Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

Summary

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Abstract

A microscopia de super-resolução baseada em localização pode ser aplicada para obter um mapa espacial (imagem) da distribuição de moléculas individuais marcadas com fluorescência dentro de uma amostra com uma resolução espacial de dezenas de nanômetros. Usando proteínas fluorescentes fotoativáveis (PAFP) ou fotocomutáveis (PSFP) fundidas a proteínas de interesse, ou corantes orgânicos conjugados a anticorpos ou outras moléculas de interesse, a microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM) pode obter imagens simultâneas de várias espécies de moléculas dentro de células únicas. Usando a abordagem a seguir, populações de um grande número (milhares a centenas de milhares) de moléculas individuais são visualizadas em células individuais e localizadas com uma precisão de ~ 10-30 nm. Os dados obtidos podem ser aplicados para entender as distribuições espaciais em nanoescala de vários tipos de proteínas dentro de uma célula. Uma das principais vantagens dessa técnica é o aumento dramático na resolução espacial: enquanto a difração limita a resolução a ~ 200-250 nm na microscopia de luz convencional, o FPALM pode dimensionar o comprimento da imagem em mais de uma ordem de magnitude menor. Como muitas hipóteses biológicas dizem respeito às relações espaciais entre diferentes biomoléculas, a resolução aprimorada do FPALM pode fornecer informações sobre questões de organização celular que antes eram inacessíveis à microscopia de fluorescência convencional. Além de detalhar os métodos de preparação de amostras e aquisição de dados, descrevemos aqui a configuração óptica do FPALM. Uma consideração adicional para os pesquisadores que desejam fazer microscopia de super-resolução é o custo: as configurações internas são significativamente mais baratas do que a maioria das máquinas de imagem disponíveis comercialmente. As limitações dessa técnica incluem a necessidade de otimizar a marcação de moléculas de interesse em amostras de células e a necessidade de software de pós-processamento para visualizar os resultados. Descrevemos aqui o uso da expressão de PAFP e PSFP para obter imagens de duas espécies de proteínas em células fixas. A extensão da técnica para células vivas também é descrita.

Introduction

Embora existam estruturas celulares em uma ampla gama de escalas espaciais, a imagem de fluorescência da organização celular em escalas de comprimento menores que ~250 nm é restrita na microscopia convencional devido à restrição física do limite de difração. Esse limite foi superado com o advento da microscopia de localização de fotoativação por fluorescência (FPALM¹) e técnicas semelhantes^2,3, que podem localizar um grande número de moléculas individuais com precisão de ~ 10 nm, para gerar imagens com resolução de algumas dezenas de nanômetros. O FPALM é baseado no uso de controle óptico para ativar e inativar subconjuntos de moléculas (para uma descrição completa do FPALM e instruções sobre como implementar esse sistema de imagem, consulte Gould et al.⁴). Esta técnica permite que as distribuições espaciais de populações inteiras de moléculas únicas sejam mapeadas, elucidando assim estruturas biológicas em escalas de comprimento que variam de dezenas de nanômetros a dezenas de mícrons. A microscopia de super-resolução baseada em localização (doravante denominada microscopia de localização) foi agora adaptada para abordar uma série de questões biológicas, com desenvolvimentos tecnológicos permitindo, por exemplo, a imagem de orientações moleculares individuais com polarização FPALM, ou P-FPALM⁵, a imagem de fluorescência de moléculas únicas em três dimensões com Biplane FPALM⁶ ou outras técnicas^7-9e a imagem de fluorescência de super-resolução de moléculas únicas em células vivas^10-12. A microscopia de localização também foi aplicada à imagem de várias espécies em células fixas^13-16. Recentemente, três espécies de proteínas foram simultaneamente visualizadas com FPALM em células fixas e vivas¹⁷. A microscopia de localização pode obter imagens de amostras marcadas de várias maneiras: exemplos incluem proteínas expressas com etiquetas de fusão PAFP ou PSFP, anticorpos ou moléculas marcadas com corantes orgânicos enjaulados ou corantes orgânicos convencionais. Embora o uso de corantes fluorescentes convencionais permita a marcação de proteínas na ausência de uma etiqueta de proteína de fusão, as condições geralmente exigidas para o uso de corantes orgânicos não enjaulados em imagens de super-resolução exigem que as amostras sejam imersas em tampões redutores². Além disso, a entrega intracelular de conjugados anticorpo-corante normalmente requer que as células sejam fixadas e suas membranas permeabilizadas, ou requer que as células vivas sejam permeáveis por eletroporação ou algum outro meio. Os requisitos para reduzir as condições de tampão e permeabilização da membrana limitam a adequação dos corantes orgânicos para imagens de células vivas, embora desenvolvimentos recentes tenham permitido o uso efetivo de HaloTags e FPALM para imagens de estruturas de membrana¹⁸.

