Artigo de método

Microfabricação de Padrões de Ouro Nanoporosos para celular-primas estudos de interacção

DOI:

10.3791/50678

⸱

15 de julho de 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis , 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis , 3Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

Neste artigo

Resumo

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Nós relatamos em técnicas para micropattern nanoporous filmes finos de ouro através de impressão stencil e fotolitografia, bem como métodos para cultura de células sobre os padrões microfabricados. Além disso, descrevemos métodos de análise de imagem para caracterizar a morfologia do material e as células cultivadas utilizando electrónica de varrimento e técnicas de microscopia de fluorescência.

Resumo

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Materiais nanoestruturados com tamanhos recurso em dezenas de nanômetros têm melhorado o desempenho de várias tecnologias, incluindo as células de combustível, biossensores, revestimentos de dispositivos biomédicos, e ferramentas de administração de medicamentos. Ouro nanoporos (np-Au), produzido por um processo de auto-montagem nano-escala, é um material relativamente novo que apresenta grande área de superfície eficaz, de alta condutividade elétrica, e atividade catalítica. Estas propriedades tornaram-np Au um material atraente para a comunidade científica. A maioria dos estudos sobre a np-Au utilizar espécimes macro-escala e foco em ciência fundamental da suas aplicações catalíticas e sensor de materiais. Os espécimes macro-escala limitar o potencial de np-Au em sistemas miniaturizados, incluindo dispositivos biomédicos. A fim de abordar estas questões, inicialmente descrever dois métodos diferentes para micropattern np-Au filmes finos sobre substratos rígidos. O primeiro método utiliza máscaras de estêncil manualmente produzidos para a criação de milímetro escala padrões np-Au, while o segundo método usa lift-off fotolitografia para padrões sub-milímetro escala padrão. À medida que os filmes finos de NP-Au são obtidos por um processo de deposição por borrifamento, eles são compatíveis com as técnicas convencionais de microfabricação, assim passíveis de integração fácil em microssistemas. Estes sistemas incluem plataformas biossensor eletricamente endereçáveis ​​que beneficiam de área de alto eficaz superfície, condutividade elétrica, e bioconjugation superfície tiol à base de ouro. Descrevemos de cultura de células, a imunocoloração, e as técnicas de processamento de imagem para quantificar a interacção do np-Au com células de mamíferos, o que é um parâmetro de desempenho importante para algumas biossensores. Esperamos que as técnicas ilustradas aqui vai facilitar a integração das np-Au em plataformas em várias escalas de comprimento e em inúmeras aplicações, incluindo biossensores, sistemas de armazenamento de energia, e catalisadores.

Introdução

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Materiais com características nano-escala têm se mostrado promissora no reforço várias aplicações, incluindo as células de combustível 1, Sensores 2,3 E dispositivos biomédicos 4,5. Um material relativamente novo é ouro nanoporoso (np-Au), a qual é produzida por um processo de auto-montagem de nano-escala. O precursor de NP-Au é uma liga de ouro que mais comumente consiste em prata de 60% a 80% em percentagem atómica. Resumidamente, a característica de nanoestrutura de poros abertos, é o resultado do rearranjo de átomos de ouro em aglomerados como a prata é dissolvido por um ácido forte ( Por exemplo Ácido nítrico 70%) ou sob um potencial eletroquímico 6-8. Np-Au benefícios de vários atributos desejáveis, incluindo a grande área de superfície eficaz, de alta condutividade elétrica, técnicas de funcionalização de superfície bem estabelecidas, e biocompatibilidade 9. Embora tenha havido uma rápida expansão dos estudos sobre NP-Au, a maioria deles concentrar em propriedades mecânicas do np-Au 10,11, A atividade catalítica 12 E desempenho de detecção biomolecular 13-15. Embora os atributos desejáveis ​​são altamente úteis para várias ferramentas biomédicas 16,17, As aplicações nesta área têm sido limitados. Uma possível razão para isto é que a maioria dos estudos têm predominantemente utilizadas amostras de macro-escala ( Por exemplo Chapas, folhas, e lingotes) e as técnicas para a incorporação np-Au em sistemas miniaturizados permaneceram inadequada. Na verdade, há apenas um punhado de exemplos do uso de técnicas de microfabricação convencionais que utilizam filmes np-Au 16-20. Com o advento da tecnologia de miniaturização e a necessidade de novas ferramentas biomédicas, tornou-se essencial para ser capaz de se integrar novos materiais para dispositivos. Isso normalmente requer que os materiais podem ser depositados e modelado com técnicas convencionais de microfabricação. Além disso, a rápida quantificação das interacções célula-prima é geralmente necessária para avaliar a biocompatibilidade de um material novo. O objetivo deste artigo é demonstrar as técnicas básicas para micropattern np-Au filmes e quantificar tanto a nanoestrutura e as interações célula-material através de processamento de imagem digital.

