O uso crescente de peixe-zebra como um modelo animal requer o desenvolvimento de métodos eficazes para a entrega de quantidades conhecidas de compostos e soluções. O procedimento de gavagem descrito abaixo permite a distribuição oral de volumes precisos de solução fiável, segura e eficiente de peixe-zebra adultos.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O peixe-zebra tornou-se um importante modelo in vivo na pesquisa biomédica. Métodos eficazes devem ser desenvolvidos e utilizados para fornecer compostos ou agentes em soluções para a investigação científica. Os métodos atuais para a administração de compostos oralmente para zebrafish adultos são imprecisos devido à variabilidade no consumo voluntário pelos peixes. Um procedimento de gavagem foi desenvolvido para entregar quantidades precisas de agentes infecciosos para peixe-zebra para o estudo em pesquisa biomédica. Peixe-zebra adultos com mais de 6 meses de idade, foram anestesiados com 150 mg / L de tamponada MS-222 e gavaged com 5 mL de solução usando implantação tubo flexível do cateter ligada a um corte de 22 L da ponta de agulha. O tubo flexível foi baixada para dentro da cavidade oral do peixe-zebra, até a ponta do tubo estendida para além das guelras (aproximadamente 1 cm). A solução foi então injectada lentamente no tracto intestinal. Este método foi eficaz 88% do tempo, com peixe recuperação sem intercorrências. Esteprocedimento também é eficaz como uma pessoa pode gavagem 20-30 peixes em uma hora. Este método pode ser utilizado para administrar agentes precisamente para estudos de doenças infecciosas, ou estudos de outros compostos em peixes-zebra adultos.
Introdução
Os métodos atuais para a administração de compostos oralmente para zebrafish incluem compostos administração top-revestidos para alimentação, misturados em dietas de gelatina 1, bioencapsulated em salmoura camarão 2, misturado com dietas lipídicas encapsuladas 3, cera contas de pulverização 4 e via dietas à base de glúten. 5 Limitações estes métodos de administração oral incluem altas taxas de lixiviação e consumo composto incompleta ou imprevisível por peixes individual. Essas variáveis são problemáticas porque em estudos de doenças infecciosas, sabendo que a dose infecciosa administrado ao peixe pode ser fundamental para o sucesso do estudo. Além disso, o trabalho anterior tenha mostrado que certos compostos administrados em banhos de água causar lesão tóxica para as guelras do peixe-zebra intestinais antes que os efeitos que podem estar sob estudo ocorrem 6.
Gavage é um método padrão usado em outras espécies de animais de laboratório para administrar quantidades precisas de um produto com akconcentração nown para estudo na investigação biomédica e farmacêutica. Só recentemente os métodos para gavaging peixe-zebra foram descritos na literatura. Uma técnica descrita é um método de duas pessoas utilizando uma bainha de cateter 24 G ligada a uma pipeta de 2-20 ul de entregar 5 ul de solução. 7 O método descrito teve uma taxa de mortalidade de 8,7% e 39% no primeiro e segundo ensaio, respectivamente, a maioria da mortalidade foi atribuída a fêmeas grávidas. A segunda técnica gavage descrito seringas gavage atraumáticas usados para administrar 5 ml de solução para medakas (Oryzias latipes). 8 Informações sobre a mortalidade não foi fornecido eo processo exato de realizar a sonda não foi descrita. De acordo com a Canadian Council on Animal Care e do peixe-zebra de Laboratório, até 1% de peso do corpo do peixe, podem ser administrados através de sonda esofágica. 9,10 nosso objectivo foi desenvolver um método repetitivo, segura e eficiente de fornecer volumes precisos de ptlibras por via oral para zebrafish adultos de ambos os sexos e em todas as fases de reprodução. Este procedimento seria aplicável para qualquer estudo em que é necessária a administração oral de um composto precisas.
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Protocolo
1. Preparar a solução anestésica
- Prepara-se uma solução de 150 mg / L de MS-222, em água do sistema a partir de uma solução estoque ou a partir da forma em pó.
- Verifique se o pH com um medidor de pH.
- Tampão de bicarbonato de sódio, como necessário, até que o pH está entre 7-7,5.
- Prepare um tanque de água do sistema livre de MS-222 para o peixe para se recuperar dentro O tempo de recuperação é normalmente menos de 1 min.