FPALM foi a primeira técnica de microscopia de localização a ser aplicada a células vivas¹⁰. Em células vivas, além de fornecer um mapa espacial dependente do tempo das localizações das moléculas marcadas, o FPALM pode rastrear moléculas únicas em vários quadros e trajetórias moleculares determinadas em escalas de tempo de milissegundos¹⁹. Assim, o FPALM fornece acesso a escalas de tempo bastante curtas e resolução em nanoescala.

O FPALM multicolorido pode ser usado para uma variedade de sondas diferentes, incluindo proteínas fotoativáveis e corantes orgânicos enjaulados ou não enjaulados. Aqui fornecemos detalhes sobre o protocolo e a configuração para a imagem simultânea de duas espécies de proteínas fluorescentes, Dendra2 e PAmCherry. Relatamos os resultados da imagem de PAmCherry conjugada à beta actina (PAmCherry-actina) e Dendra2 conjugada à hemaglutinina influenza (Dendra2-HA) em fibroblastos NIH-3T3. Os componentes descritos na configuração podem ser trocados por outro hardware mais adequado para a imagem de outras sondas. Quando for esse o caso, tentamos ser explícitos no texto.

Multicolor FPALM é ideal para relatar as distribuições espaciais de várias espécies de proteínas em células vivas ou fixas. Esta técnica é especialmente adequada para investigar relações espaciais e/ou dinâmicas em escalas espaciais de comprimento nanométrico, embora as imagens relatem a localização em uma variedade de escalas de comprimento, de dezenas de nanômetros a dezenas de mícrons. Uma grande vantagem do FPALM multicolorido é que a configuração é relativamente barata de construir e muito flexível para uso com várias combinações de sondas. O processo de construção e calibração do sistema a partir de componentes também fornece uma compreensão considerável dos fatores que podem comprometer a qualidade e a interpretabilidade dos dados e, portanto, o resultado da pesquisa. Detalhamos aqui os métodos para a configuração óptica, preparação de amostras e aquisição de dados de várias espécies de proteínas, com construções de fusão PSFP e PAFP, usando FPALM. Embora este protocolo descreva a análise de células fixas, esses procedimentos são prontamente aplicáveis à imagem de células vivas.

A configuração óptica aqui descrita é ideal para a aquisição simultânea de imagens do PSFP Dendra2 e do PAFP PAmCherry. Muitas outras sondas podem ser usadas para imagens multicoloridas; no entanto, os componentes precisos necessários podem variar, dependendo dos espectros de excitação e emissão das sondas escolhidas. As escolhas de espelhos dicróicos, filtros e comprimentos de onda de laser devem ser feitas com base nessas considerações.

Protocol

Observação: Uma representação diagramática dos componentes ópticos referenciados neste protocolo pode ser encontrada na Figura 1.