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Protocolo

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1. Nanoporous Fabrication Ouro

  1. Substratos limpos em solução Piranha
    1. Adicionar 25 ml de peróxido de hidrogénio (30%) a 100 ml de ácido sulfúrico (96%) em um prato de cristalização e aquecer a mistura a 65 ° C numa placa de aquecimento. AVISO: Os líquidos são extremamente corrosivo e deve ser manuseado com cuidado. A solução passou não deve ser armazenado num recipiente fechado, como pode explodir.
    2. Coloque 1 polegada por lâminas de microscópio de 3 polegadas na mistura usando uma pinça anti-ácido e limpá-los por 10 min. Use um barco immunostaining porcelana para lote limpeza pequenas lamelas. Tratar com pequenas lamelas de plasma de ar de 10 W durante 30 segundos antes da imersão na solução.
    3. Lavar as amostras limpas em pratos de cristalização sob água corrente deionizada (DI) por 3 min. Amostras secar com uma arma de nitrogênio mais sem fiapos toalhas.
  2. Prepare máscara stencil (Método 1: Use este para a criação de padrões milímetros escala)
    1. Perfurador 250 folhas de elastômero de silicone m de espessura com biópsia socos e / ou fora inciso regiões com um bisturi sobre uma superfície de plástico semi-rígido. Limpe as folhas de elastômero processados ​​em 70% isopropanol e seco com arma de nitrogênio.
    2. Coloque a folha de soco em uma toalha que não solte fiapos sala limpa e alinhar as lamelas piranha-limpos sobre o estêncil com a superfície da amostra de frente para o stencil.
  3. Padrão lift-off photoresist (Método 2: Usar isso para a criação de padrões sub-milímetro escala)
    1. Coloque uma piranha-limpa lâmina de microscópio girando chuck e explodir a qualquer partículas com arma de nitrogênio. Pipetar 1,5 ml de promotor de aderência (hexametildisilazano) sobre a lâmina de vidro usando uma pipeta de plástico. Espalhar o promotor girando a corrediça, sucessivamente, a 500 rpm durante 5 segundos e 1500 rpm durante 30 segundos. Asse o slide numa placa de aquecimento a 115 ° C por 7 min e deixe esfriar por 5 min.
    2. Dispensar 4 ml de material fotosensitivo sobre a lâmina de vidro (de 3 polegadas by 1 polegada). Espalhar o material fotosensitivo, girando o diapositivo com o mesmo protocolo como para o promotor de adesão. Asse o fotorresiste numa placa de aquecimento a 115 ° C por 1,5 min e deixe esfriar por 10 min.
    3. Expor o slide photoresist revestido com luz UV (intensidade: 22 mW / cm 2) por meio de uma máscara de transparência por 15 s. Coza a fotorresistência sobre uma placa quente a 115 ° C durante 1,5 min e esperar durante 45 min. Dissolve-se o foto-resistente exposta no revelador durante pelo menos 3,5 minutos. Enxaguar abundantemente com água DI. Inspecione os padrões desenvolvidos sob um microscópio óptico.
  4. Metais precursores de depósito para produzir np-Au filmes finos
    1. Coloque as amostras em uma máquina de pulverização catódica, que pode depositar independentemente de ouro, prata e cromo. Sputter-limpar as amostras por 90 segundos a 50 W com menos de 25 mTorr atmosfera processamento argônio antes de iniciar a deposição de metal.
    2. Sputter chrome por 10 min a 300 W em 10 mTorr argônio. Sputter ouro por 90 segundos a 400 W under 10 mTorr árgon. Co-pulverização catódica ouro e prata por 10 minutos com a prata em 200 W e potência de 100 W. Au Desligue ouro pulverização catódica fonte de cerca de 10 segundos antes de desligar a fonte de prata por pulverização catódica.
  5. Obter precursoras micropadrões de metal
    1. Sonicar amostras fotosensitivo revestidos em ~ 180 ml de extractor fotorresistência durante 10 ciclos de 20 segundos de sonicação e 2 minutos de pausa entre os ciclos. Lavar as amostras com água DI e seque com um arma de nitrogênio. Inspecionar os padrões de metal sob um microscópio.
    2. Descasque o stencil elastômero a partir de amostras não-fotossensíveis revestidos utilizando duas pinças para revelar o metal depositado.
  6. Dealloy precursor de metal e nanoestrutura modify via tratamento térmico
    1. Encher um copo de vidro de 200 ml com 170 ml de ácido nítrico (70%) e manter a temperatura da solução a 55 ° C numa placa de aquecimento. CUIDADO: O ácido nítrico é extremamente corrosivo e deve ser manuseado com equipamentos de proteção adequados.
    2. Tratar com pequenas lamelas de plasma de ar de 10 W durante 30 segundos antes da imersão em ácido nítrico. Local 1 polegada por lâminas de microscópio de 3 polegadas no copo usando fórceps ácido-resistentes e dealloy los durante 15 min. Use um barco immunostaining porcelana para batch-dealloying pequenas lamelas.
    3. Lavar as amostras dealloyed por imersão sucessivamente em duas provetas cheias com água DI fresco três vezes. Armazenar as amostras em água DI e substituir a água com água DI fresco todos os dias por pelo menos uma semana. Amostras secar com uma arma de nitrogênio sobre toalhas que não soltem fiapos antes do uso.
    4. Coloque as amostras em uma pastilha de silício limpa em um equipamento de processamento térmico rápido. Ajustar a temperatura para valores entre 200 ° C e 450 ° C e a taxa de rampa de 10 ° C / seg. Expor as amostras à temperatura prescrita durante 10 min sob azoto ambiente. Deixe a câmara fria (<100 ° C) e retirar as amostras. Alternativamente, lentamente colocar as amostras sobre a placa para tratam térmicaent.