2. Preparando o aparelho Gavage
- Corte a clara 22-G implantação tubulação para um pouco mais do que o comprimento aproximado da boca para o bulbo intestinal do peixe. Inicialmente, sugerimos anestesiar um peixe para cada novo grupo que está sendo usado para obter a melhor estimativa do comprimento necessário.
- Empurrar o tubo de implante de corte clara para a agulha 22 G ½ polegada até que seja segura e não há risco de separar. Se uma agulha ½ 22-C não estiver disponível, cortar uma agulha mais longa approximately esse comprimento.
- Quando completa, a implantação tubo do cateter deve estender-se a cerca de 1 cm da ponta da agulha, ou mais curtos, se os peixes são menores.
- Conecte o hub agulha 22-G para um luerlok seringa de 1 cc.
3. Preparando-se para Gavage
- Corte um sulco em uma esponja com uma lâmina de bisturi.
- Mergulhe a esponja na água sistema livre de MS-222.
- Coloque a esponja humedecida sobre uma superfície plana.
- Desenha-se a 5 mL de solução adequada para a administração por sonda para o tubo do cateter 22-G e uma seringa de 1 cc.
4. Anestesia e Gavage
- Rápido o peixe, pelo menos, 24 horas antes do procedimento.
- Coloque o peixe na solução de MS-222 até perder a sua reflexo de endireitamento, e não responde a uma aleta de aperto da cauda, mas mantém a circulação opérculo. Isso normalmente leva cerca de 2-3 min.
- Retire o peixe da solução anestésica e colocá-lo ema ranhura na esponja com a cabeça ligeiramente saliente a partir da esponja, mas as guelras cobertos por esponja.
- Mover a esponja para uma posição vertical.
- Abra a boca do peixe-zebra com o tubo do cateter 22-G.
- Inserir o tubo suavemente até que a ponta é passado as guelras (cerca de 1 cm ou o comprimento do tubo). O tubo de implantação não precisa ser forçado. Resistência sugere o tubo pode ser batendo o arco ou coração branquial.
- Se houver resistência, retirar delicadamente, reposicionar e tente novamente.
- Injectar o material lentamente.
- Enquanto está a injectar, certifique-se de que a solução não sair através das guelras ou a boca.
- Retire o peixe da esponja e colocar no tanque de recuperação.
- A recuperação ocorre tipicamente em menos de 1 min, e é indicado pelos peixes nadando na vertical e manter o equilíbrio.
- Monitorar peixe para regurgitação, como mostrado, visualizando o peixe expulsar ativamente material de sua boca, ou nenhum movimento opercular.
- Os peixes podem ser devolvidos ao seu tanque regularmente, uma vez que eles se recuperaram.
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Resultados
Ambos os sexos, de peixe, incluindo fêmeas grávidas foram gavaged com sucesso (Figura 1). Um procedimento bem sucedido, leva menos de um minuto com o líquido não visto saindo as brânquias ou a boca. A tubulação entra facilmente, sem força, sem sangue visto após a remoção do cateter. O procedimento é rápido, necessitando de aproximadamente 10 min, a administração por sonda 3-4 peixes, com uma média de 30-45 seg por peixe.
Peixe-zebra não deve ser gavaged com mais de 5 ul de u...
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Discussão
Significado
Esta técnica é um aperfeiçoamento e oferece várias vantagens em relação a ambas as técnicas descritas anteriormente para o peixe-zebra gavaging adulto. Em primeiro lugar, o uso de uma esponja para restringir os peixes permite que uma pessoa para realizar o procedimento, em oposição a uma técnica previamente descrita exige duas pessoas. Segunda 7, o cateter de implante de tubagem é mais flexível do cateter IV, que pode ajudar a minimizar o trauma secundário devido a perfur...
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
A Universidade comparativa Centro de Biociências Rockefeller deu apoio para este projeto. Agradecemos Janelle Monnas para assistência técnica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| A esponja | |||
| seringa luer lock de 1 cc | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G (corte) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 agulha de 22 G (corte, se necessário)Medidor de | Becton Dickinson Co | ||
| Sonda | |||
| 1 lâmina | |||
| [cabeçalho] | |||
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
Referências
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Reimpressões e permissões
