Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Summary

A exibição em fagos é uma técnica poderosa para captura de proteínas ou fracções de proteínas que interagem com uma molécula de interesse imobilizada. Uma vez tomada uma decisão sobre o tipo de biblioteca de cDNA de fagos para criar e tela, o protocolo descrito aqui permite a seleção de afinidade eficiente levando à identificação de interagentes.

Abstract

Usando fago recombinante como um andaime para apresentar várias porções de proteínas codificadas por uma biblioteca de cDNA direcionalmente clonado para moléculas imobilizadas isca é um meio eficiente para descobrir interações. A técnica tem sido largamente usado para detectar interacções proteína-proteína, mas a molécula do isco a ser desafiados não precisa ser restrito a proteínas. O protocolo aqui apresentado foi optimizada para permitir que um pequeno número de iscos para ser exibido em repetições para maximizar a identificação de clones independentes que apresentam a mesma proteína. Isto permite uma maior confiança de que as proteínas que interagem identificados são interagentes legítimos da molécula isca. Monitorando a título de fagos depois de cada selecção de afinidade rodada fornece informações sobre a forma como a selecção por afinidade está progredindo, bem como sobre a eficácia dos controlos negativos. Um meio de titulação do fago, e como eo que se preparar com antecedência para permitir que este processo avance de forma tão eficiente comopossível, é apresentada. Atributos de amplicões obtidos após isolamento de placas independentes são destacadas que pode ser utilizado para determinar quão bem a selecção de afinidade progrediu. Problemas técnicas para minimizar falsos positivos ou de contornar persistentemente recuperado fago tiro são explicados. Meios de reduzir a contaminação viral surto são discutidos.

Introduction

Por que usar de apresentação de fagos e seleção de afinidade em vez de uma miríade de outras técnicas disponíveis para descobrir e investigar as interações de proteínas com outras moléculas? Phage display pode reivindicar algumas vantagens únicas em relação a outros métodos de detecção de interações proteína-ligante ^1-3 incluindo o seguinte:

Muito amplo repertório de moléculas de isca

A principal razão é na diversidade de moléculas capazes de actuar como isco na selecção por afinidade ^4. A exibição em fagos é um meio muito poderoso para isolar fragmentos de proteínas que interagem com outras proteínas, hidratos de carbono, nucleótidos, etc ⁵ Essencialmente, se um polímero / molécula pode ser ligada a um suporte recuperável, que podem ser rastreados para afinidade com as proteínas apresentadas em fagos. Além disso, a molécula de isca pode ser acedido para determinar se ele retém a actividade biológica quando imobilizada ^6, se as condições usadas para reduce / eliminar a sua actividade são eficazes ou ^6, para introduzir as modificações pós-tradução para o isco antes da selecção de afinidade.

Resistência aos fagos a fatores externos

Uma segunda razão para a utilização de apresentação de fagos, é que é possível que alguns iscos pode exigir esforço ambiental (calor, altas concentrações de agente osmótico, co-factores específicos, etc.) Para capturar as proteínas que interagem com, ou as proteínas apresentadas em fagos pode necessitar ser de alguma forma alterados antes da selecção de afinidade. O factor principal a ser estudado é a interacção entre o isco e proteína, não a condição que permite a interacção ocorrer, ou se é letal para o organismo de teste. O fago T7 é particularmente bem adequada para estes estudos porque pode suportar condições experimentais agressivos tanto intacta e viável (por exemplo, o máximo térmico publicado para a viabilidade de T7 é ~ 60 ° C ^7). Como um exemplo de alteração fago exibido próproteínas, ao analisar o proteoma semente Arabidopsis thaliana para substratos de proteínas da enzima de reparação, Proteína Isoaspartyl Metil Transferease (PIMT), o vírus utilizado nestes estudos foi "idade", durante uma semana, antes de cada seleção afinidade rodada, para incentivar a introdução de isoaspartate (isoAsp) resíduos de proteínas suscetíveis ⁶ que não é possível em organismos que podem reconhecer e reparar / metabolizam essas anormalidades.

