Em larga escala Knockdown Gene em C. elegans Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

Resumo

Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.

Resumo

RNA de interferência, alimentando vermes bactérias expressando dsRNAs tem sido uma ferramenta útil para avaliar a função do gene em C. elegans. Embora esta estratégia funciona bem quando um pequeno número de genes são direcionados para knockdown, telas de alimentação de grande porte mostram eficiência knockdown variáveis, o que limita sua utilidade. Temos Desconstruído protocolos knockdown RNAi publicados anteriormente e descobriram que a fonte primária do knockdown reduzida pode ser atribuída à perda de plasmídeos que codificam dsRNA das bactérias alimentadas aos animais. Com base nessas observações, temos desenvolvido um protocolo de alimentação dsRNA que reduz muito ou elimina a perda de plasmídeo para alcançar eficiente e de alta taxa de transferência knockdown. Demonstramos que este protocolo irá produzir robusto, batida reprodutível para baixo de C. elegans genes em vários tipos de tecidos, inclusive neurônios, e permitirá knockdown eficiente em telas de grande porte. Esse protocolo utiliza uma alimentação de dsRNA disponível comercialmentebiblioteca e descreve todos os passos necessários para duplicar a biblioteca e executar telas dsRNA. O protocolo não requer a utilização de equipamentos sofisticados, e, portanto, pode ser realizada por qualquer C. elegans laboratório.

Introdução

Historicamente, telas genéticas em C. elegans foram realizados pelo tratamento dos animais com um agente mutagénico químico tal como metanossulfonato de etilo para criar mutações aleatórias no DNA. Descendência ou seus netos de animais mutagenizadas são então isolados que exibem um fenótipo anormal desejado. A mutação responsável por causar o fenótipo é, então, identificado através de um procedimento de mapeamento de trabalho intensivo ou por sequenciar todo o genoma do verme mutante. Há muitas vantagens para a realização de tais telas mutagênese química como eles criam lesões permanentes dentro do genoma verme que pode resultar em ambos os fenótipos ganho de função e perda de função, mas o procedimento de mapeamento é lento e caro.

Interferência de RNA de cadeia dupla (dsRNAi) fornece um meio alternativo para identificar genes envolvidos em processos biológicos importantes. Neste método, o dsRNA correspondentes da sequência de codificação de um gene endógeno é introduzido no verme.O dsRNA é processado in vivo para gerar pequenas (21-22 nucleotídeos) RNAs que servem como guias para encontrar e ligar os mRNAs endógenos correspondentes, orientando-as para a destruição ^1. Este procedimento é relativamente rápido, mas porque o dsRNA tem como alvo ARNm, em vez de ADN, apenas fenótipos redução de função são observadas utilizando esta abordagem.

Introdução de dsRNAs em um animal pode ser conseguida por injecção directa de dsRNA ^2, por imersão em animais dsRNA ^3, ou por alimentação de animais, bactérias que expressam ARNcd ^4. Cada um destes métodos de entrega de provocar efeitos sistémicos knockdown como a maioria das células do animal expressar SID-1, um canal transmembranar capaz de importar dsRNA ^5. Originalmente utilizada como uma abordagem genética reversa para knockdown a expressão de genes individuais, uma de cada vez, o desenvolvimento de duas bibliotecas de alimentação permite agora telas genéticos em grande escala. As bibliotecas de dsRNA comercialmente disponíveis contêm baclones cterial representando ou 55% ou 87% de todo o C. elegans genes ^{6, 7.}

Infelizmente, em grande escala telas alimentação dsRNAi muitas vezes resultam em eficiência knockdown variáveis ^​​8-10. Enquanto o nível absoluto de knockdown por RNAi não é facilmente medido, a eficiência knockdown reduzido observado em telas de grande porte deve ser causada por mRNAs específicos de genes residuais que escapam da degradação por RNAi. Este, por sua vez, pode ser um resultado direto da perda de dsRNA plasmídeo a partir de bactérias alimentadas aos animais nessas telas. Apoiar essa idéia, os animais alimentados com misturas de bactérias, em que apenas 50% das bactérias expressar dsRNAs contra um gene alvo, mostram dramaticamente reduzida (se houver) efeitos knockdown quando comparado ao grupo controle alimentado ^11. A extensão do knockdown do gene torna-se uma preocupação crítica ao realizar telas dsRNAi como a maioria dos genes em C. elegans são haplosufficient e, assim, a expressão de genes deve ser reduzido em pelo menos 50% to causar de perda de função fenótipos ^12.

