Artigo de método

Usando um sistema automatizado de rastreamento 3D para registrar indivíduos e cardumes de peixes-zebra adultos

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DOI:

10.3791/50681

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5 de dezembro de 2013

 ,  , 
1R&D, xyZfish

Neste artigo

Resumo

O uso de um sistema de vídeo automático 3D que pode rastrear indivíduos e grupos de peixes-zebra é descrito. Como exemplo de aplicação, exploramos os efeitos do antagonista do receptor NMDA MK-801 em cardumes de peixe-zebra.

Resumo

Como muitos animais aquáticos, o peixe-zebra (Danio rerio) se move em um espaço 3D. Portanto, é preferível usar um sistema de gravação 3D para estudar seu comportamento. O sistema de rastreamento automático de vídeo apresentado consegue isso usando um sistema de espelho e um procedimento de calibração que corrige o erro considerável introduzido pela transição da luz da água para o ar. Com este sistema é possível gravar tanto um único quanto grupos de peixes-zebra adultos. Antes de usar, o sistema deve ser calibrado. O sistema consiste em três módulos: Gravação, Reconstrução de Caminho e Processamento de Dados. São apresentados os protocolos passo a passo para calibração e utilização dos três módulos. Dependendo da configuração experimental, o sistema pode ser usado para testar neofobia, aversão branca, coesão social, deficiências motoras, exploração de novos objetos, etc. É especialmente promissor como uma ferramenta de primeiro passo para estudar os efeitos de drogas ou mutações em padrões comportamentais básicos. O sistema fornece informações sobre a distribuição vertical e horizontal do peixe-zebra, sobre os componentes xyz dos parâmetros cinemáticos (como locomoção, velocidade, aceleração e ângulo de giro) e fornece os dados necessários para calcular os parâmetros de coesão social ao testar cardumes.

Introdução

O peixe-zebra tornou-se um modelo importante para a pesquisa biológica e farmacológica1-3. O rastreamento dos padrões de movimento e distribuição espacial de peixes-zebra individuais e de cardumes de peixes-zebra é inestimável. Estudos mais antigos aplicam quantificação manual com base em imagens gravadas4. Agora, os sistemas automáticos de rastreamento de vídeo 2D são comumente usados5. No entanto, como o peixe-zebra e muitos outros animais aquáticos e não aquáticos se movem em um espaço tridimensional, o interesse em sistemas 3D está crescendo6. O sistema 3D descrito foi publicado pela primeira vez em 20077. Para detalhes técnicos e comparações com outros sistemas, consulte8. A vantagem básica deste sistema em comparação com outros sistemas é que ele adquire duas (opcionalmente três) visualizações síncronas e independentes usando um sistema de espelhamento e que usa um protocolo de calibração em duas etapas. Na primeira etapa, a geometria 3D do sistema estéreo (formado pela câmera e pelos espelhos) é calibrada. Na segunda etapa, os erros não lineares introduzidos pela refração da luz são corrigidos. Ao estudar animais aquáticos, o impacto da refração da luz pode ser considerável quando não corrigido. Outros sistemas publicados até agora (mesmo desenvolvimentos mais recentes9) omitem o procedimento de calibração em duas etapas. Para detalhes técnicos sobre identificação de objetos, oclusão com rastreamento de vários objetos, ruído de jigging, etc. o leitor é encaminhado para as publicações originais8,9. O sistema foi validado para o estudo de respostas comportamentais semelhantes à ansiedade10,11, cardumes8,11,12 e, em estudo preliminar, para comportamento antagônico em peixe-zebra13. Também foi testado para outras espécies de peixes (peixinho dourado8, espada, farpa de tigre) e para camundongos9.

A seguir, os protocolos de calibração e uso do sistema são descritos e os resultados de um experimento que testa os efeitos do antagonista não competitivo do receptor NMDA MK-801 no cardume de peixe-zebra são apresentados como um exemplo representativo para demonstrar o tipo de dados que podem ser obtidos com o sistema.

Tanto no ambiente natural quanto em aquários, o peixe-zebra geralmente nada em cardumes14. As preferências de cardume parecem depender de vários fatores, como criação, sexo e disponibilidade de alimentos14,15. Curiosamente, a distância entre o peixe-zebra individual em um cardume torna-se menor quando sinais de perigo potencial estão presentes, como feromônios de alarme16 ou novidade11. O paradigma do cardume também está sendo usado para testar drogas ansiolíticas17. As hierarquias de dominância18 e a aprendizagem social19 são aspectos fascinantes do comportamento do peixe-zebra. Devido ao seu caráter comportamental social altamente desenvolvido, o peixe-zebra também se tornou de interesse para a pesquisa do autismo20,21.

MK-801 foi relatado para alterar o comportamento social em peixe-zebra5,22,23, o que é uma reminiscência de seus efeitos em mamíferos24. No entanto, o MK-801 também tem muitos outros efeitos em outros comportamentos (como comportamento de natação, evitação inibitória e preferênciade lugar 25-27). Portanto, é crucial, em experimentos iniciais, obter o máximo de informações possível a partir de observações básicas. Isso fornecerá a base para a concepção de experimentos mais direcionados.

Levantamento do aparelho de registo e do software

Em sua configuração atual, o contêiner de observação (25 cm x 25 cm x 18 cm, C x L x A), contendo o peixe-zebra, é posicionado na câmara de observação (91 cm x 46 cm x 56 cm, C x L x A). A câmara também contém uma câmera, um espelho suspenso em um ângulo de aproximadamente >45° acima do recipiente e barras de luz LED. A Figura 1 mostra um diagrama simplificado. A câmera registra a vista frontal e a vista superior (espelho) para construir as trajetórias 3D do peixe-zebra, determinando suas coordenadas x, y e z. Para fins de orientação, os vetores de coordenadas são apresentados no canto frontal esquerdo do contêiner de observação (posição em relação à câmera), que corresponde aos vetores apresentados nas visualizações 3D (por exemplo, Figura 15) geradas pelo Módulo de Reconstrução de Caminho (veja mais abaixo). A taxa de amostragem depende da câmera e do computador. Em nossos experimentos, é de aproximadamente 40 quadros / s (fps). A resolução espacial dos quadros gravados é de 640 x 480 pixels (essa configuração foi escolhida como equilíbrio ideal entre resolução espacial e temporal). É necessário o Windows XP ou superior.

Antes da primeira gravação, o sistema deve ser calibrado para determinar a localização das paredes do recipiente e da superfície da água, para determinar o fator de escala dos quadros gravados e para ajustar o erro considerável gerado pela refração da luz ao passar da água para o ar. Em princípio, a calibração só deve ser realizada durante a instalação inicial e depois que partes da configuração, como câmera ou espelho, forem movidas ou substituídas. No entanto, é uma boa prática verificar periodicamente se a calibração ainda está correta e recalibrar, se necessário.