Metabolicamente inerte

Além disso, os fagos são geralmente resistentes aos venenos metabólicos e interferindo pequenas moléculas que, no mínimo, resultar em efeitos pleiotrópicos sobre organismos de teste metabolicamente activas. Após as lavagens de rigor, o veneno é removido antes de uma grande quantidade de bactérias são introduzidos por infecção de modo que o veneno é diluída a uma gama inócuo para a bactéria ou a replicação do fago subsequente. Ao investigar alvos da proteína do reparo PIMTenzima, de S-adenosil-metionina (AdoMet) foi usado para activar a enzima de micro-titulação de placa-bem imobilizada para permitir a captura de proteína alvo, baseando-se S-adenosil-homocisteína (AdoHcy) para inactivar a enzima e proporcionar um controlo negativo útil fixar em do conhecimento que o vírus não seria influenciada negativamente por qualquer AdoMet ou AdoHcy ^6. Além disso, os membros de certas famílias Abundante embriogénese tardia (LEA), proteína investigados neste laboratório, são conhecidos para alterar a sua forma, na presença de aditivos tais como sacarose, ^8, que podem atingir concentrações tão elevadas como 200 mM em sementes de soja, no ponto de maturidade fisiológica ^9. O vírus não está prevista para ser influenciado pela adição de 200 mM de sacarose em cada fase de selecção de afinidade, possivelmente necessário para certas interações proteína LEA-cliente, o que não é o caso de organismos de teste de forma autônoma viáveis ^​​10.

Este laboratório tem se concentrado em DESCOBERTAg interações proteína-proteína em, sementes desidratadas ou germinando maduros que fundamentam o mecanismo de proteção proteoma armazenadas durante ¹¹ desidratação ou reparação de componentes do proteoma armazenado que são suscetíveis à formação isoAsp uma vez que a semente tem absorvido ^6. Assim, a produção e purificação de proteínas recombinantes exigidos como isca em um estado ativo, e garantir que eles permaneçam assim, antes e depois de serem imobilizados, embora freqüentemente difícil, é um dos pilares para o nosso trabalho. No entanto, como cada um dos cenários de produção de proteína recombinante é diferente, as condições para a optimização da produção de proteína recombinante não será abordada aqui. Os utilizadores são convidados a tentar, sempre que possível, para determinar se a proteína imobilizada é funcional (por exemplo, se se trata de uma enzima, fazer um ensaio de enzima nos poços da placa de microtitulação). Isto irá fornecer alguma confiança de que a isca é biologicamente ativo e, portanto, que todas as interações são descobertosum pouco mais propensos a ter relevância biológica.

Protocol

Uma representação gráfica do processo descrito abaixo (Figura 1) destaca os dois componentes principais para a selecção de afinidade utilizando uma biblioteca de exibição em fagos: A) uma biblioteca de cDNA de apresentação de fagos provável que codificam proteínas com afinidade para o isco e, B) um isco recombinante purificada proteína. Produção de isca (proteína recombinante) tem sido extensivamente examinada e literatura descrevendo as melhores práticas para garantir, a proteína recombinante ativo solúvel de E. coli ^12-13, levedura eucariótica ^{14, 15-16} inseto, planta ^{17-18, 19-20} ou células de mamíferos não faltam.

Na sequência do protocolo, um hexahistidyl marcado proteína recombinante foi utilizado como isco. Isto permite a verificação de que as proteínas de isco permanecer nos poços após incubação e de lavagem durante a noite.

1. ELISA para a retenção de proteína recombinante nas Wells Microplaca

1. Marcar umaplaca de microtitulação com tinta permanente e designar quais poços conterá que as concentrações de proteína. Realize esta em 3 repetições de poços. Incluir três repetições de uma série de concentração controle negativo (proteína não-marcado-hexahistidyl; BSA funciona bem como esta verificação de antecedentes).
2. Lave a placa extensivamente com água e remover a água por bater a placa de cabeça para baixo em 4 camadas de papel toalha entre lavagens.
3. Imobilizar, nos primeiros três poços, em 100 ul de Tris, pH 7,5, (ou de tampão de escolha) a concentração mais elevada da proteína recombinante (10 ug / ml). Adicionar para os próximos três poços da proteína recombinante a (1,0 ug / ml), etc, para 1,0 ng / ml. Faça o mesmo com a série de concentração BSA.
4. Cubra pratos com filme plástico e deixe durante a noite a 4 ° C.
5. Na manhã seguinte, retire a proteína por bater placa de cabeça para baixo em 4-5 camadas de papel toalha.
6. Lavar os poços 5 vezes com 200 ul de 1x TBS de cada vez, deixando o tampãonos poços de ~ 1 min de cada vez e remover o tampão de lavagem por bater a placa de cabeça para baixo sobre as toalhas de papel após cada lavagem.
7. Bloquear a placa para ELISA num agitador rotativo usando-se 200 ul de 5% (w / v) de BSA e 200 ul de 5% (w / v) de reagente de bloqueio em TBS à temperatura ambiente durante 2 horas (ou durante a noite sentado estacionário a 4 ° C, se conveniente ) embrulhado em filme plástico.
8. Retire o excesso de solução de bloqueio por bater a placa de cabeça para baixo sobre as toalhas de papel. Lavar 4x 1 min de cada vez com 200 ul de 1x TBS, a remoção da solução de lavagem por bater a placa de cabeça para baixo.
9. Dilui-se penta-HIS anticorpo primário 1/2, 000 em tampão de bloqueio e entregar 100 ul a cada poço. Incubar 1-2 horas à temperatura ambiente, com a placa estacionária.
10. Remover o anticorpo primário por bater a placa de cabeça para baixo sobre as toalhas de papel. Lavar 4x 1 min de cada vez com 200 ul de 1x TBST. Retire cada lavagem por bater a placa de cabeça para baixo.
11. Dilui-se o anticorpo secundário(Anticorpo de cabra anti-rato conjugado a fosfatase alcalina), em tampão de bloqueio e incubar 100 ul em cada poço durante 1 hora à temperatura ambiente com a placa estacionária.
12. Remover o anticorpo secundário por bater a placa de cabeça para baixo sobre as toalhas de papel. Lavar 4x 1 min de cada vez com 200 ul de 1x TBST. Retire cada lavagem por bater a placa de cabeça para baixo.
13. Coloque 200 mL de para-nitrofenilfosfato (pNPP) solução de substrato em cada poço. O substrato é um sólido à temperatura de -20 ° C para ter alíquotas e recuperar o número necessário de alíquotas necessárias para a detecção do congelador bem antes do tempo para que ele esteja completamente descongelado por esta fase.
14. Aos 30 min parar a reacção por adição de 50 mL de NaOH 3 M para cada poço.
15. Ler a absorvância a 405 nm imediatamente no leitor de placas de ELISA.