Usamos protocolos de alimentação publicados anteriormente para executar telas em grande escala e encontrou os mesmos efeitos knockdown variáveis ​​relatados por outros ^8-10. Em uma pesquisa de possíveis causas, descobrimos que quase 60% das bactérias alimentação de animais na tela tinha perdido o plasmídeo dsRNA. Nós desenvolvemos um protocolo de duplicação e triagem de biblioteca que reduz drasticamente ou elimina a perda de plasmídeo e melhora a eficiência knockdown. Este protocolo é adequado para a realização de telas de grande escala em C. elegans e pode ser utilizado para rastrear qualquer uma das bibliotecas de dsRNA disponíveis comercialmente. Usando este protocolo, descobrimos que essencialmente 100% das bactérias administradas aos animais durante o ecrã reter o dsRNA plasmídeo e causar perda robusto e altamente penetrante de fenótipos funcionais em todos os tecidos examinados.

Protocolo

Nota: Este protocolo pode ser utilizado para identificar os genes necessários para uma variedade de processos biológicos, em uma variedade de tipos de tecidos. Como um controlo de qualidade necessários durante a tela, os animais são alimentados tanto positivas como negativas bactérias expressando dsRNA de controlo para demonstrar os efeitos de RNAi no tecido alvo.

Outros protocolos de alimentação publicados crescer as bactérias que expressam ARNcd na presença de qualquer um de 50 ug / ml de ampicilina ou 25 ug / ml de carbenicilina ^8-10. Descobrimos que as bactérias cultivadas em qualquer uma dessas condições perder o plasmídeo dsRNA em alta freqüência. Com efeito, verificou-se que, mesmo quando as bactérias são cultivadas durante a noite em concentrações muito elevadas (até 2 mg / ml) de ampicilina mais do que 50% das bactérias não contêm plasmídeo. Embora o crescimento de carbenicilina geralmente resultou em maior retenção do plasmídeo, 25 ug / ml não foi suficiente para prevenir a perda de plasmídeo. Em vez disso, descobrimos que concentra carbenicilinações de 500 ug / ml, e foram obrigados a bloquear a perda de plasmideo durante o crescimento em culturas líquidas e 2 mg / ml de carbenicilina foi necessária para bloquear a perda do plasmídeo, quando as bactérias foram cultivadas em substratos de agar sólido.

Devido a retenção de plasmídeo é crítico para o sucesso de knockdown, apenas carbenicilina é utilizado quando as bactérias são cultivadas dsRNA neste protocolo. Temos cuidadosamente optimizadas, a concentração de carbenicilina utilizado nas culturas de crescimento de bactérias descritas neste protocolo para assegurar que as bactérias que não contêm o plasmídeo não crescem nestas culturas. No entanto, como uma medida de controlo de qualidade, a perda do plasmídeo é determinada em vários passos do protocolo. Para garantir knockdown eficiente, mais do que 80% das bactérias em cada uma dessas etapas pode conter dsRNA plasmídeo. Se mais do que 20% das bactérias em qualquer etapa do protocolo ter perdido o plasmídeo de dsRNA, verificar a qualidade da carbenicilina utilizado. Carbenicilina deve ser preparado no dia em que é usado. Preparar carbenicilina fresco e repetir a cultura.

1. Como determinar a perda do plasmídeo

1. Retirar uma pequena amostra de bactérias (conforme descrito em cada passo relevante) e adicioná-lo aos 450 ul de água estéril.
2. Use 100 ml desta amostra diluída para criar ainda mais 1:10, 1:100, 1:1000 e diluições utilizando água estéril, misturando as soluções completamente entre diluição.
3. Espalhar 100 ul de cada diluição em placas de LB e LB AMP e incubar estas placas durante a noite a 37 ° C.
4. No dia seguinte, a placa de identificação de LB que contém entre 100 e 500 colónias bacterianas. Contar o número de colónias sobre esta placa e na placa de LB AMP correspondente (contendo a mesma diluição de bactérias).
5. Determinar a perda de plasmídeo a partir destas contagens de colónias. A percentagem de bactérias que não contêm o plasmídeo é calculada utilizando a equação 1, e deve ser inferior a 15% por eficaz dsRNA knock down.

