É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Quantitativo

17.1K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/50677

⸱

23 de agosto de 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California, San Francisco, 2Graduate Program in Biomedical Sciences, University of California, San Francisco

Neste artigo

Resumo

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite a In vitro Quantificação de neutrófilo humano primário de ligação às células endoteliais activadas por mediadores inflamatórios, sob condições estáticas.

Resumo

O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na resposta inflamatória. Durante a fase aguda da inflamação, as células endoteliais (ECs) são activados por mediadores hospedeiras ou directamente por componentes microbianos conservados ou moléculas derivadas do hospedeiro de perigo. Activo CEs citocinas, quimiocinas e express de moléculas de adesão que mobilizam, activar e manter leucócitos no local da lesão ou infecção. Os neutrófilos são os primeiros a chegar leucócitos, e aderem ao endotélio através de uma variedade de moléculas de adesão presentes na superfície de ambas as células. As principais funções dos neutrófilos são para eliminar directamente as ameaças microbianas, promover o recrutamento de outros leucócitos através da liberação de fatores adicionais, e iniciar o reparo de feridas. Portanto, o recrutamento e fixação ao endotélio vascular é um passo crítico na iniciação da resposta inflamatória. Neste relatório, nós descrevemos um ensaio de adesão in vitro de neutrófilos utilizandocalceína AM marcada com neutrófilos humanos primários para quantificar a extensão da activação da célula endotelial microvascular sob condições estáticas. Este método tem a vantagem adicional de que as mesmas amostras quantificada por espectrometria de fluorescência também pode ser visualizada directamente através de microscopia de fluorescência para uma avaliação mais qualitativa da ligação de neutrófilos.

Introdução

Desde o endotélio vascular está em contato direto com o sangue circulante, que tem uma localização única para iniciar uma resposta inflamatória rápida durante a infecção ou lesão. As células endoteliais (ECs) de receptores de reconhecimento de padrões express que reconhecem uma variedade de componentes bacterianos conservadas e as moléculas de perigo, e receptores de mediadores inflamatórios hospedeiras, tais como o TNFa. A activação destes receptores induz a ECs para secretar citocinas (por exemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e para sobrerregular moléculas de adesão (por exemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) na sua superfície celular uma , 2. Estas moléculas de todos facilitar a localização de leucócitos aos locais de infecção e lesão a fim de limpar o exército dos agentes infecciosos e iniciar a reparação tecidual 3,4. A resposta de neutrófilos para a infecção envolve uma interação bem coordenada entre o endotélio vascular ea resposta neutrófilos. Após a ativação CE, IL-8 é segregada e que forma um gradiente intravascular sobre o endotélio, que permite que a casa de neutrófilos para o local da infecção ou lesão 5,6. E / P-selectinas mediata captura de neutrófilos e de rolamento através de associações relativamente fracos com glycomolecules na superfície celular de neutrófilos. Estas interacções, juntamente com a ligação de IL-8 aos seus receptores cognatos, facilitar a robusta ligação integrina-mediada e eventual detenção dos neutrófilos sobre a superfície de células endoteliais 7-10. Depois da prisão, os neutrófilos podem migrar para fora da vasculatura para os locais específicos de infecção para eliminar os patógenos directamente, gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos para prevenir a disseminação de agentes patogénicos, e promover a cicatrização de feridas libertam factores adicionais que recrutam leucócitos, tais como monócitos, macrófagos e dendríticas células 11-17.