Nota: Se a proteína recombinante de interesse não ligar-se aos poços, é possível alterar the composto / pH do tampão consideravelmente (carbonato pH 10,0) ou adicionar agentes caotrópicos (ureia) para tentar ajudar fixação de proteínas para os poços da placa de microtitulação. No entanto, re-estabelecimento de que a proteína recombinante: 1) permanece ligado aos poços de uma placa de microtitulação sob as condições de selecção de afinidade e, 2) retém a sua actividade biológica após a remoção do pH elevado / agente caotrópico é recomendada.

2. Crescer Anfitrião bacteriana (BLT5403) para Titulação

1. Autoclave (Figura 2A) dez frascos de 250 ml de Erlenmeyer e três tubos de cultura. Faça LB líquido e LB agar para verter placas de mídia sólidos. Arrefecer agar LB a 50 ° C e adicionar ampicilina a 100 ug / ml antes despejando assepticamente em placas de Petri numa câmara de fluxo (Figura 2B).
2. Também numa câmara de fluxo (Figura 2B), uma sequência de LB, 100 ug / ml de ampicilina (LB ^AMP100) por placa de ágar de colónias individuais de BLT5403 de estoque mantidas em 15% (v / v)glicerol a -80 ° C (Figura 2C). Coloque a placa de cabeça para baixo, a 37 ° C durante a noite numa incubadora de crescimento (Figura 2D).
3. De manhã, inocular 50 ml de LB ^AMP100 num Erlenmeyer de 250 ml com uma única colónia colhidos a partir do prato. Incubar a 37 ° C, 200 rpm num agitador horizontal (figuras 2E e 2F), e utilizar um espectrofotómetro para monitorar a densidade celular em OD ₆₀₀ = 0,5-0,6 (Figura 2H).
4. Despeje as células para um tubo Falcon de 50 ml, ou semelhante, e manter a 4 ° C até à sua utilização (Figura 2G). As células normalmente irá permanecer viáveis ​​por ~ 1 semana.
5. Fazer 500 ml LB, coloque-o num frasco de Fernbach perplexo e autoclave ele. Uma vez que ele é estéril, colocar o balão a 4 ° C (Figura 2G) ou à temperatura ambiente até a noite de "Day One" abaixo.

Nota: As células hospedeiras bacterianasBLT5403, expressando uma fonte suportadas pelos plasmídeos da proteína da cápside nativa T7, sem que a vectores de baixo número de cópias de T7 médio, e não pode duplicar com êxito, são extremamente sensíveis ao vírus. É imperativo para evitar a contaminação. Contaminação acabará por ocorrer no ponto em que todas as superfícies em contacto com os / as bactérias infectadas por vírus deve ser limpo com 70% (v / v) de etanol ou limpo com detergente (Figura 2I). Se esta é ineficaz, é necessária uma descontaminação completa de todas as superfícies que podem suportar Envirocide (Figura 2J). Comece BLT5403 células de estoque congelador cada nova rodada de seleção afinidade para ajudar a mitigar a contaminação do estoque de 4 ° C, e garantir células vigorosas estão sendo usados ​​no protocolo de. Pontas de pipeta de barreira Filtro são essenciais.