"Equação 1" src = "/ files/ftp_upload/50693/50693eq1.jpg" />

2. Fazendo placas Duplicate Biblioteca

Resumo: A biblioteca dsRNA chegará do fabricante (OpenBiosystems) como 10.566 clones bacterianas em placas de 96 poços. Armazene as placas imediatamente em freezer -80 ° C. As placas da biblioteca de origem será duplicado e todas as telas de alimentação vai utilizar as placas duplicadas biblioteca como fonte de bactérias. É aconselhável guardar o original e duplicado placas de biblioteca em freezers separados. Para se recomenda a facilidade de manuseamento, a duplicação de apenas 10 placas da biblioteca por dia.

1. Remova a placa de biblioteca (s) de -80 ° C congelador e retire o selo de alumínio, enquanto culturas ainda estão congelados. Recoloque a tampa de plástico da placa da biblioteca e colocou o prato sobre uma superfície plana para descongelar à temperatura ambiente (não mais do que 30 min).

Nota: Temos notado que um p significativoercentagem de bactérias encontradas em cada poço das placas de bibliotecas originais não contêm plasmídeo. No entanto, porque as bactérias são uma biblioteca recurso precioso, não é recomendado para testar a perda de plasmideo nas culturas de bibliotecas originais.

2. Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 150 ul de meio duplicação biblioteca para cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano placa duplicada vazio.
3. Misturar as culturas bacterianas biblioteca descongeladas por pipetagem para cima e para baixo 4-5 vezes utilizando uma pipeta multicanal definido para 100 ul. Em seguida, retire 10 ml de cada cultura mista e transferir para os poços correspondentes da placa duplicada. Continue a transferir culturas de placa biblioteca para duplicar placa certificando-se de mudar as pontas de pipeta para cada transferência.
4. Depois de todas as culturas a partir de uma chapa de biblioteca foram transferidos, cobrir os poços da placa de biblioteca original com nova folha adesiva usando um rolo brayer para garantir uma vedação completa. Colocar a tampa de plástico na placa ecolocá-la na posição vertical num congelador a -80 ° C até as culturas foram novamente congelado (pelo menos 30 minutos). Em seguida, mova as placas biblioteca original de volta em uma caixa de armazenamento de biblioteca.
5. Agitar duplicados culturas em placas de biblioteca planas para 8-10 horas a 37 ° C (450 rpm num microshaker, órbita 3 mm).
6. Determinar a perda de plasmídeo em cada placa biblioteca duplicado. Nós descobrimos que uma proporção elevada das bactérias em cada poço da placa de biblioteca original não continha dsRNA plasmídeo. É importante que estas bactérias, não contribuem para o crescimento da biblioteca duplicado. Para prevenir o seu crescimento, uma alta concentração de carbenicilina é usado nos meios biblioteca duplicação (3 mg / ml). Depois de uma cultura de placa de duplicação usando estas condições descobriu-se que mais de 90% das bactérias contêm dsRNA plasmídeo. Retirar 10 mL da amostra a partir de uma cultura bem representativa de cada uma das placas em duplicado e adicioná-lo aos 450 ul de água estéril. Utilizando estas amostras diluídas, determinar a perda de plasmídeo em cada biblioteca duplicadoplaca de acordo com os passos 1,1-1,4. Se for observada perda plasmídeo significativa (> 20% das bactérias na biblioteca duplicata não contêm plasmídeo), refazer o meio de cultura fresco carbenicilina e repita protocolo do passo 2.1.
7. Após a incubação, colocar uma nova folha adesiva folha diretamente sobre os poços da placa de duplicados, e coloque as tampas de placa sobre este papel alumínio. Colocar as placas de biblioteca duplicados na posição vertical em um congelador a -80 ° C (pelo menos 30 minutos) até congelada. Uma vez congeladas, as placas mover-se para a caixa de armazenamento de biblioteca duplicado para armazenamento a longo prazo.