O software consiste em três módulos. O Módulo de Gravações registra os quadros (dois quadros de exemplo são mostrados na Figura 2). O Módulo de Trajetória reconstrói os caminhos de cada peixe-zebra. O Módulo de Processamento de Dados calcula uma gama de parâmetros cinemáticos e espaciais padrão. Para fins de análise posterior, os dados podem ser importados para planilhas ou software estatístico.

Protocolo

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia do Instituto Nacional de Saúde para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório.

1. Calibração

  1. Coloque um recipiente de observação vazio na câmara de modo que os pés do recipiente sejam inseridos nos orifícios previstos para o alinhamento correto. Oriente o recipiente de forma que as paredes semitransparentes (o objetivo de sua estrutura é reduzir os reflexos) fiquem voltadas para o outro lado e para a direita da câmera.
  2. Abra o Módulo de Gravação, selecione 'Controle da câmera' e ajuste 'ganho' e 'obturador' (depois de desmarcá-los, caixas à direita) para que a imagem fique nítida. Coloque o espelho lateral em um ângulo de aproximadamente 45° no lado esquerdo do recipiente de observação para que o lado view do recipiente no monitor do computador é totalmente visível. Além disso, o espelho deve ser alinhado de modo que a parede frontal do recipiente seja vista como uma linha (conforme indicado pela seta na figura 3).
  3. Conecte o painel de calibração à porta paralela (do cartão da câmera) e pressione o botão 'Painel de LED liga/desliga' no Módulo de Gravação para ligar os LEDs.
  4. Coloque o painel de calibração no recipiente de observação vazio de forma que os 5 LEDs possam ser vistos na frente, na parte superior e lateral no monitor do computador como na Figura 3 (às vezes o cabo bloqueia a visualização, neste caso mova-a). Certifique-se também de que os LEDs estão abaixo das marcas do nível da água (estas marcas estão gravadas nos recipientes de observação a 135 mm do fundo interior do tanque) e que a posição do painel é estável (para que não se mova ao encher o recipiente com água no passo 1.9).
  5. Apague as luzes da câmara de observação e feche a cortina (cuidado para não tocar no cabo do painel de calibração ou no espelho lateral).
  6. Pressione o botão 'Localização de dados' e crie ou selecione uma pasta para os arquivos de calibração. Esses arquivos serão usados para todas as gravações (ou experimentos) subsequentes até que a recalibração seja necessária. Portanto, o ideal é tornar os dados de calibração parte do nome da pasta de calibração.
  7. Ajuste as três caixas vermelhas na tela do computador de forma que cada uma englobe apenas os 5 LEDs em qualquer uma das três visualizações (Figura 4, painel esquerdo). Novamente, use 'ganho' e 'obturador' em 'Controle da câmera' para obter imagens nítidas dos LEDs, sem imagens de outros pontos de luz (que são devidos a ruído, reflexos ou gotículas de água na parede do recipiente), como na Figura 4, painel direito.
  8. Desligue os LEDs e pressione o botão 'Coletar calibração sem água'. Na tela do computador, aparecem 5 tags ('x') numeradas de 0 a 4. Ligue o painel. As localizações das tags devem coincidir com os LEDs. Caso contrário, repita a etapa 1.7 (consulte a Figura 4 para obter a ilustração da atribuição incorreta de tags no painel esquerdo e a atribuição correta de tags no painel direito).
  9. Encher a câmara de observação com água até ao ponto de referência. Os LEDs devem estar abaixo do nível da água (conforme explicado na etapa 1.4). Se estiverem acima do nível da água, esvazie o recipiente e volte ao passo 1.4. Ao encher a água no recipiente, tome cuidado para que o painel de LED não se mova. No entanto, se isso acontecer, esvazie o recipiente e volte para a etapa 1.4. Isso é importante, porque a calibração é baseada na determinação das diferenças entre as posições dos LEDs registrados sem e com água.
  10. Pressione o botão 'Coletar calibração com água'. Novamente, como na etapa 1.8, cinco tags aparecerão na tela, que na maioria dos casos serão ligeiramente deslocadas daquelas obtidas durante a calibração sem água. Nesta etapa, o ganho e o obturador podem ter que ser reajustados. Repita até que as tags sejam colocadas corretamente em cima dos LEDs (como na Figura 4, painel direito).
  11. Acenda as luzes na câmara de observação, ajuste o ganho e o obturador (em 'Controle da câmera') para que a imagem não fique excessivamente brilhante.
  12. A Figura 5 mostra os seis pontos que devem ser selecionados sequencialmente clicando com o botão direito do mouse. Certifique-se de que os pontos estejam nas linhas designadas: 1. nível da água da vista frontal, 2. crista superior esquerda do recipiente na vista superior, 3. linha vertical que delineia a parede frontal na vista lateral. O comprimento da linha não é essencial. Entre clicar nas posições 1 e 2, 3 e 4 e 5 e 6, linhas retas aparecerão (os números não aparecerão na tela). Pressione 'Coletar informações do contêiner' para salvar essas informações.
  13. Remova o espelho lateral e o painel de LED e encha a água exatamente até a marca. Selecione 'Iniciar gravação'. Uma nova janela solicita a duração em minutos. Para o propósito atual, 1 minuto é suficiente. Pressione OK.
  14. Após a gravação, saia do Módulo de Gravação, abra o Módulo de Trajetória, selecione a pasta de calibração (feita na etapa 1.6) com 'Localização de Dados' (o carregamento do arquivo pode levar algum tempo). Esta pasta contém os arquivos de calibração e os arquivos dos dados recém-gravados (etapa 1.13).
  15. Pressione o botão 'Adquirir plano de fundo'. Uma nova janela é aberta, sem alterar nada, pressione OK. Aguarde até que uma imagem (de cabeça para baixo) do tanque de observação apareça no monitor. Em seguida, pressione 'Carregar plano de fundo'. A imagem de fundo será corrigida. Uma nova janela é aberta solicitando o ajuste das caixas. Basta pressionar OK.
  16. Pressione sequencialmente do terceiro ao sétimo botão: 'Carregar correspondência sem água', 'Calibrar câmera(s) virtual(is)', 'Carregar correspondência refratada', 'Coletar geometrias de contêineres', 'Recuperar informações do contêiner animal'. Esta última etapa pode levar vários minutos. É concluído quando três linhas brancas aparecem na tela (que são as linhas que foram desenhadas na etapa 1.12). Pressione o botão "Salvar informações do contêiner".
  17. Pressione o botão 'Coletar volume'. Agora, como mostrado na Figura 6, marque consecutivamente os 8 cantos do corpo d'água, que é um paralelepípedo. Para cada ponto, primeiro clique nele na vista frontal e depois na vista superior.
  18. Selecione '3D' no canto esquerdo da janela. Agora uma nova janela se abre mostrando o contorno de uma caixa com fundo branco (como na Figura 15, mas sem a trajetória). Clique com o botão direito do mouse para selecionar rotações e translações da visualização da caixa. Se nenhuma imagem aparecer ou se a imagem não for de um paralelepípedo (ou seja, na etapa 1.17 os cantos foram clicados com o botão direito do mouse na ordem errada), faça o seguinte: ao sair, mas não fechar o Módulo de Trajetória, usando o Windows vá para a pasta de calibração (feita na etapa 1.6), selecione a subpasta 'Dados do contêiner animal' e exclua o arquivo chamado TankVertices e repita a etapa 1.17.
  19. Parabéns, a calibração está concluída. Idealmente, um teste com um peixe fictício deve ser realizado para verificar se tudo funciona bem. A boa notícia é que a recalibração só deve ser realizada se as posições do espelho ou da câmera forem (mesmo que ligeiramente) alteradas ou se houver problemas com o rastreamento (consulte a seção 3).