Descritos neste relatório é um método in vitro para quantificar a adesão de neutrófilos para microVascular CEs após a ativação por parte do anfitrião mediador inflamatório TNF. Este ensaio foi concebido para avaliar a ativação de células endoteliais, e não neutrófilos. Neutrófilos humanos primários são primeiro isolados utilizando separação em gradiente de densidade, e depois são marcados com calceína acetoximetilo (AM). Esterases de células vivas no interior da hidrólise calceína AM de calceína a molécula altamente fluorescente com uma excitação de 492-495 nm e emissão de 513-516 nm, 18. Os neutrófilos marcados com fluorescência são então incubadas com monocamadas de EC, e os neutrófilos não aderentes são subsequentemente removidos. A fluorescência das restantes, neutrófilos ligados é então medido usando um espectrofotómetro de fluorescência, e calculada como uma percentagem de neutrófilos de entrada fluorescência total por poço. Este método tem a vantagem adicional de que os neutrófilos ligados marcados com calceína utilizados em espectrofotometria pode ser directamente visualizada utilizando microscopia de fluorescência para dar uma leitura mais qualitativa de ac CEvação. Uma vez que este ensaio é realizado em condições estáticas, apenas os eventos muito iniciais que ocorrem na cascata de adesão dos neutrófilos serão avaliados. Isto é confirmado no presente relatório usando anticorpos bloqueadores de E-selectina para mostrar que a adesão de neutrófilos a TNFa humano tratado com pulmão microvascular CE (HMVEC-pulmão) monocamadas é drasticamente reduzida quando a interacção com a E-selectina é interrompido.

Além de TNFa, temos utilizado com sucesso este ensaio para determinar a extensão da activação CE veia umbilical humana (HUVEC) pelo receptor Toll-like 1/2 agonistas lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) e e Pam3Cys ativação HMVEC-Lung por Pam3Cys 19,20. Além disso, foram utilizados com êxito este ensaio com os inibidores da quinase e depois knockdown RNAi mediada de superfície e proteínas citoplasmáticas em HMVEC-pulmonar, sugerindo que esta metodologia é compatível com uma variedade de bioquímica e screening ensaios 20. Em resumo, este ensaio proporciona um fácil de usar, forma reprodutível, mais funcional para aceder ao grau de activação CE por mediadores inflamatórios in vitro.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Chapeamento e manutenção das células endoteliais microvasculares

  1. Descongelar e crescer suas células endoteliais microvasculares acordo com os fabricantes fornecido instruções. Neste protocolo, as células foram cultivadas em EGM-2 media MV (Lonza), e recomenda-se que todas as experiências são realizadas no prazo de duas semanas de descongelamento para minimizar qualquer variação devido ao número de passagens. As experiências são realizadas com HMVEC-pulmonar entre as passagens 4-9.
  2. Dia 1: Quando as células atingem 80-90% de confluência, trypsinize e ressuspender em 120 mil células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por poço em 48 poços, placas de cultura de tecidos de poliestireno (es). Incluir poços de HMVEC que não serão incubadas com os neutrófilos a fim de obter uma leitura de fluorescência de fundo. A menos que usando placas de 48 poços projetados especificamente para ensaios de fluorescência, linhas alternadas ou colunas irá minimizar qualquer contaminação luz de poços vizinhos. NOTA: Wells pode ser pré-revestida com poli-Lysine, colagénio ou fibronectina.
  3. Dia 2: Adicionar novas mídias.
  4. Dia 3: A microscopia de contraste de fase, confirmar que as células são saudável (isto é, a aparência "Cobblestone" e pouco detritos de células), e eles são 100% confluentes (Figura 1). Se as células não são 100% confluentes, mudar os meios de comunicação a cada dia até que estejam prontos.
  5. Uma vez que as monocamadas HMVEC está pronto para o tratamento, lave as células uma vez com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e adicionar 0,3 ml de meio EGM-2 MV frescas ou meios contendo agonista inflamatória aos poços apropriados. Neste protocolo HMVEC-pulmão foram tratadas com TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, Nova Jersey), durante 3 horas uma vez que este é um activador bem descrito de ECs 21. NOTA: Recomenda-se que o tempo a sua experiência para que suas células HMVEC ativadas (Passo 4.1) e Calcein AM neutrófilos marcados (Passo 3.5) está pronto para usar ao mesmo tempo. Ela nos leva aproximadamente 2,5 horas para isolar e rotular neutrophils.