1. Preparação de amostras de células

1. Células de placa em uma densidade otimizada (para células NIH-3T3, isso é aproximadamente 2-5 x 10⁴ células/cm²) em poços de uma câmara de 8 poços. As células devem ser plaqueadas em meios completos apropriados ao tipo de célula, embora os meios devam ser feitos sem antibióticos e sem vermelho de fenol, o que contribui para a fluorescência de fundo. Observe que as condições para experimentação celular, como o intervalo ideal de números de passagem, podem diferir para linhagens celulares individuais.
2. Incubar as células durante 24 horas a 37 °C e 5% de CO₂ (ou em condições adequadas ao tipo de célula) para permitir que as células adiram à lamínula. Células transfectas com DNA livre de endotoxina para cada uma das duas construções de espécies de proteínas (neste caso, DNA para PAmCherry-actina e Dendra2-HA). Cubra a amostra com material impermeável à luz, como folha de alumínio. A transfecção deve incluir poços com ambas as construções de DNA e poços com apenas uma de cada uma dessas construções.
3. Incubar durante 4-6 horas, 37 °C e 5% de CO₂ (ou em condições adequadas ao tipo de célula), antes de mudar para um meio completo (com antibióticos, sem vermelho de fenol) e incubar durante 16-48 horas para permitir que as células expressem as proteínas desejadas.
   1. As células podem ser fixadas lavando três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois incubadas com paraformaldeído (PFA) a 4% (CUIDADO: Tóxico) em PBS por 15 min em RT e, em seguida, lavando mais 3x com PBS. No entanto, dependendo das proteínas de interesse, essa fixação pode resultar em um conjunto considerável de moléculas marcadas que ainda são móveis. Para reduzir ainda mais a mobilidade, métodos alternativos de fixação incluem o uso de metanol 100% resfriado ou gluteraldeído a 0,2% e PFA a 4% em PBS por >30 min a 25 °C²⁰. Em qualquer um dos métodos, as células devem ser lavadas com PBS como acima. Observe que o uso de gluteraldeído pode aumentar a fluorescência de fundo ou autofluorescência em algumas condições de imagem e pode exigir um tratamento pós-fixação com borohidreto de sódio²¹.
4. A amostra pode ser mantida a 4 °C, imersa em PBS, selada em um filme autovedante, por até 7 dias antes da obtenção de imagens.

2. Alinhamento do microscópio

1. Coloque uma escala de calibração (retículo) no microscópio stage. Usando uma objetiva de 10X e a lâmpada para luz transmitida, centralize o retículo no centro do campo de visão (FOV).
2. Iluminação Köhler. Ajuste o microscópio para iluminação Köhler²². Para começar, feche a abertura de campo e, olhando através das oculares, concentre-se no retículo. Se as bordas da abertura do campo estiverem fora de foco, ajuste a altura do condensador até que a abertura do campo e o retículo estejam em foco.
3. Ajuste a posição lateral da abertura do campo até que esteja centralizada em relação ao FOV. Feche a abertura do campo até que apenas a grade central do retículo esteja iluminada.
4. Para um alinhamento grosseiro da posição da câmera (ou seja, a primeira vez que a configuração é alinhada), use uma alta intensidade lamp com o obturador da câmera FECHADO e não coloque nenhum componente na caixa B (Figura 1), no caminho óptico até que a etapa 2.5 seja alcançada. Não coloque L2 e L3 no caminho de detecção ao alinhar a câmera pela primeira vez. Centralize aproximadamente a imagem do retículo no obturador da câmera ajustando a posição vertical e horizontal da câmera (Figura 2B). Desative o ganho EM, desligue as luzes da sala e abra o obturador da câmera.
5. Depois de reduzir a intensidade da lâmpada para um nível que não danifique o sensor da câmera, projete a luz da imagem do retículo diretamente no sensor da câmera (Figura 2A). Foque o retículo ajustando o botão de foco do microscópio enquanto visualiza a imagem no modo de vídeo ao vivo no software de aquisição. Centralize a imagem do retículo no sensor da câmera ajustando a posição vertical e horizontal da câmera (Figura 2B).
6. Coloque L2 e L3 no caminho de detecção entre a abertura e a câmera (Figura 2C). Alinhe L2 e L3, de modo que L2 seja uma distância focal do ponto focal da porta de saída do microscópio e L3 seja uma distância focal do sensor da câmera. A distância entre L2 e L3 deve ser idealmente igual à soma das distâncias focais de L2 e L3, mas pode ser ajustada um pouco para acomodar restrições de espaço. A câmera e as lentes devem estar na mesma altura da porta de saída.
7. Observe que a luz emitida pelo microscópio deve estar centrada em L2 e L3. Ajuste a distância entre L2 e o microscópio para garantir que a imagem do retículo esteja em foco nítido na câmera e através das oculares.
8. Se necessário, pequenas translações (por exemplo, <1 mm) de L2 e L3 podem ser usadas para centralizar a imagem do retículo no sensor da câmera.
9. Módulo de duas cores. Depois que a posição da câmera for otimizada, afixe os componentes mostrados na caixa B (Figura 1) no caminho de detecção. Esses componentes podem ser afixados em um suporte removível, de modo que todo o módulo possa ser inserido para FPALM multicolorido ou removido para outras aplicações FPALM que não o exijam.
10. Na primeira vez que esses componentes forem montados, ajuste os comprimentos de caminho de cada canal para serem iguais. Projete o retículo no chip da câmera, ajuste M7 e M9 e/ou feche a abertura de detecção (AP) para evitar sobreposição espacial entre os dois canais. Focalize a imagem do retículo no canal de luz refletido.
11. Se a imagem no canal de luz transmitida não estiver focada, translade M9 (e rode se necessário) até que a imagem do retículo esteja focada simultaneamente em ambos os canais. Observe que os dois canais devem ser deslocados lateralmente um do outro (Figura 2D). Esse deslocamento, seja horizontal ou vertical, pode afetar a velocidade de aquisição. Para mais informações, consulte o manual do usuário da câmera.
12. Grave um instantâneo da escala do retículo (para uso posterior no cálculo da ampliação geral). Usando o software da câmera, selecione a região de interesse desejada. Taxas de quadros mais altas geralmente serão possíveis para uma região de interesse menor.