3. Selecção por afinidade

PRIMEIRO DIA

1. Mark uma microplaca com tinta permanente e designar quais poços conterá que protEins / alterações. (Devido a problemas de contaminação, as placas são nunca reutilizada). Realize esta em 3 repetições de poços para cada proteína e tratamento.
2. Lave a placa extensivamente com água e remover a água por bater a placa de cabeça para baixo em 4 camadas de papel toalha entre lavagens. Imobilizar, em 100 ul de Tris, pH 7,5, (ou de tampão de escolha) da proteína recombinante (10 ug / ml) em seis poços, ou BSA (10 ug / ml) em três poços, para um total de 9 poços para primeiro rodada de seleção de afinidade. Cubra a assadeira com filme plástico e deixe durante a noite a 4 ° C (Figura 2G).
3. Certifique-se de que existem 9 x 250 ml frascos de Erlenmeyer (ver 2.1 acima) limpos, autoclavados, e rotulados de forma adequada (codificação com fita colorida funciona bem, a Figura 2F).
4. Calcular o volume de fago ligado a utilizar para cada poço com base na titulação da biblioteca a ser utilizado e do número de fagos que ser blindado.
5. Certifique-se de que as células BLT5403 frescas está pronto para usarpara titulação esta seleção afinidade rodada amanhã (Figura 3A).
6. Assegurar suficiente 1x TBS (NaCl 150 mM, 50 mM Tris base, pH 7,6) e 1x TTBS (1x TBS + 0,05% (v / v) de Tween 20) estão disponíveis para efectuar 10 x 200 lavagens ul para o número de poços que estão sendo utilizados . Além disso, a pré-incubar o TTBS à temperatura de selecção de afinidade. Certifique-se de que um backup, selado, 50 ml tubo Falcon de 1x TTBS existe na temperatura seleção afinidade com suficiente 1x TTBS.
7. Prepare 3 tratamentos x 3 repetições x 3 triplicatas de 1,5 ml tubos Eppendorf (27 no total) com 990 mL de LB ^{100 AMP} cada e rotular de forma adequada (por exemplo, 10 ^-2). Estes são para as bactérias infectadas recuperados a partir dos poços de placas de microtitulação de hoje. Marque a diluição de um lado do tubo (10 ^-2) e um número crescente no outro lado ("1"). Para cada tubo Eppendorf, também rotular um tubo de borosilicato e um LB ¹⁰⁰ placa ^AMP. Neste way, as placas e os tubos de ensaio de borosilicato estão numerados 1, 2, 3, 4, 5, etc. fazer titulação ir mais rápido. Depois o simples número pode ser comparada à diluição e do tratamento sobre o tubo de Eppendorf (por exemplo, o tubo de n º 12 foi o terceiro triplicado da primeira replicação do controle BSA para a diluição 10 ^-5). Armazenar Eppendorf tubos e placas ^AMP LB ¹⁰⁰ durante a noite a 4 ° C (figuras 2G e 3B).

Por exemplo: Iniciar rotulagem tubos de 1,5 ml de Eppendorf de 10 ^-2 três diluições de fago a partir da replicação de BSA uma bem como 1, 2, e 3 (três leituras em triplicado de titulação de fagos para a replicação de um), e, em seguida, marcar tubos de ensaio de borosilicato 1, 2 e 3, na qual as bactérias infectadas será misturado com bactérias não infectadas e de topo de agarose antes de se verter em ¹⁰⁰ placas de agar LB ^AMP (Figura 3C).

8. Para a série dilutions, etiqueta tubos Eppendorf e, a cada um, adicionar 900 mL de LB ^{100 AMP.} Uma vez que as diluições iniciais (10 ^-2) de bactérias infectadas são feitas para cada uma das proteínas / tratamento, a replicação, e triplicado, hoje, que vai ser bem misturada e 100 uL feita a partir deles e adicionada ao tubo Eppendorf apropriado contendo 900 mL LB ^{100 AMP} para a diluição (10 ^-3 tubos 4, 5 e 6, para a replicação de um controlo de BSA). Estes serão bem misturada, por sua vez, e as 10 ^-3 diluições será usado para fazer as diluições 10 ^-4 (7, 8, 9). Use as 10 ^-4 diluições para os 10 ^-5 diluições (10, 11, 12), etc. para obter o título para a primeira das três repetições de BSA (poços).
9. O mesmo será feito para BSA replicação dois (bem 2), replicação BSA três (poço 3), as três repetições de a isca envenenada, e, finalmente, as três repetições dos poços de isca. No final, deve haver tubos etiquetados from 1-135 (135 é a última triplicado da última replicação do isco com a diluição máxima de 10 ^-6). Armazenar esses tubos Eppendorf durante a noite a 4 ° C (Figura 3C mostra a Eppendorf e tubos de borossilicato para todas as diluições dos triplicados das três repetições (três poços) de BSA.
10. Comece a 2 ou 3 tubos de cultura de células BLT5403 (escolhidos a partir de colónias isoladas a partir de um dia para o outro prato LB ^AMP100 recém listradas; do passo 2.2 acima) que crescem no shaker incubação (Figuras 2E e 2F) como uma cultura durante a noite. Para a 500 ml de LB (ponto 2.5 acima), adicionar ampicilina a 100 ug / ml e colocar o balão de Fernbach na braçadeira no incubador com agitação por isso será de 37 ° C e arejada na manhã seguinte (Figura 2F).