2. Isolamento de neutrófilos utilizando Polymorphprep

  1. Isolar neutrófilos, como descrito anteriormente 22, ou com uma solução de gradiente de densidade pronta para isolar granulócitos polimorfonucleares de sangue total. Empregando Polymorphprep seguindo o protocolo de Nuzzi, et ai. 2,007 resulta em rendimentos de cerca de 2-3 x 10 neutrófilos por seis ml de sangue total 23. NOTA: Para evitar a lise dos eritrócitos e excessivo, uma sedimentação de dextrano para remover os glóbulos vermelhos podem ser efectuadas antes da centrifugação em gradiente de densidade 24.
  2. Levar a solução do gradiente de densidade Polymorphprep à TA.
  3. Recolha de 30 ml de sangue total de um voluntário humano saudável, na presença de um anti-coagulante, como a heparina, citrato ou EDTA. O sangue deve ser usado dentro de 2 horas, e mantida entre 18-22 ° C.
  4. Camada 5 ml de sangue total ao longo de 5 ml da solução de gradiente de densidade num tubo cónico de 15 ml ( Figura 2A). Evite alterar volumes de sangue ea solução gradiente de densidade, pois isso pode alterar as condições de centrifugação subseqüentes.
  5. Centrifugar a 450 g durante 30 min a 18-22 ° C. Certifique-se de acelerar lentamente para cima e para baixo da centrífuga (ou seja, desligar o freio centrífuga), e equilibrar os tubos bem para evitar vibrações para ajudar a reduzir a ativação dos neutrófilos e evitar a mistura de camadas. Tempos de centrifugação mais longos ou força centrífuga maior irá resultar na camada inferior de leucócitos, que contém os neutrófilos, que migram mais para baixo em direcção às células vermelhas do sangue peletizadas.
  6. Aspirar o plasma e leucócitos banda superior contendo PBMC para evitar a contaminação da camada contendo neutrófilos (Figura 2B).
  7. Usar uma pipeta serológica 1-2 ml para eliminar a camada inferior contendo leucócitos neutrófilos. Combinar as camadas de neutrófilos em 30 ml de PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), de 50 mltubo cónico.
  8. Levar o volume até 50 ml com PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 18-22 ° C.

Nota: Os passos 2.9 e 2.10 são opcionais, mas altamente recomendado.

  1. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as neutrófilos em 8 ml de água estéril durante 30 segundos para lisar os glóbulos vermelhos, imediatamente adicionar a suspensão de células de 2 ml de 5x em PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +), e misturar suavemente à mão. NÃO incubar células água por mais de 30 segundos desde a morte de neutrófilos significativa pode ocorrer.
  2. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
  3. Lave as células uma vez com 10 ml de PBS (sem Ca 2 + e Mg 2 +) e centrifugar novamente a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
  4. Ressuspender as neutrófilos em 10 ml de meio RPMI-1640 (sem vermelho de fenol), e contar as células vivas utilizando o azul de tripanométodo de exclusão de corante e. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 6 por ml uma vez que este pode resultar na activação dos neutrófilos.

3. Neutrófilos Labeling com Calcein AM

  1. 6 x 10 5 neutrófilos são utilizados por poço de uma placa de 48 poços.
  2. Após a contagem, a transferência das células ressuspensas para um tubo de 50 ml e dilui-cónica os neutrófilos a 2-4 x 10 6 culas por ml com vermelho fenol livre de RPMI-1640.
  3. Adicionar solução de calceína AM de 3 uM (ou seja, 2,98 ul de calceína AM Estoque (1 mg / ml) por ml de meio) e misture bem sacudindo suavemente o tubo. Superior a 5 microns de calceína AM resultará no vazamento dos neutrófilos Nota:. Não-fluorescente calceína AM é clivada no interior das células por esterases endógenas para produzir a molécula altamente fluorescente calceína (isto é, as células mortas não ficam fluorescentes).
  4. Tapar o tubo com folha de alumínio e incubar fou 30 min a 37 ° C no escuro Nota:. tempos de incubação mais longo pode resultar em mais calceína ser libertado a partir dos neutrófilos ao longo do ensaio de adesão.
  5. Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, e lavar os neutrófilos 2x com 10 ml de RPMI-1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C). Após a ressuspensão das células para a segunda lavagem, passar primeiro os neutrófilos com um filtro estéril de 40 uM para remover aglomerados, e depois centrifugar mais uma vez a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
  6. Ressuspender as neutrófilos em meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C) a 2 x 10 6 por ml neutrófilos.