3. Alinhamento a laser

1. Ligue os lasers de leitura e ativação. (CUIDADO: Os lasers só devem ser usados depois que os operadores passarem por treinamento de segurança a laser.) Todas as portas do laboratório devem permanecer fechadas, com apenas pessoal essencial treinado dentro do laboratório enquanto os lasers estão sendo alinhados. Use obturadores SH1 e SH2 para bloquear os feixes de leitura e ativação, respectivamente, quando não estiverem em uso, e filtros ND para atenuar as potências do laser a níveis seguros (<1 mW). É útil minimizar toda a iluminação da sala durante o alinhamento, exceto a iluminação necessária para a segurança.
2. Bloqueie os feixes de ativação e leitura. Remova L1 do caminho do laser.
3. Coloque um flush de carta branca contra M4. A maioria dos microscópios compostos comerciais tem um obturador embutido para bloquear a iluminação recebida. Se disponível, abra o obturador do microscópio e foque até que a imagem do retículo se projete em M4. Se um obturador interno do microscópio não estiver disponível, use um obturador externo em um local conveniente que bloqueie a entrada de todos os feixes de laser no microscópio.
4. Laser de leitura de centralização no FOV. Desbloqueie o feixe de leitura. Centralize o feixe de leitura na mira da imagem do retículo em M4 ajustando M1.
5. Projete a imagem do retículo em M5 e ajuste o espelho M4 até que o feixe esteja centralizado na mira da imagem em M5, de modo que o feixe de leitura seja centralizado com a mira do retículo em M4 e M5. Bloqueie o feixe de leitura.
6. Laser de ativação de centralização no FOV. Projete a imagem do retículo em M3 e remova o expansor de feixe (BE) do caminho do laser. Desbloqueie o feixe de ativação.
7. Ajuste M2 para centralizar o feixe de ativação na mira da imagem do retículo em M3. Uma vez centralizado, recoloque o BE entre M2 e M3 e ajuste a posição do BE até que o feixe esteja centralizado na mira da imagem do retículo em M3.
8. Usando uma objetiva de 10X, projete a imagem do retículo em M5, ajustando o botão de foco do microscópio, se necessário, para obter o foco. Ajuste o ângulo de DM1 até que o feixe de ativação esteja centralizado na imagem do retículo. Bloqueie ambas as vigas.
9. Sem objetiva no lugar e com o obturador do microscópio aberto, projete o laser de leitura através da abertura traseira do microscópio. (CUIDADO: Esta etapa cria um risco de segurança do laser ao direcionar um feixe de laser paralelo em um caminho vertical desbloqueado.) Ajuste M5 até que o feixe saia diretamente do microscópio e pouse no teto diretamente acima, ou seja centralizado em um cartão colocado no suporte da objetiva na torre.
10. OPCIONAL: A determinação do alinhamento correto pode ser facilitada pelo uso de uma amostra de corante em solução (neste caso, Rodamina B a ~ 100 μM em água ou metanol com profundidade de >0,5 cm para fins visuais), colocada no estágio de amostra com a lente objetiva 60X no lugar. Se o feixe estiver alinhado corretamente, a objetiva projetará um cone de fluorescência alinhado com o eixo da objetiva e do microscópio. Pequenos desvios no posicionamento do feixe de laser na abertura traseira da objetiva farão com que o cone se afaste de um alinhamento puramente vertical.
11. Bloqueie ambas as vigas. Monte L1 no caminho do laser a uma distância apropriada (ou seja, uma distância focal) da abertura traseira da lente objetiva. Com a objetiva 60X instalada, permita que o feixe de leitura se projete no teto. Ajuste a posição horizontal e vertical de L1 (perpendicular à direção de propagação do laser) até que o feixe esteja centralizado acima do microscópio. Nota: nesta etapa, a viga formará um ponto maior do que na etapa anterior.
12. A posição axial de L1 e sua distância focal afetarão o tamanho da área iluminada na amostra. Estritamente falando, o cálculo do perfil de iluminação na amostra deve levar em consideração a difração²³. Grosso modo, no entanto, colocar L1 a uma distância axial diferente de uma distância focal do plano focal traseiro da objetiva causará, em muitos casos, um perfil de iluminação a laser menor e mais intenso do que quando L1 está exatamente a uma distância focal do plano focal traseiro. Uma área iluminada menor pode ser usada para produzir uma intensidade de laser mais alta para determinadas aplicações, como imagens de alta velocidade, por exemplo.