2. Gravação

  1. Coloque o recipiente de observação cheio até as marcas com água na câmara de observação, de modo que os pés do recipiente sejam inseridos nos orifícios previstos para o alinhamento correto. Oriente o contêiner de forma que as paredes semitransparentes (ou paredes brancas em nosso exemplo - consulte Discussão) fiquem voltadas para o outro lado e para a direita, conforme visto da câmera.
  2. Acenda as luzes do compartimento, coloque o peixe (experimental ou fictício) no recipiente e feche as cortinas. Nota: o sistema pode registrar vários peixes (consulte a seção Resultados representativos); no entanto, é aconselhável ganhar alguma experiência com o sistema registrando primeiro um único peixe.
  3. Abra o módulo de registro. Na tela aparece a imagem da vista frontal e superior (espelho) do contêiner. A imagem pode não ser ideal (por exemplo, superexposta, por exemplo, Figura 7) e pode ter que ser ajustada (próximas três etapas) para obter um bom contraste entre o peixe e o fundo (por exemplo, Figura 8).
  4. Selecione 'Controle da câmera' e, na janela 'Configurações gerais' que se abre, ajuste 'Obturador' e 'Ganho' (depois de desmarcar as caixas correspondentes à direita, consulte a Figura 9) de forma que a imagem não fique superexposta e haja um bom contraste entre o peixe e o fundo.
  5. No lado esquerdo da janela 'Controle da câmera', selecione 'Balanço de branco/cor' e, na nova janela, desmarque a caixa 'Auto' e ajuste os valores de vermelho e azul (consulte a Figura 10) para obter o melhor contraste de cores na frente e na parte superior.
  6. Pode ser necessário alternar algumas vezes entre ajustar a cor (em 'Balanço de branco/Cor') e ajustar o ganho e o obturador (em 'Configurações gerais') para obter a melhor configuração da câmera. Esteja ciente de que, mesmo que você fique satisfeito sem nenhum ajuste, é crucial desmarcar as caixas 'Obturador', 'Ganho' e 'Automático' (conforme explicado nas etapas 2.4 e 2.5), caso contrário, o fundo flutuará ao longo da gravação, o que impossibilita a extração das trajetórias. Não altere nenhuma das outras configurações. Quando terminar, feche a janela 'Controle da câmera'.
  7. No menu principal do Módulo de Registro, selecione 'Local de dados' para criar ou abrir uma pasta criada anteriormente. Observe que cada gravação (por exemplo, peixe ou cardume) recebe sua própria pasta, que idealmente deve ser uma subpasta da pasta do experimento.
  8. Pressione 'Iniciar gravação'. Abre-se uma janela que solicita a duração da gravação em minutos (insira apenas números inteiros). Pressione 'OK', que inicia a sessão de gravação real.
  9. Se a gravação estiver concluída, saia do programa. Antes de gravar o próximo peixe, é recomendável reiniciar o computador. Use a opção Reiniciar no Windows para preservar as configurações da câmera (das etapas 2.4 e 2.5). A necessidade de reiniciar o computador entre as gravações deve-se a alguns problemas com a placa da câmara.
  10. Antes de ir para o Módulo de Trajetória para reconstrução do caminho, copie e cole as subpastas 'Dados do contêiner animal' e 'Dados de correspondência' da pasta de calibração (feita na seção um deste protocolo) em todas as pastas que foram criadas durante a gravação. Nestas últimas pastas, duas outras subpastas estão presentes, ou seja, 'Dados brutos' e 'Carimbos de data/hora'. O primeiro contém todos os quadros gravados no formato JPEG; Este último contém informações sobre o número total de quadros e os intervalos entre os quadros (em ms).