3. Fazer cópias temporárias da Biblioteca em Omniplates

Resumo: Para começar a preparar comida para uma tela de dsRNA, bactérias de placas biblioteca duplicados são transferidos para omniplates ágar sólidos e cresceu durante a noite. Para evitar a perda de plasmídeo em meios sólidos, omniplates contêm carbenicilina a 2 mg / ml. As bactérias nessas placas pode ser usado por um períodode uma semana, e não apresentam qualquer perda de plasmídeo. Não foram testadas quanto à perda do plasmídeo em bactérias cultivadas em omniplates superiores a uma semana.

1. Remova a placa de biblioteca duplicado (s) de -80 ° C congelador e retire o selo de alumínio, enquanto as culturas ainda estão congelados. Depois de retirar o papel alumínio, substituir tampa de plástico da placa e colocou o prato biblioteca duplicado em uma superfície nivelada para descongelar à temperatura ambiente (não mais do que 30 min).
2. Esterilizar o Boekel 96 pin replicador. Os pinos de um replicador de limpeza deve ser lavado com água destilada e em seguida esterilizado antes de cada utilização. Para esterilizar o replicador, coloque-o em um banho de etanol (3/4 no fundo de um pirex) e, em seguida, queimar o etanol revestindo os pinos fora de usar um bico de Bunsen. Permitir que o chama para extinguir e repita.
3. Coloque o replicador esterilizados nas cavidades da placa duplicada descongeladas e usá-lo para agitar suavemente as culturas. Pequenos volumes de cultura irá aderir aos pinos do replicador.
4. Retire cuidadosamente o replicador dos poços da placa de duplicata e colocá-lo (pinos para baixo) suavemente na superfície do omniplate, tomando cuidado para não perfurar a superfície do ágar. Deixar o replicador na superfície do omniplate para 3-4 segundos de modo a que as bactérias a partir dos pinos do replicador são transferidas para a superfície do agar.
5. Remover o replicador e permitir que o volume pequeno (2-3 ul) da cultura bacteriana de absorver no ágar. Incubar as omniplates invertidos para 15-18 hr a 37 ° C. Estes omniplates pode ser usado na manhã seguinte para inocular 96 culturas bem líquidos. Alternativamente, omniplates contendo colónias bacterianas durante a noite pode ser armazenado até sete dias a 4 ° C.
6. Para de transferência de réplica placas duplicadas adicionais, lavar as pontas replicador com água estéril e repita o processo de esterilização, colocando o replicador em etanol e flamejante duas vezes, como antes. Uma vez esterilizados, o replicador pode ser utilizado na próxima placa duplicada.

4. Preparação de bactérias para alimentação Worms

OÍNTESE: Bacteria para vermes alimentação são preparados como 1 ml culturas líquidas (em um formato de 96 poços) usando bactérias das omniplates. Estas culturas líquidas são cultivadas durante a noite para gerar culturas bacterianas nonlogarithmic saturadas. Crescimento durante a noite garante que todas as culturas irão conter concentrações semelhantes de bactérias e, por conseguinte, todos os vermes serão alimentados com a mesma quantidade de alimento. Sem perda de plasmídeo durante este crescimento deve ser observada.

