Os compostos terapêuticos são muitas vezes primeiro analisou in vitro com ensaios de viabilidade. Contagem de células cegos por um observador humano pode ser altamente sensível a pequenas alterações no número de células, mas não avaliar a função. Ensaios de viabilidade computadorizados, como descrito aqui, pode avaliar a estrutura e função de uma forma objectiva.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ensaios de viabilidade para células em cultura
Neste artigo
Resumo
Resumo
Contagens de células do manual sobre um microscópio são um meio sensível de avaliar a viabilidade celular, mas são consumidoras de tempo e, por conseguinte, caros. Ensaios de viabilidade computadorizados são caros em termos de equipamento, mas pode ser mais rápido e mais objetivo do que a contagem de células manuais. O presente relatório descreve o uso de três desses ensaios de viabilidade. Dois destes ensaios são infravermelhos e um é luminescente. Ambos os ensaios infravermelhos dependem de um Imager 16 bits Odyssey. Um ensaio de infravermelho usa a mancha DRAQ5 para núcleos combinados com a mancha Sapphire para citosol e é visualizado no canal 700 nm. O outro ensaio de infravermelhos, uma In-Cell Ocidental, utiliza anticorpos contra as proteínas do citoesqueleto (α-tubulina ou do microtúbulo associado à proteína 2) e rotula no canal de 800 nm. O terceiro ensaio de viabilidade é um ensaio luminescente utilizada para o ATP, mas que utilizam um quarto do volume recomendado para economizar no custo. Estas medições são todos linear e correlacionam-se com o número de cells chapeado, mas variam em sensibilidade. Todos os três ensaios de contornar microscopia demorado e amostrar todo o bem, reduzindo assim o erro de amostragem. Finalmente, todos os ensaios facilmente pode ser completada dentro de um dia do final da experiência, o que permite um maior número de experiências para ser executadas dentro de intervalos de tempo curtos. No entanto, todos eles contam com a suposição de que o número de células permanecem em proporção à intensidade do sinal depois de tratamentos, uma suposição de que, por vezes, não é cumprida, especialmente para ATP celular. Além disso, se as células de aumentar ou diminuir de tamanho após o tratamento, esta pode afectar a potência do sinal, sem afectar o número de células. Conclui-se que todos os ensaios de viabilidade, incluindo as contagens manuais, sofrem de uma série de ressalvas, mas que testes computadorizados de viabilidade são bem vale o investimento inicial. Usando todos os três ensaios em conjunto produz uma visão abrangente da estrutura e função celular.
Introdução
O ensaio de viabilidade mais comum nas ciências biológicas envolve a contagem de células. Isto é evidenciado por uma análise das principais (mais recentes) 200 publicações que apareceram no PubMed com qualquer uma das palavras-chave "in vitro" ou "cultura" em 2013/04/29 e 2013/04/30. Dessas publicações, 23,5% usaram ensaios de contagem de células, incluindo a contagem de número de células manuais, o número de células automatizado conta com software de imagem, e azul exclusão Trypan. O ensaio vivo / morto foi utilizada em 1% destas publicações. O número de publicações com o MTT (brometo de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio) para ensaio de vi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Um esquema dos protocolos está ilustrada na Figura 1.
1. Celular chapeamento
Células da placa em placas de 96 poços com diferentes densidades de plaqueamento (Figura 2). Para verificações de linearidade na linha de células do neuroblastoma N2a, placa 2.5k, 5k, 10k, 15k e células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Para verificações de linearidade em neurônios de rato primários corticais, placa de 25k, 50k, 100k e 200k células por poço em 3 ou 6 poços / grupo. Se as linhas de células primárias ou células de interesse aparência saudável em diferentes densidades de plaqueamento, a pl....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O factor limitante da velocidade nestas experiências é a coloração de infravermelhos, como o ensaio de ATP é relativamente curta duração. Para os ensaios de infravermelhos, prevemos que oito placas de 96 poços pode ser corada e digitalizado no prazo de um dia após escalonamento dois lotes de quatro placas de cada (ver Figura 1). Esta estimativa assume 20 min de fixação, 30 min de lavagem, 30 min de bloqueio, 2 horas de incubação do anticorpo primário seguido por 30 min de lavagens, 1 hora de incubação a.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Verificou-se que a intensidade do sinal em todos os três ensaios de viabilidade é linear e correlacionada com a densidade do revestimento. No entanto, nem todos os ensaios são igualmente sensíveis a 2 vezes ou alterações de 1,5 vezes na densidade de revestimento. Para células N2a, os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis do que o ensaio de ATP, particularmente a densidades mais baixas do chapeamento. Embora os ensaios de infravermelhos são menos sensíveis que o ATP, os DRAQ5 + Safira ensaios e ensaios α-tubulina.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Nenhum dos autores tem quaisquer conflitos de divulgar.
Agradecimentos
Reconhecemos Juliann Jaumotte para a idéia de poupar nos volumes de reagentes no ensaio ATP. Estamos profundamente gratos pelo apoio administrativo soberba de Maria Caruso, Deb Willson, e Jackie Farrer e para a Escola de Farmácia Mylan para a prestação de apoio financeiro para estes estudos. Agradecimentos também são devidos às Doenças Hunkele temido Fundação eo Parkinson e Distúrbios do Movimento da Fundação pelo apoio financeiro dos estudos neuronais primários.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Compre em quantidades de 100 ml e alíquota, em vez de comprar a quantidade mais cara de 10 ml. Reagentes reconstituídos e não utilizados podem ser recongelados a -20 &graus; C por pelo menos 21 semanas |
| 18% Formalina | Thermo-Shandon | 9990244 | A compra deste fixador evita a pesagem dos pós de formaldeído e a fervura da solução; a exposição a vapores é assim minimizada |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | Não é essencial adicioná-lo às soluções de formaldeído, mas melhora a aparência das células fixas |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | Este soro de peixe pode ser comprado a granel e congelado a -20 & C para uso a longo prazo |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | Armazenamos uma solução estoque de 10% Triton-X 100 em água estéril a 4 &graus; C |
| Fosfato de Sódio Monobásico | Fisher | S468 | Também se pode comprar comprimidos de PBS ou soluções de PBS 10x, mas são mais caros |
| Fosfato de Sódio Dibásico | Fisher | S373 | Veja acima |
| Azida de Sódio (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Não compre o pó porque a azida de sódio é muito tóxica. Armazenamos todos os nossos anticorpos usados em 1x azida de sódio a 4 &graus; C até que sejam contaminados com detritos |
| Camundongo anti-&alfa;-tubulina | Sigma-Aldrich | T5168 | Este anticorpo é caro, mas pode ser muito diluído e é altamente específico |
| Camundongo anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | Este anticorpo é caro, mas é altamente específico (um pré-requisito para In-Cell Westerns) |
| 800 nm Cabra anti-camundongo IgG | LI-COR | 926-32210 | Outras empresas também vendem anticorpos secundários infravermelhos. Certifique-se de comprar os anticorpos altamente adsorvidos e observe que as concentrações de IgGs podem variar de acordo com a fonte |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | Este composto costumava ser vendido pela LI-COR a 1 |
| mM Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminômetro | PerkinElmer | VICTOR3 1420 contador | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| de Pesquisa | Shaker / Mixer | International 248555 |
Referências
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