3. Reconstrução do caminho

  1. Abra o Módulo de Trajetória, pressione 'Localização de dados' para selecionar a pasta que foi criada com o Módulo de Registro e, em seguida, pressione o botão 'Configuração do sistema' para abrir os 'Parâmetros' (consulte a Figura 11).
  2. Selecione os limites de cor da vista superior e inferior. Um bom valor inicial é 1.000. Se esse valor for baixo, é mais provável que o software grave ruído. No entanto, se o valor for muito alto, o peixe pode estar abaixo da faixa de detecção. Mais tarde (etapas 3.11 e 3.12), pode ser necessário reajustar os limites de cor. Observe também que os limites de cor superior e inferior não precisam ser os mesmos.
  3. Selecione os limites de tamanho da vista superior e inferior. Um bom valor inicial para um peixe-zebra de médio porte é 10, para um muito grande 20 e para um muito pequeno 5. Quanto maior o limite de tamanho, menor a probabilidade de captar ruído. No entanto, se for muito alto, o software também pode não ser capaz de detectar os peixes. Novamente, nas etapas 3.11 e 3.12, pode ser necessário reajustar os limites de tamanho. Observe também que os limites de tamanho superior e inferior não precisam ser os mesmos.
  4. Para 'Limite de tamanho superior', um valor de 3.000 geralmente é bom e para 'Comprimento específico' deixe-o em 220 (já predefinido). O 'Número de peixes' refere-se ao número de peixes no tanque de observação. 'Número máximo de pontos' refere-se ao número total de quadros. Lembre-se (ou anote) esse número ou um pouco menor (por exemplo, 45.703 pode ser memorizado como 45.000). Pressione OK.
  5. Pressione sequencialmente os botões 'Carregar correspondência sem água', 'Calibrar câmera(s) virtual(is)' e 'Carregar informações do contêiner do animal'. Uma mensagem de erro será gerada se as subpastas de calibração 'Dados do contêiner animal' e 'Dados correspondentes' não forem copiadas para a pasta experimental atual (consulte a etapa 2.10). Em caso afirmativo, copie e cole essas subpastas agora e pressione os botões novamente.
  6. Pressione o botão 'Adquirir plano de fundo'. Uma nova janela solicitará o preenchimento de 'de' e 'para' com os valores padrão 0 e 100, respectivamente. Altere o 100 para o número máximo de quadros (no exemplo dado na etapa 3.4, isso pode ser simplificado como 45.000). Pressione OK.
  7. Aguarde até que uma imagem (distorcida) apareça. Em seguida, pressione 'Carregar plano de fundo', o que resultará no estabelecimento da imagem de fundo correta. O peixe não deve ser visível nesta imagem de fundo. Se o peixe estiver visível, tente adquirir um fundo melhor de outros segmentos de gravação (por exemplo, tente 0-1.000, 1.000-2.000 etc. na etapa 3.6).
  8. Se o peixe não se moveu durante a sessão de gravação, a única maneira de adquirir um fundo é remover o peixe e fazer uma nova gravação curta sem o peixe, mas com as mesmas configurações de 'Controles da câmera' (isso é importante). Adquira o plano de fundo e copie a subpasta 'Dados em segundo plano' para a pasta experimental atual. Agora pressione 'Carregar plano de fundo', não pressione 'Adquirir plano de fundo'. Observe que abrir e fechar a cortina geralmente resulta em um fundo um pouco alterado, portanto, pode ser necessário ajustar os limites nas etapas 3.2 e 3.3 para reduzir o ruído. A etapa 3.11 mostra como verificar se há ruído.
  9. Depois de carregar o plano de fundo, ajuste as três caixas vermelhas (com a ajuda do mouse) conforme ilustrado na Figura 12. As caixas marcam as áreas em que o software está procurando os peixes. Feche a caixa à esquerda (ou seja, reduza-a a uma linha ou ponto) porque a vista lateral é usada apenas para calibração (como foi explicado na etapa 1.7).
  10. Pressione o botão 'Começar a gerar trajetórias'. Uma janela é aberta solicitando o número do quadro inicial. Vá com o padrão '0'. Depois de pressionar 'OK', a janela 'Atribuições de tags' é aberta (consulte a Figura 13). Pressione 'Avançar' até que o tag ('X0') apareça na tela. Se a etiqueta não for colocada na imagem do peixe, pressione 'Não' até que seja colocada corretamente. Em seguida, pressione 'Ir'. Se nunca for atribuído corretamente (ou de todo), pressione 'Ir' de qualquer maneira e procure o problema (próximo passo).
  11. A reconstrução do caminho começa. Idealmente, a etiqueta deve sempre (ou pelo menos na maioria das vezes) ser colocada na imagem do peixe. Se for colocado incorretamente, abra a janela 'Informações' (segunda opção acima da tela do vídeo). A Figura 14A mostra o caso ideal, onde apenas os contornos dos peixes são vistos. A Figura 14B mostra um caso de ruído excessivo que impede a atribuição correta de tags. Se você vir uma imagem nítida do peixe sem ruído (como na Figura 14A), mas a etiqueta nunca ou raramente será atribuída corretamente, o motivo mais provável é que a calibração está desativada. Recalibre e refaça a reconstrução do caminho. Se durante a calibração, o espelho e as câmeras não forem movidos, os novos dados de calibração podem ser usados para as gravações realizadas anteriormente.
  12. Em caso de ruído excessivo (como na Figura 14B), pressione 'Parar' no menu principal e escolha novos limites de cor e tamanho (etapas 3.2 e 3.3). Verifique também se as caixas vermelhas (passo 3.9) podem ser reduzidas um pouco (por exemplo, para excluir o ruído gerado pelos movimentos da água na parte superior). Observe que às vezes o programa está 'travado' (se nenhuma tag puder ser alocada): neste caso, reinicie o programa.
  13. Observe a trajetória na tela 3D (terceira opção acima da tela). Figura 15. representa um exemplo de trajetória. Ao clicar com o botão direito do mouse, selecione entre a rotação e as translações da configuração 3D.
  14. Quando a trajetória estiver concluída, pressione sequencialmente os botões 'Salvar' (não 'Parar', que exclui a trajetória!), 'Limpeza da trajetória' e 'Suavização da trajetória'. Uma nova janela é aberta mostrando os parâmetros de filtro para suavização (Figura 16). Não altere os valores padrão antes de ter adquirido mais experiência com o sistema. Pressione 'OK'.
  15. Até agora, deve estar claro por que escolher uma boa configuração de câmera (com bom contraste entre peixes e fundo) antes de gravar (consulte as etapas 2.4-2.6) foi tão importante. Prossiga para o processamento de dados.

4. Processamento de dados

  1. Primeiro, dê uma olhada na pasta que foi usada para registrar os peixes (Figura 17). Contém as subpastas «Dados do contentor de animais» e «Dados de correspondência» que foram copiadas da pasta de calibração (passo 2.10), as subpastas «Carimbos de data/hora» e «Dados brutos» que foram criadas durante o registo dos peixes e as subpastas «Dados de fundo» e «Trajetórias» que foram criadas durante a reconstrução do traçado.
  2. A Figura 17 também mostra que a subpasta 'Trajetórias' contém três arquivos. O point.smoothed-file é o arquivo que será usado para processamento de dados posterior. No caso de gravação de vários peixes (por exemplo, experimento de cardume), para cada peixe será gerado um arquivo point.smoothed separado.
  3. A Figura 18 mostra a parte superior de um exemplo point.smoothed-file. A primeira linha fornece o número total de amostras ou quadros, a segunda linha a duração da gravação (em minutos) e a terceira linha as coordenadas (sequência: x, z, y) do centro do corpo d'água em relação à câmera. Isso é seguido por uma linha para cada quadro, fornecendo as coordenadas x, y, z (em mm) para o peixe e a duração dessa amostra (em segundos).
  4. Existem duas maneiras de processar os dados fornecidos nos arquivos point.smoothed: use o Módulo de Processamento de Dados ou use outro software, como Excel ou MATLAB para fazer cálculos que (ainda) não estão incorporados no Módulo de Processamento de Dados.
  5. Abra o Módulo de Processamento de Dados, selecione 'Projeto' na barra de ferramentas e, no menu suspenso, selecione 'Novo' e preencha um nome para o experimento. Selecione 'Editar projeto' na barra de ferramentas, selecione 'Adicionar ao projeto' no menu suspenso, seguido de 'Novo grupo' e preencha um nome para o grupo (por exemplo, 'Controles'). Observe que, neste momento, os nomes dos projetos e grupos não são realmente usados, mas os nomes devem ser preenchidos. As pastas criadas podem ser usadas para armazenar os arquivos de saída (consulte a etapa 4.10).
  6. Selecione um grupo (por exemplo, 'Controles') na janela direita (consulte a Figura 19). A barra de ferramentas mudará. Selecione 'Editar grupo', depois 'Adicionar ao grupo' no menu suspenso e, em seguida, 'Novas medidas'. Isso abrirá um navegador. Abra a pasta feita durante a gravação (passo 2.7), selecione a subpasta 'trajetórias' e depois o point.smoothed-file. No exemplo apresentado na Figura 19, para o Grupo A, seis arquivos foram carregados, para o Grupo B, quatro arquivos. (Observe que no exemplo ilustrado os arquivos suavizados têm as extensões 0 e 1, porque nesse experimento dois peixinhos dourados foram testados simultaneamente).
  7. Para análise, selecione o arquivo suavizado na janela direita, selecione 'Processamento de dados', selecione 'Endpoints únicos' no menu suspenso e, a título de exemplo, selecione 'Congelamento de duração' (Figura 20). Uma janela é aberta para especificar o congelamento em termos de limite de velocidade e limite de duração. No exemplo, o peixe gasta 25,86% do tempo de observação no congelamento.
  8. Para se familiarizar com o programa, tente outros exemplos, como Distância de viagem, Distribuição de profundidade (que permite determinar o número de níveis de profundidade) e Frequência de intermitência.
  9. Existem cálculos mais avançados, como a análise espectral de, por exemplo, o componente z da aceleração. Nesse caso, selecione 'Recursos de séries temporais', depois 'Análise de domínio de frequência TD', 'Análise espectral' e 'Espectro de aceleração Z'. A análise de Fourier será realizada no parâmetro indicado (para explicação7). Nem todas as opções exibidas no menu ainda estão totalmente implementadas. Por exemplo, 'Tortuosidade de caminho' foi adicionado apenas experimentalmente.
  10. Ao selecionar a opção 'Processamento em lote usando limite padrão', cerca de 200 endpoints serão calculados. Neste contexto, «predefinição» significa que foram definidos delimitadores. Por exemplo, atualmente a distribuição de profundidade é calculada para três níveis de profundidade, a distribuição angular é calculada para quatro seções (ou seja, quadrantes) etc. Após gerar os parâmetros, uma nova janela é aberta solicitando a localização e o nome do arquivo a ser criado. Eles serão salvos no formato CSV e podem ser importados para outro software, como o Excel, para processamento posterior.
  11. Em contraste com o Módulo de Gravação e o Módulo de Trajetória, o Módulo de Processamento de Dados é um módulo em evolução que será adaptado às necessidades dos pesquisadores.

