versus "não controlo negativo primárias" poços) é o único a escolher a seguir.
    3. Uma vez que se deslocar o foco é decidido, digitalize novamente em incrementos menores. Por exemplo, se o sinal mais brilhantes era de 3,5 e 4,0 mm, tente digitalizar a 3,6, 3,7, 3,8, e 3,9 mm e ver se há qualquer melhoria adicional na intensidade do sinal. Se o deslocamento foco está errado, intensidades de sinal através das 12 colunas em uma pl vazioComeram (quando todas as colunas devem ter sinal de igual) aparece como uma curva em forma de U, em vez de uma linha plana. Se isto continua a ser um problema com placas de plástico, tente placas com fundo de vidro.
  10. Subtrair a média das intensidades integradas nas subtração de fundo de poços (Figura 2B; poços 2B - 2D ou poços 2E - 2G) de cada ponto de dados correspondente nos 700 e 800 nm canais. Em seguida, calcule a média das intensidades de sinal integrados para cada grupo de poços. Plotar os dados como um gráfico de dispersão contra densidade celular (veja a Figura 3).
    1. Comparar os resultados das duas diferentes diluições de anticorpos primários e secundários e os resultados das duas diluições diferentes de DRAQ5 + safira para resolver em uma diluição de cada para as experiências subsequentes. Se linearidade não é alcançado, tente digitalizar em uma intensidade diferente. Digitalize novamente com intensidades 3 e 7 em vez de 5 e reanalisar os dados. Se os dados melhorar em uma dessas intensidades masainda não são satisfatórios, examinar novamente em incrementos em torno dessa intensidade.
    2. Tenha cuidado para não analisar as imagens onde o software mostra manchas brancas nos poços; esses pontos significam sinal saturado para fora do alcance do gerador de imagens. Digitalizar em uma intensidade menor se isso ocorrer.
    3. Se linearidade não é alcançado, tente também para fixar as células dentro de 6 horas de chapeamento, pois eles podem crescer ou morrer de forma desigual em diferentes colunas durante a noite. Além disso, tente diferentes densidades de revestimento, diferentes intensidades de digitalização, otimizações adicionais de fatores de diluição de reagentes, placas com fundo de vidro, DRAQ5 por si só como uma mancha só de núcleo, ou diferentes do que outros anti-α-tubulina ou anti-MAP2 anticorpos.

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Resultados

O factor limitante da velocidade nestas experiências é a coloração de infravermelhos, como o ensaio de ATP é relativamente curta duração. Para os ensaios de infravermelhos, prevemos que oito placas de 96 poços pode ser corada e digitalizado no prazo de um dia após escalonamento dois lotes de quatro placas de cada (ver Figura 1). Esta estimativa assume 20 min de fixação, 30 min de lavagem, 30 min de bloqueio, 2 horas de incubação do anticorpo primário seguido por 30 min de lavagens, 1 hora de incubação a...

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Discussão

Verificou-se que a intensidade do sinal em todos os três ensaios de viabilidade é linear e correlacionada com a densidade do revestimento. No entanto, nem todos os ensaios são igualmente sensíveis a 2 vezes ou alterações de 1,5 vezes na densidade de revestimento. Para células N2a, os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis do que o ensaio de ATP, particularmente a densidades mais baixas do chapeamento. Embora os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis que o ATP, os DRAQ5 + Safira ensaios e ensaios α-tubulina...

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Divulgações

Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos Juliann Jaumotte para a idéia de poupar nos volumes de reagentes no ensaio ATP. Estamos profundamente gratos pelo apoio administrativo soberba de Maria Caruso, Deb Willson, e Jackie Farrer e para a Escola de Farmácia Mylan para a prestação de apoio financeiro para estes estudos. Agradecimentos também são devidos às Doenças Hunkele temido Fundação eo Parkinson e Distúrbios do Movimento da Fundação pelo apoio financeiro dos estudos neuronais primários.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cell Titer GloPromegaG7572Compre em quantidades de 100 ml e alíquota, em vez de comprar a quantidade mais cara de 10 ml. Reagentes reconstituídos e não utilizados podem ser recongelados a -20 &graus; C por pelo menos 21 semanas
18% FormalinaThermo-Shandon9990244A compra deste fixador evita a pesagem dos pós de formaldeído e a fervura da solução; a exposição a vapores é assim minimizada
SacaroseSigma-AldrichS0389Não é essencial adicioná-lo às soluções de formaldeído, mas melhora a aparência das células fixas
Odyssey BlockLI-COR927-40003Este soro de peixe pode ser comprado a granel e congelado a -20 & C para uso a longo prazo
Triton-X 100Sigma-Aldrich21568Armazenamos uma solução estoque de 10% Triton-X 100 em água estéril a 4 &graus; C
Fosfato de Sódio MonobásicoFisherS468Também se pode comprar comprimidos de PBS ou soluções de PBS 10x, mas são mais caros
Fosfato de Sódio DibásicoFisherS373Veja acima
Azida de Sódio (250x)Ricca Chemical Company7144.8-16Não compre o pó porque a azida de sódio é muito tóxica. Armazenamos todos os nossos anticorpos usados em 1x azida de sódio a 4 &graus; C até que sejam contaminados com detritos
Camundongo anti-&alfa;-tubulinaSigma-AldrichT5168Este anticorpo é caro, mas pode ser muito diluído e é altamente específico
Camundongo anti-MAP2Sigma-AldrichM9942Este anticorpo é caro, mas é altamente específico (um pré-requisito para In-Cell Westerns)
800 nm Cabra anti-camundongo IgGLI-COR926-32210Outras empresas também vendem anticorpos secundários infravermelhos. Certifique-se de comprar os anticorpos altamente adsorvidos e observe que as concentrações de IgGs podem variar de acordo com a fonte
DRAQ5BiostatusDR50200Este composto costumava ser vendido pela LI-COR a 1
mM SapphireLI-COR928-40022
LuminômetroPerkinElmerVICTOR3 1420 contador
Odyssey ImagerLI-COR9201-01
de PesquisaShaker / MixerInternational 248555
multirótuloProdutos

Referências

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

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