13. Medição do perfil do feixe de leitura. Com L1 no lugar, coloque uma amostra de solução de corante concentrada apropriada (neste caso, Rodamina B a ~ 100 μM em água) no palco.
14. Com o laser de ativação bloqueado, projete o laser de leitura (ajuste ND1 para obter uma potência <<1 mW para todos os feixes expostos) através da objetiva de 60X e no corante, e (com o ganho EM desativado) envie esta imagem para a câmera.
15. Concentre o objetivo na amostra. Para esta etapa, é necessária uma abertura grande o suficiente para permitir a aquisição de imagens do perfil de feixe completo.
16. Translade o PA lateralmente para que o centro do perfil da viga e o PA sejam concêntricos. Usando o software da câmera, escolha a região de interesse para permitir a menor região de leitura da câmera encapsulando ambos os canais. Registre essas coordenadas. Grave um único instantâneo (este é o perfil do feixe de leitura).
17. As imagens que refletem mais corretamente o perfil do laser no plano focal serão obtidas quando a amostra da solução de corante for o mais fina possível. Uma amostra tão fina pode ser criada colocando uma gota de ~ 5 ul de solução de corante entre uma lâmina de microscópio e uma lamínula.
18. Medição do perfil do feixe de ativação. Bloqueie o laser de leitura. Projete o laser de ativação na amostra; e projete essa imagem para a câmera.
19. Se necessário, use o ganho EM <100 e ajuste o DM1 até que o feixe esteja centralizado em cada FOV. Registre um instantâneo do perfil do feixe de ativação.
20. Meça a potência de cada feixe. Remova a solução de corante e coloque um sensor do medidor de potência sobre a objetiva de 60X (sem meio de imersão). Meça a potência de cada feixe (ativação e leitura) separadamente. Observe que a posição do medidor de potência deve ser ajustada cuidadosamente para garantir que toda a potência do laser emitida atinja o sensor do medidor de potência.
21. Para cada laser, use filtros de densidade neutra (ND1 e ND2) para ajustar a potência para produzir intensidades na amostra apropriada para o experimento.
22. Intensidade do laser de leitura para aquisição de imagens. A intensidade do laser de leitura deve ser alta o suficiente para excitar e fotobranquear moléculas individuais dentro do intervalo de tempo de alguns quadros. Os valores típicos são 10^{3-10 4} W/^cm2 (ver também Gould et al.⁴). A intensidade na amostra depende do tamanho da área da imagem, portanto, a potência necessária para atingir a intensidade desejada varia de sistema para sistema.
23. Intensidade do Laser de Ativação. A intensidade do laser de ativação deve ser escolhida de modo que o número de moléculas ativas seja pequeno (por exemplo, 1-100) em qualquer quadro de aquisição. Grosso modo, a densidade desejada é alcançada quando a distância mais próxima entre as moléculas ativas é ligeiramente maior que a resolução limitada por difração (consulte também a Seção 6, Imagens). À medida que a população de moléculas individuais inativas diminui, são necessárias intensidades mais altas do laser de ativação. As intensidades típicas são ^{10-1-10 2} W/cm².
24. Otimize a placa de quarto de onda. A placa de quarto de onda (QWP) é opcional, mas aumentar o grau de polarização circular dos lasers de leitura e ativação com um QWP pode aumentar a densidade da molécula nas imagens finais. Para otimizar o QWP, coloque um polarizador entre o QWP e o M5. Bloqueie o laser de ativação. Projete o laser de leitura em um medidor de potência sobre a objetiva seca de 60X.
25. Registre o ângulo do QWP. Ajuste o polarizador até o máximo e, em seguida, as potências mínimas são alcançadas. Registre cada um desses valores e calcule a proporção de mínimo/máximo. Ajuste o ângulo do QWP e repita essas medições. Embora seja desejável obter valores próximos de 1,0, uma proporção de >0,8 é suficiente para a geração de imagens.