Nota: Em volta de três e quatro podem requerer diluições aproximadas de até 10 ^-10 volume de phage ao volume de LB ^AMP100.

SEGUNDO DIA

11. Na manhã seguinte, coloque as autoclavados, vazio 9 x 250 ml frascos de Erlenmeyer (um para cada placa de microtitulação) nos grampos no agitador incubação. Inocular 500 ml LB ^{100 AMP} com 500 mL de uma das culturas durante a noite de BLT5403 células começaram ontem à noite (veja o passo 3.8 acima), feche e iniciá-lo a crescer (37 ° C, 220 rpm). Ligue o espectrofotômetro (Figura 2H) e configurá-lo para ler a absorvância a 600 nm.
12. Remova a placa de microtitulação de 4 ° C, remover a película de plástico, e remover qualquer proteína não ligada a partir da placa por lavagem 10x com 200 ul de cada vez de 1x TBS, pH 7,5 e batendo a placa invertida sobre a toalha de papel entre as lavagens. Bloquear com 200 ul de 5% (w / v) de BSA e 200 ul de 5% (w / v) de reagente de bloqueio em TBS durante 1 h (ou durante a noite, se conveniente) com a chapa envolto em plástico.
13. Lavar o bloqueio solution 10x com 200 mL de cada vez de 1x TBST, batendo a placa de cabeça para baixo em 4 folhas de papel toalha entre as lavagens. É possível encher os poços com 200 mL de água nesta fase, cubra-os com filme plástico e colocá-los a 4 ° C para armazenar o máximo de 1 semana.

Nota: Comece a cultura em breve o suficiente para que, no momento em que o fago infectou-BLT5403 a partir da conclusão da seleção de afinidade está pronto para adicionar, as células em 500 ml são entre 0,6 e 1,0 OD _600. Se eles crescem muito além 1.0, lise pode não ocorrer devido a restrições de recursos como as células se aproximar fase estacionária. Se as células não atingir uma _DO600 de 0,6, pelo menos, antes da introdução do fago, a multiplicidade da infecção pode ser muito alta, rapidamente matar as células, o que pode influenciar a representação do lisado. Se as células ainda não se aproxima de uma _DO600 de 0,6 pela conclusão da selecção por afinidade, INOCUlate o frasco com mais BLT5403 a partir do segundo (ou mesmo a partir de ambos os segundo e terceiro) tubos de ensaio, agitação, a 37 ° C (Figura 2F). Se um OD ₆₀₀ de 1,0 está se aproximando muito rápido, desligar o aquecedor e agitador e abrir a tampa para esfriar a cultura e morrer de fome as bactérias para o oxigênio. Recomeçar o aquecimento / agitação uma vez que o fago foi adicionado.

A partir daqui usar dicas de barreira de filtro para evitar a contaminação cruzada fago.