2. Cultura de Células

  1. Prepare amostras np-Au para cultura de células
    1. Coloque np-Au amostras em pratos de poliestireno e tratar com plasma de ar de 10 W durante 30 segundos e transferir as amostras para placas de cultura de tecidos de 24 poços.
    2. Adicionar 500 ul de meio de cultura completo (Meio Eagle Modificado por Dulbecco com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina) a cada poço. Armazenar num incubador humidificado a 37 ° C e 5% de CO 2 até semeando as células (<1 hr).
  2. Células manter, de passagem, e semente
    1. Manter as células de interesse (neste caso, os fibroblastos 3T3-NIH ou astrócitos murinos) em frascos T75 com meios de cultura e de passagem, quando as células são de 70% confluentes.
    2. Para passaging das células, remove material da garrafa, lavar duas vezes com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionar 2 ml de 1x tripsina / EDTA e as células a incubar até separar (~ 5 minutos). Adicionar 3 ml novas mídias ecentrifugar a 1200 rpm durante 3 min. Aspirar o sobrenadante e suspender o sedimento em media de 2 ml.
    3. Remova o material gasto a partir dos poços e as células das sementes para as lamelas de vidro com uma densidade de 25.000 células / cm 2 com um volume final de 1 ml. Agite a placa de cultura voltada para trás e direita-esquerda para garantir um revestimento uniforme de células sobre as amostras. Incubar as células até a análise ao inspecionar diariamente.