1. Repartir 1 ml de meio de crescimento bacteriano em cada poço de 2 ml de poços profundos de placas de 96 poços usando uma pipeta de repetição e 50 ml Combitip.
2. Coloque replicador estéril sobre a superfície do omniplates contendo colônias de bactérias geradas nas etapas 3,1-3,6 assegurando que os pinos estão em contato com cada um dos 96 colônias bacterianas.
3. Mover cuidadosamente o replicador da superfície do omniplate na placa de poço profundo assegurando que os pinos não raspar as partes laterais dos poços profundos até imersos em meio de crescimento. Mova oreplicador lentamente num movimento quadrado seguinte a parede interior da placa de poços profundos para desalojar as bactérias para o interior do meio de crescimento. Tenha cuidado para não espirrar e cross contaminar poços.
4. Os poços de controlo: Para cada placa de cultura de 96 poços profundos bem adicionar um ARNcd que expressam bactérias a uma cavidade que irá actuar como um controlo positivo para o fenótipo esperado knockdown e adicionar as bactérias que contêm o vector vazio dsRNA (pL4440) como um controlo negativo para o outro bem . Nós re-sequência de controlo de bactérias, uma vez por semana em placas de LB contendo tetraciclina (15 ug / ml) e carbenicilina (2 mg / ml), de modo que as bactérias permanecem frescos e reter o plasmídeo que expressa ARNcd.
5. Utilizando uma ansa de inoculação estéril remover uma única colónia bem isolado a partir da placa de controle (aproximadamente a mesma quantidade de bactérias transferidas pelo replicador) e inocular um poço vazio na placa de cultura de fundo. O registo da posição do bem que tenha sido inoculada. Alternativamente, o laço com bactérias cum ser transferida para um tubo de Eppendorf contendo 250 uL meios de crescimento, centrifugadas e em seguida usada para inocular vários poços.
6. Agitar as placas de profundidade bem numa posição plana a 650 rpm em microshaker (órbita de 3 mm) a 37 ° C durante a noite. As culturas serão saturado pela manhã seguinte. Independentemente disso, a concentração de carbenicilina utilizados nestas culturas deve evitar a perda de plasmídeo.
7. Determinar a perda de plasmídeo em um culturas ml durante a noite. As culturas irão ser utilizados directamente para alimentar vermes para a tela. É importante que mais de 80% das bactérias em cada cultura conter dsRNA plasmídeo. Determinar a perda de plasmídeo para duas culturas representativas de acordo com os passos 1,1-1,4. Expectativa: Mais de 90% das bactérias em cada cultura conterá dsRNA plasmídeo. Nós nunca observaram perda plasmídeo significativo nestas culturas durante a noite, mesmo quando cultivadas a saturação. No entanto, se for observada perda plasmídeo significativa (> 20%), refazer os meios de crescimento usando carbenicilina fresco e repcomer protocolo a partir do passo 4.1. As culturas podem ser reiniciado a partir dos omniplates originais desde que os omniplates estão a menos de 1-2 semanas de idade.
8. Uma vez utilizado para iniciar culturas de 1 ml, os omniplates são armazenadas a 4 ° C até que a tela é completada e pode ser usado como uma fonte de alimento para iniciar quaisquer culturas reteste.
9. Após incubação durante a noite de culturas, utilizar uma pipeta multicanal de 12 canais para remover 150 mL de cultura bacteriana a partir da placa de fundo e assim ejectar sobre a superfície da placa de alimentação. É importante não para perfurar a superfície do agar durante a transferência como vermes vão toca e não se alimentam de bactérias expressando dsRNA. A transferência pode ser feita de quatro poços de cada vez (Figura 1). Para fazer isso, coloque as pontas de pipeta em cada terceiro canal da pipeta multicanal (como há apenas 4 poços por linha na placa de alimentação). Após cada conjunto de 4 poços é transferido, mudar para novos, pontas para pipetas esterilizadas. Cada placa de 96 poço profundo cultura exigirá 96 dicaspara a transferência de oito placas de 12 poços de alimentação.
10. Loja placas semeadas na posição vertical na noite escura para que as bactérias podem absorver no agar.

5. Gerando L1 Preso C. elegans Larvas

Resumo: larvas L1-presos são usados ​​para iniciar culturas vermes sincronizados nas placas de alimentação de dsRNA. Estas larvas são gerados pelo branqueamento populações de adultos grávidos isolar ovos saudáveis ​​e, em seguida, permitindo que os ovos para chocar em meio S-completa sem alimentos. Na falta de alimentação das larvas L1 eclodidos irá prender o desenvolvimento, a geração de uma população de larvas L1 síncrono. Durante a tela, prepare larvas prendeu-L1 fresco toda semana como estes animais esfomeados ficam doentes ao longo do tempo e deve ser descartado. A escolha da base genética dos animais utilizados em uma tensão de alimentação dsRNA pode variar dependendo da aplicação, para telas neuronais eri-1; mutantes lin-15B são recomendados.