14. Uma vez que o frasco é inoculado, colocar a biblioteca de fagos (100 uL) com as proteínas, selar a placa com filme plástico e incuba-se à temperatura ambiente durante 1 hora.
15. Aos 55 min, gravar o OD ₆₀₀ das células. O tempo de duplicação é aproximadamente a cada 20 min. Agir em conformidade (ver "Nota" acima).
16. Ao fim de uma hora remover a película de plástico a partir da placa e lavam imediatamente agitando o fago no lixo transformado e, em seguida, adicionando-se rapidamente 200 mL de TB 1xST. (Utilize um multipipettor com uma cabeça mL 1 = 100 e a pipeta definido em 2 [ou seja, oferece 200 depressão mL / êmbolo] para isso e ele vai rapidamente). Definir um temporizador para 1 min. Após 1 min, sacuda tampão no lixo transformado, placa tapa de cabeça para baixo em papel toalha e coloque de volta no banco (C placa 25 °). Repita as etapas de lavagem 10x.
17. Após o ^dia 10 de lavagem, 200 ul de tomar BLT5403 células do tubo Falcon de 50 ml a 4 ° C e colocá-los no fundo do poço, a partir do qual a última lavagem de TTBS foi removido. Enrole as placas em filme plástico e coloque a 37 ° C por 20 min para obter qualquer fago ainda está preso à isca para infectar as bactérias (ver nota na discussão sobre fago persistentemente recuperados e / ou alta fundo do fago indiscriminadamente ligação).
18. No final de 20 min, desembrulhar os pratos e levar 10 bactérias ul da BSA a 25 ° C a replicação um bem e colocá-lo nos 990 mL de LB ^{100 AMP} marcados"1". Repita duas vezes mais para que a cavidade (tubos 2 e 3), resultando em três triplicados de 1/100 de diluições do fago de que bem. Esta é uma réplica BSA amostrados três vezes. Estas diluições será utilizada para estimar o título médio ± SEM para que a replicação de BSA.
19. Fazer o mesmo para a replicação 2 e 3 de BSA (três amostras em triplicado de 10 ml cada), para as três cavidades replicadas da proteína isco envenenado, e para a proteína de isco. Defina esses 27 tubos Eppendorf de lado e obter os restantes 170 mL das bactérias infectadas nos poços de cultivo para lise.
20. Se as bactérias no balão é a OD ₆₀₀ = 0,6-1,0, decanta-se 50 ml de células a partir do balão de Fernbach em cada uma das nove frascos de Erlenmeyer de 250 ml. Leve os restantes 170 mL de infectados pelo fago BLT5403 bactérias na replicação BSA 1 poço e adicioná-lo aos 50 ml células marcadas "BSA Rep 1" (fita amarela). Faça isso para todos os nove poços e colocá-los agitando na incubadora ( Figura 2F).
21. Monitorizar as células no agitador a 37 ° C de incubação a partir de tempo de chegada ao tempo de lise (cerca de 3 horas a partir do momento da inoculação). Fazer as diluições a partir das 27 diluições iniciais (10 ^-2) nas apropriadas, tubos Eppendorf marcados durante este tempo.
22. Para executar essas diluições das 27 diluições iniciais a partir de 3,12 acima, tomar 100 mL de LB com bactérias de um tubo de Eppendorf (BSA replicação um, antes de as amostras em triplicado a partir desta diluição de 1/100 a partir deste alvéolo) e adicioná-lo ao 900 mL de LB em tubo Eppendorf de 4 (1 x 10 ^-4 diluição de BSA uma replicação, antes de as amostras em triplicado a partir desta cavidade).
23. Descartar a ponta de barreira de filtro para uma nova antes ficando 100 mL de LB com bactérias do tubo Eppendorf de 4 a adicionar aos 900 ul de LB em tubo Eppendorf de 7 (1 x 10 ^-5 diluição de BSA replicação um, primeiro da triplicado Amostras deste poço). Continuar as diluições (dprópria para 1 x 10 ^-6) para todos os triplicados de todas de todas as repetições de proteínas e os tratamentos (135 tubos no total).
24. Uma vez que as células foram lisadas, trazer a cultura de NaCl 0,5 M por adição de 5 ml a partir de um estoque de NaCl 5 M e transferir para um frasco de centrífuga rotulado.
25. Centrifugar a 8.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Decantar o sobrenadante (vírus) em um, estéril 50 ml tubo Falcon limpo.
26. Adicionam-se algumas gotas de clorofórmio para o sobrenadante decantado no tubo de Falcon.
27. Armazenar a 4 ° C para a próxima rodada de seleção de afinidade.

4. Terceiro dia

1. Autoclave ou branquear todo material de laboratório que tem sido utilizado na geração desta selecção afinidade rodada para se preparar para a próxima rodada.