4. Ensaio de ligação de neutrófilos

  1. Lavar as monocamadas HMVEC 3x com 0,5 ml de filtro esterilizado (0,22 um) meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol), contendo 3% de BSA por poço.
  2. Aspirar a mídia e adicione 6 x 10 5 neutrófilos calceína-rotulados (0,3 ml de células suspension), ou 0,3 ml de meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) sem neutrófilos, aos poços apropriados da placa de 48 poços Nota:. Isto é o equivalente de 8 x 10 5 por cm 2 de neutrófilos.
  3. Incubar durante 20 min no banho a 37 ° C, 5% CO 2 incubadora.
  4. Fluorescência de neutrófilos totais (pré-lavagem) a medição da intensidade de fluorescência de cada poço com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm (conjunto de filtros de fluoresceína) num Fluostar, ou equivalente, com um espectrofotómetro. Executar esta etapa pouco antes do ponto final de incubação Nota: Neste protocolo, calceína excitação e a detecção da luz emitida foram realizadas a partir do topo dos poços a descoberto, no entanto, ambos também pode ser realizada a partir do fundo dos poços..
  5. Lavar os poços contendo monocamadas HMVEC e neutrófilos 5x com 0,5 ml por poço de PBS (w / Ca 2 + e Mg 2 +). Remova a mídia e lavagensinvertendo a placa e batendo suavemente sobre toalhas de papel para retirar o líquido restante.
  6. Adicionar 0,3 ml de volta de RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) por poço.
  7. Aderente a fluorescência de Neutrófilos (lavagem POST): medir a intensidade de fluorescência de cada poço como na etapa 4.4.
  8. Determinar a aderência e a adesão relativa cento por poço:

Nota: Nesta fase, as imagens dos neutrófilos marcados com calceína podem ser obtidas usando um microscópio de fluorescência equipado com capazes filtros de fluoresceína padrão. As imagens na Figura 4 foram obtidas em um microscópio invertido Olympus IX51 equipado com uma câmera 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Captura software Pro7 (Q Imaging).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

A fim de obter resultados fiáveis ​​e reprodutíveis usando um ensaio de ligação de neutrófilos, é essencial que a saúde e a confluência das células endoteliais microvasculares são óptimas no dia do ensaio, como se ilustra com HMVEC-pulmão na Figura 1. Além disso, é imperativo que o número baixo passagem microvascular ECs são utilizados (ou seja, menos de 9 passagens) e, consequentemente, recomendamos realizar todos os experimentos dentro de duas semanas de descongelamento. A saúde dos neutrófil...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Os passos mais críticos para uma bem-sucedida de neutrófilos / ensaio de adesão da célula endotelial microvascular são: 1) O uso do baixo número passagem (<9), células endoteliais saudáveis; 2) Manter os neutrófilos isolados com uma densidade baixa (ou seja, <5 x 10 6 células / ml) e usá-los dentro de duas horas de isolamento, e 3) lavagem Fastidious dos neutrófilos calceína AM-rotulados e uso dos neutrófilos calceína AM-rotulados em tempo hábil para minimizar a contaminação CE e perda de calce...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Anestesia e Cuidados perioperatórios UCSF.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HMVEC-LungLonzaCC-2527
EGM-2 MVLonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Placas de cultura de tecidos de 48 poçosBD Falcon353078
PBS (sem vermelho de fenol)Instalação de cultura de células UCSFCCFAL001Pode ser substituído por qualquer fornecedor
D-PBS (sem Ca2+ e Mg2+ e vermelho de fenol)Instalação de Cultura de Células UCSFCCFAL003Pode ser substituído por qualquer fornecedor
RPMI-1640 (sem vermelho de fenol)Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
calceína AMLife TechnologiesC3099(0,995 mM) estoque soln
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
40 μ Filtros MVWR21008-949Pode ser substituído por qualquer fornecedor
Espectrofotómetro FLUOstar OPTIMA BMGLABTECH-

Referências

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , 10, (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745(2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410(2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Ativação de Células EndoteliaisMarcação com Calceína AMEspectrofotometria de FluorescênciaMicroscopia de FluorescênciaIsolamento de NeutrófilosPreparação de PolimorfonuclearesTratamento com TNF AlfaInibição da P38 MAPK
Quantitativo
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.