Method Article

Um Método para o cultivo embrionário C. elegans Células

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In This Article

Summary

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Descrevemos aqui um protocolo revisto para a cultura em grande escala de embrionário C. elegans células. Embryonic C. elegans células cultivadas in vitro utilizando este método, parece diferenciar e recapitular a expressão de genes de uma forma específica de célula. As técnicas que necessitem de acesso directo para as células ou o isolamento de tipos específicos de células a partir de outros tecidos podem ser aplicadas em C. elegans células cultivadas.

Abstract

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C. elegans é um poderoso sistema de modelo, em que as técnicas genéticas e moleculares são facilmente aplicáveis. Até há pouco tempo, porém, as técnicas que requerem o acesso directo às células e o isolamento de tipos de células específicos, não pôde ser aplicada em C. elegans. Esta limitação foi devido ao facto de que os tecidos estão confinados dentro de uma cutícula pressurizado que não é facilmente digerida por tratamento com enzimas e / ou detergentes. Baseado no trabalho pioneiro por Laird Bloom, Christensen e seus colegas desenvolveram um método robusto para a cultura C. elegans células embrionárias em larga escala. Os ovos são isolados a partir de adultos grávidas por tratamento com lixívia / NaOH e subsequentemente tratado com quitinase para remover as cascas. As células embrionárias são, em seguida, dissociados por pipetagem manual e plaqueadas sobre substrato de vidro coberto, em meio enriquecido com soro. Dentro de 24 horas de celas de isolamento começam a diferenciar alterando a morfologia e expressando marke específico de célulars. C. elegans células cultivadas usando este método para sobreviver até duas semanas in vitro, e foram utilizados para electrofisiológico, imunoquímicos e de imagem, bem como as análises terem sido escolhidas e utilizadas para microsséries de perfilamento.

Introduction

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Caenorhabditis elegans (C. elegans) é um poderoso organismo modelo para investigar as bases moleculares da função celular, diferenciação e comportamento. Embora o seu genoma, metabólica e vias biossintéticas são semelhantes aos vertebrados ', a sua tratabilidade genética e molecular são muito maiores 2. Entre as suas vantagens são o seu tamanho e a anatomia simples, o seu ciclo de vida rápida (3 dias a 25 ° C), tempo de vida curto (2 semanas) e um grande número de descendentes (> 200). Devido à sua natureza hermafrodita e ciclo de vida curto, manipulações moleculares e genéticos são simples em C. elegans, incluindo a geração de animai....

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Protocol

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Os asteriscos (*) indicam passos novos ou modificados, quando comparados com Christensen et al. 1

1. Configuração de materiais

  1. O procedimento de cultura celular requer grandes quantidades de ovos isolados de adultos grávidas. Crescer C. elegans em 8P placas de agar semeadas com NA22 (disponível através da C. elegans genética Consórcio - CGC) bactérias para isolar grandes quantidades de ovos. Nestas placas de a quantidade de peptona utilizado é de 8 vezes a quantidade que é normalmente utilizada para placas NGM. A concentração mais elevada de peptona sustenta o crescimento das bactérias NA22....

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Results

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C. elegans células em cultura e diferenciar células expressam marcadores específicos

Christensen e colegas usando a coloração azul de tripan demonstrou que> 99% dos embrionário C. elegans células sobrevivem ao procedimento de isolamento. No dia 9, e 22 após o plaqueamento, 85% e 65%, respectivamente, estão ainda vivos 1. Isolada embrionário C. células elegans devem aderir a um substrato, a fim de se diferenciar. As células que não conseguem ader.......

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Discussion

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C. elegans é um poderoso organismo modelo para decifrar os caminhos genéticos envolvidos no desenvolvimento, comportamento e envelhecimento. A sua conveniência provém principalmente da facilidade com que ele pode ser manipulado geneticamente e do seu ciclo de vida curto. Apesar da sua conveniência, C. elegans tem suas limitações. C. elegans células são pequenas e confinado dentro de uma cutícula pressurizado que limita a aplicação de métodos que requerem o acesso directo às células, tais como .......

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranuladoVWR International Inc.90000-784
Bacto TriptonaVWR International Inc.90000-284
Extrato de levedura bactoVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Médio (1x) LíquidoInvitrogen11415-064
Soro Fetal BovinoInvitrogen16140-063
Penicilina-estreptomicinaSigmaP4333-100ML
Quitinase de Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Centro
Genética Lectina de AmendoimSigmaL0881-10MG
SacaroseSigma57903-1KG
D-(+)GlicoseSigma67528-1KG
Etilenoglicol-bis (2-amin– tiléter), N, N, N ', N'- ácido tetraácido (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Colesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl < sub > 2< / sub >SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigma S8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Etanol
Autoclavado destilado H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μ l Pontas de Pipeta Graduadas AzuisUSA Scentific1111-2821
10 ml Pipeta Esterilizada Embalada IndividualmenteUSA Scentific1071-0810
Volume Variável Ergonômico (100-1000 μ l) Pipetador com ejetor de pontaVWR International Inc.89079-974
Auxiliar de pipeta portátil, DrummondVWR International Inc.53498-103
Pipeta de plástico de transferência estérilVWR International Inc.14670-114
Tubo cônico de 15 ml USA Scentific1475-1611
Tubo cônico de 50 mlUSA Scentific1500-1811
Agulhas estéreis de calibre 18Becton, Dickinson and Co.
Seringas estéreis de 10 mlBecton, Dickinson and Co.
Filtros de Seringa de Plástico Corning 0,20 μ tamanho de poro M Corning431224
Acrodic 25 mm Filtro de seringa com 5 μ m versapor MembranaVWR International Inc.28144-095
60x15 mm Placa de Petri EstérilVWR International Inc.82050-548
Placa de Petri de 100x15 mm estérilVWR International Inc.82050-912
Lamínulas de vidro de 12 mm de diâmetroVWR International Inc.48300-560
Placas de Cultura de Células Transparentes 24 Poços Fundo Plano com tampa Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Pinça Fina Ferramentas de Ciência Fina11254-20
Centrífuga 5702Eppendorf022629883
Microscópio
Invertido com Objetiva
umidificada de ar ambiente
de305196305482 x10Incubadora

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.

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