4. Criando uma amostra durável de contas para alinhamento de canal

1. Diluir uma amostra de esferas fluorescentes (de 40-100 nm de diâmetro) 1:70 em água de qualidade HPLC. Diluir ainda mais esta solução-mãe 1:15 em água HPLC, para um volume final de 200 μl de suspensão de grânulos em água.
2. Cubra uma lamínula com poli-L-lisina líquida. Incubar em RT por 30 min. Aspirar para remover a solução e lavar a lamínula três vezes com água de HPLC. Aspirar todos os vestígios de água da lamínula e deixar secar em temperatura alta.
3. Pipetar 200 μl da suspensão do cordão para a lamínula. Deixe esta lamínula por 20 min em RT antes de lavar três vezes com água HPLC. Em alternativa, deixe a lamínula O/N à direita para permitir que a suspensão seque.
4. Usando ~ 20 μl de água HPLC ou meio de montagem, monte a lamínula em uma lâmina de vidro. Sele a periferia da lamínula com esmalte transparente. Depois que o polidor secar, coloque a lamínula (e o meio de imersão da objetiva apropriado; água ou óleo) na objetiva 60X.

5. Aquisição de imagem: Amostra de grânulo de imagem para alinhamento de canais de detecção

1. Ilumine a amostra do cordão com o feixe de laser de leitura a uma intensidade aproximadamente 10X menor do que a que será usada para imagens. Com o ganho EM definido como 100, projete a imagem para a câmera e ajuste o foco até que as contas fiquem visíveis em ambos os canais.
2. Se as contas estiverem fracas, aumente a potência do laser ou o ganho EM. A minimização do ruído nas imagens de esferas (detectando um grande número de fótons, ou seja, pelo menos 5.000 no total de cada conta) é fundamental para o registro preciso do canal. Configure a câmera para gravar 100 quadros, com o mesmo tempo de exposição que será usado para imagens FPALM subsequentes.
3. Procure regiões onde os grânulos estão distribuídos no centro e na periferia dos canais e onde a densidade do grânulo é baixa o suficiente para que os grânulos individuais estejam bem separados e possam ser identificados individualmente.
4. Adquira entre 10-20 conjuntos de imagens de diferentes regiões nessas densidades de contas. Consulte a seção de resultados para obter detalhes sobre como usar as imagens de contas para calibração de canais.