3. Celular e Análise de Material

  1. Stain células para visualizar citoesqueleto e núcleos
    1. Remova a mídia passou dos poços e lavar as células duas vezes com PBS. Fixar as células em 4% de paraformaldeído em PBS, durante 15 min.
    2. Preparar a solução de coloração a 300 nm com Alexa Fluor 488 faloidina em PBS com 1% de albumina de soro bovino.
    3. Lave as células duas vezes com PBS, e elas permeabilizar em 500 ul 0.1% Triton X-100 em PBS durante 5 min.
    4. Lave as células duas vezes com PBS e transferi-los para limpar poços. Blot 50 - 200 mL de solução de coloração para as amostras e armazenar em escuro por 20 min.
    5. Lavar as células com PBS e de contra-coloração com 3 nM de DAPI em PBS durante 5 min.
    6. Lavar as células com PBS, e mergulhe em água deionizada antes da montagem em lâminas de vidro com tampa meios de montagem e vedação com claro unha polonês.
  2. Aquisição de imagens de amostras np-Au e culturas de células em superfícies np-Au
    1. Superfícies imagem np-Au com microscópio eletrônico de varredura (MEV) com ampliação de 50.000 X em 10 kV de energia do elétron usando detector de elétrons secundários.
    2. Capturar imagens de células compostas em diferentes pontos nas amostras utilizando um microscópio de fluorescência invertido em aumento de 10x com os cubos de filtros adequados.
  3. Processamento de imagens para determinar a morfologia dos poros e celular
    1. Abertura de imagens no ImageJ e dividida em canais individuais se aplicável. Converta as imagens em 8 bits, subtrair o fundo, e alisá-los por filteri medianang. Ajuste o limiar de forma manual ou por built-in limiarizar algoritmos para destacar os poros (vazios) e corpos celulares / núcleos.
    2. Use o comando divisor de águas para separar poros incorporadas ou células. Definir parâmetros de análise de partículas e executar o comando para extrair o número de partículas, área média e cobertura por cento de partículas. Use imagens de células DAPI manchadas para contagem celular e imagens de células phalloidin manchadas para quantificar a cobertura de celular por cento.
    3. Modifique os arquivos de macro incluídos para realizar a análise de múltiplas imagens em lote.

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Resultados

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A Figura 1 apresenta os principais passos processuais, incluindo a criação de padrões de np-Au, cultura de células, quantificando a nanoestrutura, e caracterizar a morfologia celular. A matriz de elastómero mostrado na Figura 2a (superior) é usada para criar os padrões de np-Au mostrados nas imagens subjacentes. Figura 2b é uma fotografia do barco de porcelana para amostras de processamento em lote. Figura 2c mostra a mudança de cor dos padrões de metal...

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Discussão

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Nós demonstramos duas técnicas diferentes para micropattern np-Au filmes para a expansão do uso destes filmes em microssistemas e estudos biológicos. Sputter ouro e prata-revestimento é um método versátil para criar padrões de np-Au, como pulverização catódica é compatível com os processos convencionais de microfabricação e da composição da liga e a espessura pode ser facilmente controlada através da variação das potências individuais pistola de pulverização (para objectivos de ouro e prata) e o tempo de deposição, resp...

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Divulgações

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Os autores não têm interesse financeiro conflitantes.

Agradecimentos

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O. Kurtulus e D. Dimlioglu são suportados por um laboratório taxas Research Award Programa Universidade da Califórnia 12-LR-237197. P. Daggumati é apoiado por uma Universidade da Califórnia Davis investimentos em pesquisa no (RISE) Prêmio de Ciência e Engenharia. CA Chapman é apoiado por um departamento de pós-graduação Áreas de Assistência de Fellowship Nacional Need. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Lab UC taxas Research, UC Davis RISE, e UC Davis Faculdade de Engenharia fundos start-up.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alvo de ouroLeskerEJTAUXX403A2Precursor da liga para a produção de np-Au
Alvo de cromoLeskerEJTCRXX353A2Camada adesiva
Alvo de prataLeskerEJTAGXX403A2Precursor da liga para a produção de np-Au
Barco de porcelanaThomas Scientific8542E40Usado para processar pequenas amostras
Ácido nítricoSigma-Aldrich43873Usado a 70% para desliga
Ácido sulfúricoJ.T Baker7664-93-9Usado a 96% para limpeza de piranhas
Peróxido de hidrogênioJ.T Baker7722-84-1Usado a 30% para limpeza de piranhas
Punções de biópsiaTed Pella150xxDisponível em vários tamanhos
Folhas de elastômero de siliconeRogers CorporationHT 6240Disponível em várias espessuras
HexametildisilazaneSigma-Aldrich440191-100MLUsado como promotor de adesão para resistência positiva
Microposit MF CD26Shipley38490Revelador de fotorresistência positiva
PRS 3000J.T BakerJT6403-5Removedor de fotorresistência positiva
Lamínulas de vidro circulares (12 mm)Ted Pella26023Usado como substrato para padrões de metal e cultura de células
Lâminas de vidro (1 x 3 polegadas)Ted Pella26007Usado como substrato para padrões de metal
Fita de poliimida KaptonVWR82030-950Usado para fixar elastômero
Máscaras de transparênciaCidade de saídaUsado em fotolitografia http://www.outputcity.com/ < / a >
limpador de plasmaHarrick PlasmaPDC-32GUsado para ativar superfícies de vidro
de pulverização catódicaKurt J. LeskerLAB18Usado para depositar metais
Máquina

Referências

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