Resultados

Peixes-zebra fêmeas (Danio rerio) de seis meses de idade, de uma linhagem selvagem não especificada ("nadadeira curta"), foram adquiridas da Aquatica Tropicals, Inc. No total, foram utilizados 120 peixes-zebra. Eles foram aclimatados às condições de laboratório por aproximadamente 8 semanas em aquários de 38 L antes do início dos experimentos. A temperatura da água foi mantida igual à temperatura ambiente (~23° C). Regime de luz: 14 horas com luz acesa (6:00-20:00), 10 horas com luz apagada. Os peixes-zebra foram alimentados três vezes ao dia: às 8:00, flocos Tetra tropical; ao meio-dia, larvas vivas de artêmia; às 15:00, flocos Tetra tropical. Nos dias dos experimentos, os peixes-zebra foram alimentados com flocos apenas às 8:00. Imediatamente após a segunda gravação, os peixes-zebra foram eutanasiados com 300 mg/L de tricaina metanosulfonato (MS-222).

Para o grupo controle, foram utilizados 14 quadruplicados (ou seja, grupos de quatro peixes-zebra) (n = 14); para o grupo MK-801, foram utilizados 16 quadruplicados (n = 16). Após 1 hora de exposição a 10 µM de MK-801 (iniciada às 9:30) em recipientes de 1 L, os quadruplicados foram transferidos para os recipientes de observação. A gravação foi iniciada imediatamente (às 10:30) e durou 20 minutos. Posteriormente, os peixes-zebra permaneceram nos recipientes por 3,5 horas. Durante esse período, foi fornecida aeração por meio de um tubo conectado a uma bomba de ar. Às 14:00, uma segunda gravação de 20 minutos foi realizada. O objetivo das duas gravações foi estudar os efeitos da habituação e/ou da diminuição dos efeitos das drogas (a meia-vida do MK-801 em ratos é de aproximadamente 2 horas28). Analisamos (1) as distâncias sociais médias (também chamadas de distâncias interindividuais11,29) como medida de coesão social, (2) a distribuição vertical em dez níveis de profundidade, (3) a distribuição horizontal em quatro zonas radiais (ver Figura 24A, inseto para as localizações das zonas) e em quadrantes (ver Figura 24B, inseto para as localizações dos quadrantes) e (4) os três componentes (x,y,z) da distância percorrida. Os dados foram médias por cardume. Após os testes de Shapiro-Wilkins indicarem que nem todas as variáveis apresentavam distribuição normal, testes U de Mann-Whitney foram aplicados para todas as variáveis, a fim de comparar as médias dos grupos controle e MK-801. Essas comparações foram realizadas separadamente para as sessões da manhã e da tarde. Adotamos α = 0,05/4 = 0,0125, pois foram utilizadas quatro (grupos de) variáveis (ver acima).

Figura 2A mostra um quadro típico de exemplo para peixes-zebra controle e Figura 2B mostra um quadro típico de exemplo para peixes-zebra tratados com MK-801, ambos registrados durante a sessão matinal. Observe que os peixes-zebra controle estavam próximos ao fundo, próximos à parede frontal (ou seja, o lado mais próximo à câmera) e permaneceram agrupados (ou seja, a coesão social era alta). Em contraste, os peixes-zebra tratados com MK-801 estavam próximos ao topo, não mostraram preferência no plano horizontal e nadaram a distâncias consideráveis uns dos outros (ou seja, a coesão social era baixa). Figura 21 mostra trajetórias representativas. Os peixes-zebra controle tinham uma clara tendência a permanecer no lado frontal do recipiente de observação. Além disso, permaneceram próximos ao fundo na maior parte do tempo. Os peixes-zebra tratados com MK801, por outro lado, nadaram em qualquer lugar do plano horizontal. No entanto, tinham uma preferência clara pelos níveis superiores de profundidade às 10:30. Às 14:00, suas distribuições verticais tornaram-se mais homogêneas.

A análise quantitativa dos dados confirmou nossa descrição. Figura 22A mostra que a distância social média (ou seja., as distâncias médias entre indivíduos dos grupos de quatro peixes-zebra) foi para os peixes-zebra tratados com MK-801 mais de três vezes maior do que para os peixes-zebra controle durante a manhã (às 10:30), com U = 0 e p<0,00001. Após 3,5 horas de habituação (às 14:00), a distância social nos peixes-zebra controle aumentou, enquanto permaneceu mais ou menos inalterada nos peixes-zebra tratados com MK-801. No entanto, continuou significativamente diferente entre os dois grupos (U = 19, p<0,0005). Figura 22B mostra as linhas do tempo da distância social para os dois grupos experimentais, tanto às 10:30 quanto às 14:00.

A distribuição vertical também foi muito diferente para ambos os grupos. Figura 23 mostra que, tanto pela manhã (10:30) quanto à tarde (14:00), os peixes-zebra controle passaram a maior parte do tempo nos dois ou três níveis de profundidade mais baixos (ou seja, os níveis mais próximos ao fundo do recipiente de observação). Os peixes-zebra tratados com MK-801, por outro lado, nadaram a maior parte do tempo próximos à superfície da água às 10:30 (Figura 23A). Após 3,5 hr de habituação, às 14:00, eles estavam mais ou menos igualmente distribuídos em todos os níveis de profundidade.