6. Aquisição de imagem: FPALM multicolorido

1. É importante obter imagens de células que foram transfectadas com apenas uma de cada uma das construções, bem como registrar imagens de células com todas as construções. Esses dados ajudarão a estabelecer os histogramas alfa de cada uma das sondas usadas e são necessários para a interpretação de dados multicoloridos.
2. Encontre células que expressam sondas fotocomutáveis, se em uso. Elimine toda a iluminação da sala. Projete a lâmpada de mercúrio, através do suporte flip (FM), na amostra (contendo células transfectadas). Mudar o cubo do filtro da torre para um que contenha a combinação dicróica de espelho/filtro adequada, a fim de permitir a excitação do estado pré-fotocomutado do rótulo. Por exemplo, para imagens pré-fotocomutadas de Dendra2, ou sondas com uma emissão pré-comutada verde, uma opção para DM4 é um dicróico que reflete a luz azul (<488 nm) e para F5 é um filtro que passa luz de ~ 500-570 nm, enquanto bloqueia a luz fora dessa faixa.
3. Usando a ocular, procure as células que estão expressando a sonda pré-fotografada. Por exemplo, as células que expressam Dendra2 aparecerão verdes. Observe que nem todas as sondas são fotocomutáveis e, dependendo de seus espectros de emissão pré-comutados, aquelas que são podem exigir combinações de DM4 / F5 diferentes das listadas aqui.
4. Uma vez que uma célula é escolhida, mova o FM para baixo para permitir que os lasers passem para o microscópio (bloqueie a luz de mercúrio do caminho). Mude a torre do filtro para aquela que contém o dicróico apropriado para imagens (neste caso, DM2 deve refletir tanto a leitura quanto o laser de ativação, enquanto transmite comprimentos de onda mais longos, e F1 deve transmitir comprimentos de onda para o vermelho do laser e, idealmente, apresentar alta supressão no comprimento de onda do laser).
5. Se as células não expressarem uma sonda fotocomutável, procure células projetando a imagem para a câmera e usando o laser de leitura para iluminar a amostra. Moléculas únicas provavelmente serão visíveis (veja a Figura 3) em muitas das células.
6. Para distinguir as células transfectadas da fluorescência de fundo (que ainda podem aparecer como moléculas piscando individualmente) e para confirmar que as moléculas são fotoativáveis, ilumine brevemente a amostra com uma baixa potência do laser de ativação (normalmente de ordem microwatts). O número de moléculas fotoativáveis visíveis sob o feixe de leitura deve aumentar drasticamente e permanecer alto por um curto período de tempo, mesmo depois que a iluminação de ativação for novamente bloqueada. Observe que diferentes sondas podem variar consideravelmente em brilho, eficiência de fotoconversão e potência do laser necessária para ativação^24-27.
7. Prepare o software da câmera para uma aquisição em série cinética definindo o ganho EM para 200 e escolhendo o número desejado de quadros (normalmente 5.000-10.000) e o tempo de exposição (normalmente 10-30 ms é apropriado). Embora o ganho EM possa ser definido acima de 200, além de um certo ponto, aumentar o ganho EM pode aumentar o ruído.
8. Bloqueie o feixe de ativação. Desbloqueie o feixe de leitura e projete a imagem da célula iluminada para a câmera.
9. Confirme se a célula está transfectada (etapa 6.6). Enquanto visualiza a célula, ajuste o foco até que o plano focal desejado esteja visível e as moléculas estejam em foco nítido.
10. Para escolher um plano focal que visualize perto da membrana celular inferior, mude o foco para baixo até que as moléculas individuais não sejam mais visíveis. Em seguida, mova gradualmente o foco para cima até que as moléculas se tornem visíveis.
11. Para obter imagens próximas à membrana celular superior, continue a aumentar o foco na quantidade desejada, observando a distância usando o botão de foco do microscópio ou o foco automático. A escolha de uma região de foco entre esses dois limites resultará em uma região no meio da célula que está sendo fotografada.
12. Desbloqueie o feixe de ativação e ilumine a amostra com uma intensidade baixa (use os filtros ND2 para atenuar o feixe para uma intensidade muito baixa, aproximadamente <1 W/^cm2 na amostra).
13. Comece a aquisição de dados. Uma alta densidade de moléculas ativas é desejada; no entanto, é fundamental para as etapas de análise que essas moléculas não se sobreponham espacialmente.
14. Tente manter uma densidade de moléculas fotoativáveis visíveis de ~ 0,1-1 ^μm-2 ajustando ND2. Normalmente, para uma região de imagem ~ 10-20 μm de diâmetro, haverá ~ 10-100 moléculas visíveis ao mesmo tempo (consulte as Figuras 3 e 4 para referência). À medida que o número de moléculas inativas restantes diminui ao longo da aquisição, a potência do laser de ativação pode precisar aumentar gradualmente para manter a densidade.
15. Se a imagem TIRF for desejada*, M5 e L1 devem ser montados em um único estágio de translação (TS, Figura 1) para serem movidos lateralmente (ou seja, em uma direção perpendicular ao laser logo atrás da entrada do microscópio). À medida que M5 e L1 são transladados, os lasers que saem da objetiva para cima através da amostra irão gradualmente inclinar-se para um lado (CUIDADO: risco de segurança do laser).
16. À medida que o ângulo dos lasers atinge 90° da vertical, o próprio laser emergente desaparecerá, o laser de leitura de entrada será refletido para trás, emergindo como um feixe viajando para fora da abertura traseira da objetiva, antiparalelo ao feixe de entrada e deslocado para o lado.
17. Simultaneamente, a fluorescência de fundo se tornará quase totalmente atenuada e a espessura da região da amostra contendo moléculas únicas discerníveis e focadas será bastante reduzida.
    *TIRF permitirá a aquisição de imagens de uma seção fina da amostra que está ~100-500 nm acima da lamínula. A imagem de planos focais que estão mais para dentro da amostra é facilmente obtida usando iluminação de campo amplo (Seção 3), mas não é apropriada para TIRF.
    