5. Titulação

1. Número de muitos sólidos LB ¹⁰⁰ placas ^AMP como existem diluições em ordem ascendente (deve agora ser uma placa para cada tubo de borosilicato e tubo de Eppendorf, cada um com o mesmo número). Put as placas no 37 ° C incubadora (Figura 3D).
2. Derreta top agarose (1,0 g Bacto Tryptone, extrato de levedura 0,5 g, 0,5 g de NaCl, 0,6 g de agarose, para fazer 100 ml, autoclave), soltando a tampa do frasco de agarose superior e alternadamente microondas a garrafa e girando-a para misturá-lo até o topo agarose esteja completamente derretido. Colocar o frasco no banho de água para arrefecer a 50 ° C (Figura 3E).
3. Dê uma pipeta de borosilicato 10 ml com uma bomba de pipeta anexado. Acenda um bico de Bunsen. Vire um suporte de isopor tubo Falcon ou tampa refrigerador de cabeça para baixo no banco e colocar as placas LB100 AMP de 1 a 6 (recém-saído da incubadora 37 ° C) sobre ele, placa 1 para cima (Figura 4A). O isopor mantém os pratos quentes.
4. Coloque 250 mL BLT5403 células de 4 ° C em cada um dos tubos de ensaio de borosilicato numeradas preparados em um dia acima (seção 3.7 e Figuras 4B e 4C). Arvariar os tubos de borossilicato numerados da mesma série ascendente como as diluições nos tubos de 1,5 ml de Eppendorf (Figura 4A).
5. Colocar 100 mL da diluição em tubo de Eppendorf de 1 em 250 ul de células em tubos de ensaio de borosilicato 1 (Figuras 4D e 4E). Aqueça o primeiro 5 em da pipeta sobre a chama um pouco (mas não muito! ~ 3 furtos, Figura 4F) e mergulhar no topo agarose fundida. Puxe 3 ml e entregar rapidamente para o tubo de ensaio no topo da células / fago (Figura 4G).
6. Misture sacudindo com um dedo, segurando o tubo com a outra mão (Figura 4H) e despeje o conteúdo na placa (Figura 4I). Inclinar a placa e usar o tubo de ensaio a perseguir bolhas e manchas secas até que toda a placa é coberta pela parte superior de agarose. Defini-lo de lado, em pé no banco para esfriar.
7. Descartar o tubo de borosilicato, retire a ponta barreira de filtro, obter umuma fresca e continuar até que todas as diluições foram plaqueadas. Recuperar LB ¹⁰⁰ placas ^AMP da incubadora como eles estão esgotados, mas não mais do que 6 de cada vez ou arrefecem e o topo de agarose solidifica muito rapidamente.
8. Uma vez que a top agarose é sólido, transformar as placas de cabeça para baixo (é importante fazer isso). Caso contrário, o agar / agarose "chora", condensa na tampa, cai em cima de agarose e atropela-lo, tendo o fago com isso tornando-se impossível título com precisão) e: 1) colocar as placas nos 37 ° C incubadora [be back 4 horas mais tarde para contar o título como T7 é agressivo] OU: 2) Deixá-los de cabeça para baixo no banco e eles estão prontos na manhã seguinte para contar título.
9. Tomando todas as precauções necessárias para proteger contra a quebra de vidro, ou lesão, se isso acontecer, coloque a tampa do frasco de agarose top de volta livremente e microondas topo agarose até ferver. Faça isso duas vezes. Deixe esfriar, aperte otampa e colocá-lo fora. Vire o banho de água até a sua temperatura normal ou desligá-lo. Coloque as diluições no 4 ° C frigorífico. Eles serão necessários para interpretar os títulos e / ou refazer alguma da titulação.

6. Determinação e Cálculo Titer

1. Examinar a placa formada sobre as placas e descartar aqueles com lise confluente (Figura 5A por exemplo, 10 ^-2 diluição). Determine qual das diluições restantes produziram suficientemente poucos placa para permitir um registro exato (Figuras 5A 5B nd). Anote o número da placa de estas placas (Tabela 1; Figura 5B).
2. Multiplicar o número de placas por diluição e depois multiplicar este número por 100 para se obter o número de unidades formadoras de placas por ml de bactérias infectadas retiradas dos poços (isto é, apenas 10 ul de bactérias infectadas foram colhidas para cada um dos triplicados e so que deve ser multiplicado por 100 para obter contagens por ml). Média, o número de unidades formadoras de placas (UFP) por mililitro (UFP / ml de bactérias não diluídas infectados retirados da placa de microtitulação), nos três triplicatas tomadas a partir deste bem.
3. Formar uma grande média das contagens para os três poços replicar e calcular o erro padrão dessa média (Tabela 1). Isto é o que será gravado na figura do aumento do fago título para cada fase de selecção e tratamento (Figura 5C) de afinidade.

