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A microscopia de super-resolução baseada em localização pode ser aplicada para obter um mapa espacial (imagem) da distribuição de moléculas individuais marcadas com fluorescência dentro de uma amostra com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros. Usando proteínas fluorescentes fotoativáveis (PAFP) ou fotocomutáveis (PSFP) fundidas a proteínas de interesse, ou corantes orgânicos conjugados a anticorpos ou outras moléculas de interesse, a microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM) pode obter imagens simultâneas de várias espécies de moléculas dentro de células únicas. Usando a abordagem a seguir, populações de um grande número (milhares a centenas de milhares) de moléculas individuais são visualizadas em células individuais e localizadas com uma precisão de ~ 10-30 nm. Os dados obtidos podem ser aplicados para entender as distribuições espaciais em nanoescala de vários tipos de proteínas dentro de uma célula. Uma das principais vantagens dessa técnica é o aumento dramático na resolução espacial: enquanto a difração limita a resolução a ~ 200-250 nm na microscopia de luz convencional, o FPALM pode dimensionar o comprimento da imagem em mais de uma ordem de magnitude menor. Como muitas hipóteses biológicas dizem respeito às relações espaciais entre diferentes biomoléculas, a resolução aprimorada do FPALM pode fornecer informações sobre questões de organização celular que antes eram inacessíveis à microscopia de fluorescência convencional. Além de detalhar os métodos de preparação de amostras e aquisição de dados, descrevemos aqui a configuração óptica do FPALM. Uma consideração adicional para os pesquisadores que desejam fazer microscopia de super-resolução é o custo: as configurações internas são significativamente mais baratas do que a maioria das máquinas de imagem disponíveis comercialmente. As limitações dessa técnica incluem a necessidade de otimizar a marcação de moléculas de interesse em amostras de células e a necessidade de software de pós-processamento para visualizar os resultados. Descrevemos aqui o uso da expressão de PAFP e PSFP para obter imagens de duas espécies de proteínas em células fixas. A extensão da técnica para células vivas também é descrita.