18. Após a conclusão da aquisição, feche o obturador do microscópio imediatamente e bloqueie os dois feixes. Desative o ganho EM, defina a câmera para gravar um quadro e defina a região de leitura da câmera para seu tamanho máximo.
19. Bloqueie um canal colocando uma placa sobre F3 ou F4. Com um filtro passa-longo (>580 nm) montado na lâmpada do microscópio, ilumine a amostra e projete esta imagem para a câmera. Registre um instantâneo da célula.
20. OPCIONAL: Com um canal ainda bloqueado, abra a abertura para que uma grande área da amostra seja visível pela iluminação da luz transmitida. Grave um instantâneo. Essas imagens de luz transmitida são muito úteis para visualizar o contexto das imagens FPALM correspondentes.
21. Imagem de células vivas. Para obter imagens de células vivas, transfecte as células de acordo com as etapas 1.1-1.3, mas não corrija essas amostras. Em vez disso, alinhe a configuração conforme descrito acima na íntegra, mas antes de obter amostras de imagem, remova-as de 37 ° C e 5% de CO₂, lave 3x em PBS e mergulhe a amostra em meios de imagem (por exemplo, PBS com 20 mM de glicose). A remoção dos meios de cultura e a lavagem reduzirão o fundo associado à maioria dos meios celulares.
22. As amostras podem ser visualizadas em RT, se desejado, como células fixas, ou a 37 ° C e 5% de CO₂ com o uso de um estágio de incubação montado no estágio do microscópio. Uma única amostra de células NIH 3T3 deve ser imersa em meios de imagem por não mais do que aproximadamente 1 hora. Pode ser útil monitorar como as células respondem à imersão em meios de imagem antes de se prepararem para experimentos desse tipo, para otimizar o tempo de imersão e, potencialmente, a composição dos meios de imagem para reduzir a perturbação das células.

Results

A hemaglutinina (HA) da influenza forma clusters da ordem de dezenas de nanômetros a micrômetros, e esses clusters colocalizam de forma variável com a actina (Figura 5). Essas distribuições espaciais corroboram imagens em escala mais grosseira dessas duas proteínas²⁸ e a dependência das distribuições espaciais de HA na actina¹⁹. Imagens FPALM multicoloridas podem ser usadas para descrever a densidade, área e perímetro desses clusters e o grau de colocalização entre as duas espécies ...

Discussion

A imagem de super-resolução baseada em localização fornece muitos recursos poderosos para imagens biológicas. A rota de componentes ópticos individuais colocados na mesa para um microscópio funcional de super-resolução capaz de obter imagens simultâneas de várias espécies fluorescentes em uma amostra biológica apresenta uma série de desafios. Alguns aspectos do alinhamento são mais críticos do que outros; Nós nos esforçamos abaixo para fornecer orientação aos usuários em potencial que lidam com os aspectos mais difíceis ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Câmaras LabTek II	Nunc
Contas fluorescentes	Invitrogen	F-8801	Esferas para calibração
Contas Tetraspeck	Invitrogen	T-7279	Quatro contas de cores para calibração
Óleo de imersão de objetiva	Zeiss	518F	Óleo de imersão para objetiva de alta NA (dependendo da escolha da objetiva)
Água HPLC	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	Ou Cellgro 10-090
Antibióticos	GIBCO	15070-063
soro	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Tripsina	MPBiomedicals
paraformaldeído	Fisher Scientific	AA433689M	CUIDADO: Tóxico