A distribuição horizontal também foi muito diferente para ambos os grupos experimentais. Na Figura 24A observa-se que os peixes-zebra tratados com MK-801 passaram menos tempo na zona externa e mais tempo nas zonas média e central do que os peixes-zebra controle. As diferenças entre os grupos em relação aos quadrantes foram ainda mais evidentes (Figura 24B). Os peixes-zebra controle apresentaram uma forte preferência pelos dois quadrantes frontais (1 e 4), ou seja, o lado do recipiente mais próximo à câmera. Os peixes-zebra tratados com MK-801, por outro lado, distribuíram-se mais ou menos igualmente pelos quatro quadrantes.

No que diz respeito aos parâmetros cinemáticos, limitamos aqui a discussão à distância percorrida (Figura 25). Os peixes-zebra tratados com MK-801 percorreram uma distância maior do que os peixes-zebra controle. Curiosamente, essa diferença foi especialmente significativa para a componente y da distância percorrida. Essa é a direção da câmera (veja Figura 1). De fato, os peixes-zebra controle permaneceram a maior parte do tempo próximos à parede frontal, nos quadrantes 1 e 4 (como pode ser observado nas Figuras 24A e 24B). Os peixes-zebra tratados com MK-801, por outro lado, moveram-se para frente e para trás entre as metades frontal e traseira do recipiente.

Aqui, apresentamos apenas uma amostra das possíveis maneiras de analisar os dados fornecidos pelo experimento. Neste momento, abstemo-nos de atribuir qualquer interpretação biológica específica aos resultados. No entanto, vale mencionar que a MK-801 já foi associada à indução de isolamento social30 e à redução de comportamentos investigativos sociais em ratos31 e tem sido estudada como modelo para os sintomas negativos da esquizofrenia30. Também provocou hiperatividade31, comportamento de rotação32, comprometimento sensorial33 e redução da inibição do prepulso34 em mamíferos. Embora não tenhamos testado especificamente esses comprometimentos, nossos achados parecem ser compatíveis com eles. Configurações experimentais mais específicas são necessárias para determinar se os efeitos descritos da MK-801 em peixes-zebra são comparáveis aos descritos em mamíferos. Análises e experimentos adicionais também seriam necessários para decidir se ansiedade, problemas respiratórios, desorientação espacial, déficit de atenção, estereotipia etc. tiveram papéis significativos nos comportamentos alterados induzidos pela MK-801 nos peixes-zebra.

Diagrama da configuração de medição óptica com câmera, computador, cubo e espelho; estudo em fotônica.
Figura 1. Diagrama esquemático do aparato. A câmera captura quadros (ou seja, imagens fixas) mostrando tanto a vista frontal quanto a vista superior do tanque de observação. Os quadros são armazenados no computador para processamento posterior. Observe as posições das dimensões xyz, que são importantes para descrever as características tridimensionais dos movimentos e das localizações dos peixes-zebra. As duas paredes sombreadas na figura (e o fundo do tanque) foram, em nosso experimento (veja Resultados Representativos), pintadas de branco, enquanto as outras duas paredes eram transparentes. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Experimento de comportamento em aquário, dois aquários com distribuição de peixes, configuração do estudo comportamental.
Figura 2. Quadros de exemplo. Observe que as vistas frontal ou superior isoladamente são caracterizadas pela perda de informação. Isso é especialmente evidente no painel B, onde os três peixes-zebra à esquerda parecem estar próximos uns dos outros ao observar a vista frontal, enquanto a vista superior mostra que isso não é verdade. Por outro lado, a vista superior não fornece qualquer indicação da distância em relação ao fundo. A) Peixes-zebra controle. B) Peixes-zebra tratados com 10 µM de MK-801. Observe que a cor (azul) do fundo foi gerada pelo software de gravação e foi escolhida para obter bom contraste. A cor real das paredes traseira e lateral direita, bem como do fundo, era branca. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Sistema de rastreamento do comportamento de animais aquáticos; configuração de análise de vídeo; painel de calibração; processo de monitoramento.
Figura 3. Alinhamento do espelho lateral. A seta branca à esquerda indica a parede frontal (mais próxima à câmera) no espelho lateral. Se duas linhas forem visíveis, corrija a posição do espelho lateral até que apenas uma linha seja visível (passo 1.2). Os 5 LEDs do painel de calibração são claramente visíveis nas três vistas. Observe que, como as luzes da câmara estão acesas, muitos outros reflexos são vistos no painel de LEDs (passo 1.4). Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Processo de detecção de partículas, caixas marcadas em vermelho, diagrama de análise óptica, condições de pouca luz.
Figura 4. Identificação dos LEDs. O painel esquerdo mostra que as cinco marcas (numeradas de 0 a 4) identificadas pelo procedimento de calibração não coincidem com os LEDs reais. Além dos LEDs, podem ser observados outros pontos luminosos (na verdade, reflexos). No painel direito, o ganho e o tempo de exposição foram reduzidos de modo que apenas os LEDs são visíveis. Agora, as cinco marcas são atribuídas corretamente (como descrito nas etapas 1.7–1.10). Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução.

Interface de software de rastreamento de comportamento de animais aquáticos mostrando controle da câmera e configuração de calibração.
Figura 5. Coletar informações do recipiente. A sequência dos seis pontos a serem selecionados (por meio de clique com o botão direito do mouse) é apresentada. As linhas serão desenhadas automaticamente. Observe que os números indicados aqui não aparecem na tela. Ao finalizar, pressione 'Coletar informações do recipiente' (conforme descrito na etapa 1.12). Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Diagrama do experimento de hidrodinâmica; configuração do tanque de dinâmica de fluidos e empuxo; componentes anotados.
Figura 6. Coletar volume. Clique com o botão direito do mouse nos locais indicados que marcam os cantos do corpo d'água: primeiro marque o canto na vista frontal e depois na vista superior. Em seguida, vá para o próximo canto (de 1 a 8). Observe que os oito pontos marcam o contorno do corpo d'água, e não do tanque. Também observe que, ao clicar com o botão direito do mouse, apenas 'x0' aparece, o que desaparecerá novamente ao clicar no próximo ponto (assim, os números 1-8 não aparecem realmente na tela). O procedimento é descrito na etapa 1.17. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Configuração de rastreamento de comportamento de animais aquáticos com controle de câmera, monitorando o movimento do animal no tanque de água.
Figura 7. Contraste não corrigido. A imagem está superexposta e o contraste entre o peixe e o fundo (especialmente na vista frontal) é baixo. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Configuração aquática com peixes utilizada no estudo de equilíbrio estático; experimento em dinâmica de fluidos.