7. Isolamento Plaque, PCR e seqüenciamento

1. No final da afinidade seleção round 4, selecione 18 individual, bem definido, colônias de placa e, usando uma pipeta Pasteur estéril, palito, ponteira amarela ou dispositivo semelhante, o núcleo destas placas das placas de titulação. Se usando tubos ou as pontas, primeiro molhar o interior com o Tris-HCl, pH 8,5 no tubo Eppendorf (Figura 5D).
2. Se estiver usando tubos, certifique-se o tubo de borosilicato não detém gotas de excesso de Tris, aperte o bulbo e, com ele ainda comprimido, empurre a ponta de borosilicato pipeta através de uma placa bem isolado direito ao plástico Petri abaixo (Figura 5E). Solte a lâmpada com a ponta da pipeta ainda no top agarose agar / e sugar o núcleo (Figura 5F, ver seta).
3. Expelir o núcleo em 100 ul de Tris-HCl, pH 8,5 no tubo apropriado (Figura 5G) e vortex brevemente.
4. Aquecer 20 ul a partir deste volume, a 65 ° C durante 10 min.
5. Centrifuga-se o volume de aquecida a 13.000 xg numa centrífuga de bancada à temperatura ambiente durante 10 min. Tomar 3 ul do sobrenadante desta alíquota a ser usado em reacções de PCR com T7 e T7-UP-BAIXO iniciadores.
6. Para cada um dos 18 isolados de placa, soluções aquecidas, fazer uma de 50 uL da reacção de PCR utilizando uma temperatura de emparelhamento de 58 ° C e 35 ciclos.
7. Execute 20 l de each reacção de um 1% (w / v) de gel de agarose contendo 0,015% (v / v) de brometo de etídio. Visualize com um transiluminador de usar a proteção adequada para os olhos e luvas de borracha nitrílica de laboratório. (ATENÇÃO: O brometo de etídio é um agente mutagênico potente.) Fotografe o gel e descarte de materiais contaminados apropriadamente (Figuras 6A e 6B).
8. Se os produtos de amplificação são produtos individuais, e não a partir de vector vazio (produto corre perto de 100 bp em um 1% (w / v) de gel de agarose TAE, Figuras 6A e 6B setas), limpar os restantes 30 mL para uso como um molde de sequenciação. Se não é um produto único no gel (Figura 6B, a placa 15), cortar a banda mais importante (s) a partir do gel e extrai-se o ADN a partir do gel utilizando um kit.
9. Seqüência dos amplicons que não são vetores vazios usando o primer T7-UP.
10. Examine cada seqüência para os braços vinculador e, a partir dessa informação, determinar em que o início da inserção está localizado. Use o Basic local Alignment Search Tool (BLAST, National Library of Medicine) para determinar a identidade do cDNA codificado, se a inserção é no quadro e, em caso afirmativo, qual porção da proteína sequência codificante (CDS) foi exibido e capturado pelo isca.

Results

Ser capaz de prejudicar a capacidade de o isco para interagir com proteínas exibidas em fagos (metabolicamente envenenando o isco) proporciona um controlo negativo potente para esta técnica. Também é aconselhável para determinar se o isco,, quando ligados à placa de microtitulação, mantém a sua função. Ambos os cheques aumentará a confiança que interagem, proteínas exibida de fagos recuperados pela isca nonpoisoned são legítimos.

Amostragem de três triplicados de cada cavidade aumenta consid...

Discussion

Ao executar o experimento em três poços replicados, fago adquirida independentemente de a mesma ligação com a proteína de isca pode ser distinguida, mesmo se eles são o mesmo clone (isto é, não houve diferença na sequência de nucleótidos da região de CDS que foi adquirido, mas estes têm sido recuperado a partir de poços independentes). Caso contrário, a única maneira de diferenciar entre o fago que codifica para a mesma ligação com a proteína isco é, se eles são independentemente inverter regiões transcritas qu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.
levedura	Becton Dickinson	212750
Ágar	Becton Dickinson	214010
Cloreto de sódio	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Reagente de bloqueio	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Hidróxido de Sódio	Fisher Scientific	BP359-212
Dodecil Sulfato de Sódio	Fisher Scientific	BP166-500
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-5
Clorofórmio	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genótipo: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicilina,		Fisher
	Scientific	BP102-1
Albumina de Soro Bovino (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS anticorpo primário	Qiagen Inc.	34660
Conjugado de fosfata alcalina anti-rato de cabra	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-nitrofenilfosfato	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5' - GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'T7-DOWN
primeira demão	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'Qiaquick
PCR kit de purificação	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Kit de extração de gel	Qiagen Inc.	28706
Kit de Sequenciamento de Ciclo Big Dye Terminator v3.1	Invitrogen Life Technologies	4336917
Bloco de Aquecimento	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
Placas de Cultura de Células de 96 poços	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Forno	Pipetas Pasteur	516D
Scientific, 5 ¾ em	Transiluminador ChromaView	13-678-20A
	Scientific UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Luvas, Nitrilo	Fisher Scientific	19-170-010C
Tubos estéreis de 1,5 ml	USA Scientific Inc	1615-5500
Pipetas de borosilicato de 10 ml	Fisher Scientific	13-678-25E
Tubos de cultura de borosilicato	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, leitor de placas ELISA	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinque, Finlândia	Tipo 362