Figura 8. Contraste corrigido. O contraste agora está melhorado em comparação com a Figura 7. Observe que as cores na tela são cores falsas. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Interface de configurações da câmera Bumblebee2 BB2-03S2C, mostrando ajustes de brilho, exposição e saturação.
Figura 9. Configurações Gerais. Após selecionar 'Controle da câmera' no menu principal, a janela 'Configurações Gerais' é aberta. Desmarque as caixas 'Obturador' e 'Ganho' e use as barras deslizantes para encontrar o melhor contraste entre o peixe e o fundo. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Interface gráfica de ajuste de balanço de branco da câmera; controles deslizantes vermelho/azul; otimização de processamento de imagem.
Figura 10. Configurações de cor. Na janela 'Balanço de Branco/Cor', desmarque a caixa 'Auto' e use os controles deslizantes 'Vermelho' e 'Azul' para encontrar a melhor combinação que proporcione bom contraste entre o peixe e o fundo. Parâmetros. Após abrir o Módulo de Trajetória, selecione o arquivo experimental com 'Localização dos Dados' e, em seguida, abra a janela 'Parâmetros' com 'Configuração do Sistema'. Neste momento, são atribuídos valores iniciais adequados aos parâmetros. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Interface de software de rastreamento de comportamento de animais aquáticos; parâmetros de calibração; configuração de análise de vídeo.
Figura 11. Parâmetros. Após abrir o Módulo de Trajetória, selecione o arquivo experimental com ‘Localização dos dados’ e, em seguida, abra a janela ‘Parâmetros’ com ‘Configuração do Sistema’. Aqui são atribuídos bons valores iniciais para os parâmetros. .Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Configuração de rastreamento do comportamento aquático, calibração do sistema 3D, interface do software, análise de trajetória.
Figura 12. Alinhamento da caixa. Observe como as caixas vermelhas nas vistas superior e frontal definem as áreas onde os peixes podem ser encontrados. A caixa à esquerda é reduzida a uma linha para excluir essa área da busca. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Interface de software de rastreamento de animais aquáticos, mostrando configuração de calibração e monitoramento para análise de comportamento.

Figura 13. Atribuições de marcação. Após pressionar o botão 'Iniciar geração de trajetórias' e escolher o quadro inicial (normalmente o quadro nº 0), a janela 'Atribuições de marcação' é aberta. Pressione 'Avançar' até que a marcação ('X0') apareça na tela. Se a marcação não estiver posicionada sobre a imagem do peixe, pressione 'Não' até que seja posicionada corretamente. Em seguida, pressione 'Ir'. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Diagrama de análise dinâmica com vetor de força, concentração de tensão; componentes identificados como A, B.
Figura 14. Tela de informações. O painel (A) mostra a atribuição correta da marca. A marca ('X0') é posicionada sobre a imagem do peixe em ambas as vistas. Normalmente, uma linha atravessa a marca. O painel (B) mostra ruído excessivo e ausência de atribuição da marca. Os quadros foram obtidos a partir da mesma gravação, alterando os limites de cor e tamanho (na etapa 2.2) de 1.000-50 e 10-5, respectivamente. Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução.

Análise tridimensional da trajetória, diagrama vetorial ilustrando o movimento da partícula em coordenadas cartesianas.
Figura 15. Representação tridimensional do trajeto reconstruído. A origem das setas está localizada no canto frontal esquerdo do tanque, para fins de orientação (ver também a Figura 1). Assim, neste exemplo, o peixe permanece próximo à parede esquerda (em relação à câmera). Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Janela de configuração de parâmetros para suavização de trajetória; configurações do filtro: limiares de ruído, tamanho da janela.
Figura 16. Suavização de trajetória. Esta janela é aberta após pressionar o botão 'Suavização de trajetória'. Por enquanto, aceite o valor padrão pressionando 'OK'. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Diagrama de organização de arquivos mostrando a transferência de dados da pasta "fish1" para a subpasta "Trajectories".
Figura 17. Subpastas. A pasta gerada durante a gravação é mostrada acima. Após a reconstrução do trajeto, ela contém as seis subpastas indicadas. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Dados numéricos em formato de texto para análise estatística.
Figura 18. Arquivo suavizado. A parte superior de um exemplo de arquivo point.smoothed é mostrada, indicando o número de quadros, a duração da gravação (em min), as coordenadas do centro do corpo d'água em relação à câmera e, para cada quadro, as coordenadas e a duração. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Interface do software de processamento de dados para análise de dados de trajetória; configuração do projeto e atribuições de grupos.
Figura 19. Processamento de dados. Seleção dos arquivos a serem analisados (janela à direita). Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Interface de processamento de dados 3D do ABMT exibindo configuração de análise de imobilidade para avaliação de trajetória.
Figura 20. Exemplo de análise. Os pontos finais de interesse podem ser calculados mediante seleção no menu. Neste exemplo, foi selecionado 'Duração da imobilidade'. O programa solicita que sejam fornecidos os limiares de velocidade e duração que definem a imobilidade. O resultado é expresso em porcentagem da duração total da gravação. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Diagrama de análise de locomoção, trajetórias de rastreamento em camundongos controle e com MK-801 ao longo de intervalos de tempo.
Figura 21. Trajetórias representativas. São apresentadas duas trajetórias representativas para peixes-zebra controle e duas trajetórias representativas para peixes-zebra tratados com 10 µM de MK-801, referentes à sessão matutina iniciada às 10:30 (linha superior) e à sessão vespertina iniciada às 14:00 (linha inferior). As trajetórias de cada peixe-zebra dentro de cada quadruplicata são apresentadas em cores diferentes. No entanto, observe que pode ter ocorrido troca de identificação. É necessária correção manual se for essencial acompanhar as linhas individuais. O lado frontal esquerdo (origem das setas inseridas) do recipiente representado é o lado mais próximo à câmera (ver Figura 1 para a posição do tanque). Clique aqui para visualizar a imagem em maior resolução.

Análise de distância social; gráfico; efeito controle versus MK-801; resultados comparativos das sessões; série temporal.
Figura 22. Distância social média entre os peixes. A) As distâncias sociais médias para peixes-zebra controle e peixes-zebra tratados com 10 µM de MK-801 são apresentadas para as sessões da manhã e da tarde. São mostradas a média e o erro padrão da média (S.E.M.). ***, p<0,001. B) As linhas do tempo da distância média entre indivíduos são apresentadas para ambos os grupos. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Análise de profundidade; gráfico multivariado; comparando controle vs MK-801; porcentagem de tempo vs níveis de profundidade.
Figura 23. Distribuição por profundidade. A) Distribuição dos peixes-zebra em dez níveis de profundidade iguais (sendo o nível 1 o mais próximo do fundo) durante a sessão matinal. B) Distribuição dos peixes-zebra durante a sessão vespertina. São apresentadas a média e o erro padrão da média (E.P.M.). *, p<0,0125; **, p<0,005; ***, p<0,001. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Gráfico da proporção temporal nas zonas radiais e nos quadrantes; análise de dados; resultados do experimento psicológico.
Figura 24. Distribuições horizontais. (A) Apresenta-se a distribuição temporal nas quatro zonas radiais dos grupos experimentais. O inseto mostra as localizações das zonas do centro à periferia: zonas central, média, externa e zonas dos cantos combinadas. (B) Apresenta-se a distribuição temporal nos quatro quadrantes dos grupos experimentais. O inseto mostra a localização dos quadrantes. As paredes indicadas por linhas duplas representam paredes brancas, aquelas representadas por linhas simples indicam paredes transparentes. A câmera está localizada à esquerda do inseto, ou seja., mais próxima dos quadrantes 1 e 4 (ver também a Figura 1). São apresentadas a média e o erro padrão da média (S.E.M.). Asteriscos pretos indicam comparações entre os grupos para a sessão da manhã e asteriscos cinzas para as sessões da tarde: *, p<0,0125; **, p<0,005; ***, p<0,001. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Gráfico de equilíbrio estático; distância percorrida versus coordenadas; controle versus MK-801; análise de dados.
Figura 25. Distância percorrida. São apresentados os componentes xyz da distância percorrida pelos peixes-zebra durante as sessões matutina e vespertina. São mostradas a média e o erro padrão da média (S.E.M.). Asteriscos pretos indicam comparações entre os grupos para a sessão matutina e asteriscos cinzas para as sessões vespertinas: *, p<0,0125; ***, p<0,001. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Discussão

O procedimento experimental aqui apresentado permite registar peixes-zebra individuais, pares de peixes-zebra (por exemplo, para estudar o acasalamento ou a agressão) e cardumes de peixe-zebra (como mostrado no exemplo representativo). O sistema é especialmente adequado para obter simultaneamente informações sobre distribuição 3D (vertical e horizontal), características cinemáticas (por exemplo, velocidade, aceleração, ângulo de giro) e parâmetros sociais (por exemplo , coesão social). A seguir, listamos algumas questões importantes a serem consideradas ao planejar experimentos.

Dependendo do procedimento experimental, diferentes sistemas comportamentais podem ser estudados. Por exemplo, para explorar a neofobia (ou seja, medo de novos ambientes), a gravação deve ser iniciada imediatamente após a introdução do peixe-zebra no tanque de observação (depois de esperar apenas alguns segundos para que a água se acalme para diminuir o ruído), sem habituação prévia11,17,37. Por outro lado, alguns tópicos de pesquisa podem exigir que o peixe-zebra esteja bem habituado, por exemplo, ao estudar os efeitos dos feromônios de alarme16. Ao estudar grupos de peixes-zebra, o experimentador deve estar ciente de que, embora o software minimize a troca de tags, neste momento não é possível acompanhar o peixe-zebra individual por toda parte. Isso também não é importante para estudos de cardume onde a ênfase está na coesão social, mas seria crucial ao explorar a agressão ou o acasalamento. A reatribuição manual de tags é uma opção, mas pode ser muito demorada.

A cor das paredes do contêiner de observação e da câmara de observação pode ter grande influência no comportamento do peixe-zebra. Por exemplo, paredes brancas foram descritas para induzir respostas de aversão36, 37. Ao experimentar cores diferentes, lembre-se de duas coisas: 1) é importante que a parede frontal (ou seja, a parede mais próxima da câmera) permaneça transparente e que uma tampa (se for usada) também seja transparente; 2) Ao selecionar uma cor nunca usada antes, primeiro determine se o contraste entre o peixe-zebra e o fundo é apropriado para gravação. Faça um teste. Alterar as configurações da câmera para gravação (Ganho, Obturador, Vermelho e Azul, conforme explicado nas etapas 2.5 e 2.6) e as configurações para reconstrução de trajetória (por exemplo, limites de cor e tamanho, conforme explicado nas etapas 3.3, 3.5, 3.11 e 3.12) pode fazer uma grande diferença. Novamente, a experiência com o sistema ajudará muito a decidir o que é possível.

Dependendo do objetivo do experimento, uma fonte de luz com características diferentes (por exemplo, espectro, intensidade) pode ser desejável. As barras de LED podem ser facilmente substituídas. Certifique-se de que a luz atinge todas as partes do recipiente.

Se o experimento exigir que o peixe-zebra permaneça no recipiente de observação por várias horas, certifique-se de fornecer aeração. Um tubo de ar pode ser conectado ao canto direito traseiro usando um clipe. Verifique na tela do computador se o clipe não interfere na gravação, ou seja, que o peixe-zebra nunca está escondido da vista. Nas Figuras 2A e 2B , o clipe preto pode ser visto na vista superior. Idealmente, a aeração deve ser fornecida antes ou entre as gravações, mas não durante a gravação para evitar ruídos. Observe também que ligar ou desligar a aeração forte pode assustar o peixe-zebra.

Se o experimento exigir manter o peixe-zebra no recipiente durante a noite, é útil cobrir a câmara de observação com uma tampa transparente para evitar que o peixe-zebra salte (o que é uma ocorrência muito comum). Se a tampa não for removida antes da gravação (para não perturbar o peixe-zebra), considere os dois pontos a seguir: 1) certifique-se de que as imagens espelhadas das fontes de luz não obstruam a gravação (por exemplo, deslocando as fontes de luz ou escolhendo uma tampa que reflita a luz apenas minimamente); 2) considerar que a tampa pode ficar embaçada quando usada durante a noite, especialmente porque, neste caso, a aeração também deve ser fornecida; Uma maneira de reduzir isso é escolher uma tampa com pequenos orifícios.

Para alguns experimentos, pode ser essencial determinar o comportamento básico do peixe-zebra antes de administrar um medicamento. Nesse caso, o medicamento pode ser adicionado entre as sessões por meio de um tubo (semelhante ao tubo de aeração discutido acima).

Embora o foco aqui tenha sido o registro do peixe-zebra (Danio rerio), outras espécies de peixes também podem, é claro, ser registradas com o sistema. Tem sido usado para estudar comportamentos em peixes dourados (juvenis) (Carassius auratus), farpa de tigre (Barbus tetrazona) e espada verde (Xiphophorus helleri).

Finalmente, deve-se notar que outras dimensões dos tanques de observação são principalmente possíveis. No entanto, seria necessário reconfigurar o sistema e encontrar um bom equilíbrio entre resolução espacial e temporal ao usar contêineres de observação muito maiores. Além disso, a forma do recipiente deve ser cubóide. O número de peixes-zebra ou outros sujeitos experimentais é teoricamente ilimitado; no entanto, a troca de tags aumenta com o número de assuntos.

Divulgações

Hans Maaswinkel, Liqun Zhu e Wei Weng são funcionários da xyZfish, Ronkonkoma NY, que produz o sistema de rastreamento usado neste artigo.

Agradecimentos

Os autores não têm agradecimentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AABT-3D Tracking HardwarexyZfishAABT IIInclui câmera, placa de vídeo, compartimento de observação com espelho e iluminação
Equipamento de calibração AABT-3DxyZfishcalib Contém painel de calibração e espelho lateral
AABT-3D Recipientesde observação xyZfishcubos 
AABT-3D software de rastreamentoxyZfishv.1.0 
Computador opcionalN/AWindows XP ou superior
(+) -MK-801 maleato de hidrogênioSigmaM107 
Bomba de arFusion500 
Tubulação de linha de ar 3/16"Lee' s Produtos para Aquários e Animais de Estimação14508 
Grampos de fichário médiosOfficeDepot561339Para anexar a linha aérea ao contêiner de observação

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