1. Escolha 10-20 L4 larvae seis pratos separados NGM contendo um gramado de OP50 bactérias e esperar 6-7 dias até que as placas contém muitos ovos recém-colocadas e adultos grávidas.
2. Retirar os animais e ovos das placas por adição de 3 ml de água para a superfície de cada chapa e usar um dedo de luva para desalojar os ovos, bactérias e animais a partir da superfície de cada placa para a água. Certifique-se de cobrir todas as áreas da placa, com especial atenção para o gramado bacteriana. Remover a água, bactérias, vermes e ovos de cada placa utilizando uma pipeta de vidro e transferir para um tubo de 50 ml estéril cónica.
3. Adicionar mais 3 ml de água para a superfície de cada placa, pipetando para cima e para baixo ao longo da superfície para remover todas as restantes bactérias, vermes e ovos. Adicionar este volume para o tubo cônico de 50 ml.
4. Girar o tubo cónico a 1.500 rpm durante 1 minuto numa centrífuga de topo de mesa. Vermes e ovos devem sedimentar para o fundo do tubo e as bactérias devem permanecer suspensas. Aspirar cuidadosamente todos, mas 4 mlde o líquido a partir do tubo tendo a certeza de evitar os vermes peletizadas e ovos.
5. Ressuspender o sedimento de vírus em água residual e transferir para um tubo de 15 ml estéril, cónico com uma pipeta de vidro. Levar o volume até 10 ml com água estéril.
6. Gire a 1.500 rpm por 1 min como antes. Aspirar o sobrenadante deixando 200 mL de água, de modo a não perturbar o sedimento verme / ovo.
7. Adicionar 10 ml de água para o cônico para lavar os vermes e ovos e girar como antes para remover bactérias adicionais.

Nota: Nos pontos 5,8-5,11 vermes e ovos são expostos a uma solução de água sanitária. Bleach vai destruir vermes e deixar os ovos relativamente ileso. No entanto, se os ovos são deixados na solução de lixívia muito tempo, eles irão também ser destruído. Definir um temporizador quando alvejante é adicionado no passo 5.8 para ter certeza de que os ovos não permanecem expostos a água sanitária por mais de 10 min.

8. Remova todos, mas 200 mL do sobrenadante, novamente evitando a pelota, em seguida, adicione 10ml de solução de água sanitária e iniciar um temporizador.
9. Incubar vermes e ovos em solução de água sanitária por 3-4 min, ocasionalmente mistura por inversão. Em seguida girar a 1.500 rpm durante 45 segundos em uma centrífuga de mesa. Olhar para um sedimento no fundo do tubo, que deve ser menor e mais compacta do que a pastilha original e pode assumir uma aparência amarela.
10. Aspirar a solução de lixívia deixando 200 ul trás de modo a não perturbar o sedimento.
11. Adicione mais solução de água sanitária fresco 10 ml e inverter como antes. Quando o cronômetro lê 10 min, girar novamente e aspirar a solução de água sanitária, deixando 200 mL para trás e rapidamente adicionar 10 ml de água estéril. Examinar a solução sob um microscópio de dissecação. As larvas e muitos dos adultos que se dissolveram na solução de lixívia, deixando para trás na maior parte dos ovos.
12. Girar antes como durante 45 segundos, e de novo aspirar o sobrenadante, de modo a não perturbar o sedimento. Este pellet deve conter principalmente ovos e vai ser muito solto.
13. Adicionar anotela 10 ml de água, inverter para misturar, rotação e aspirado deixando um pouco de água para trás. É importante remover a solução de lixívia, tanto quanto possível.
14. Adicionar 4 ml de S-completas de comunicação para o tubo cónico, ressuspender os ovos e transferir para um balão de Erlenmeyer de 100 ml estéril. Colocar o balão numa incubadora a 20 ° C em um conjunto de agitador de movimento rápido o suficiente para fazer com que o conteúdo do balão a rodar. Isto irá proporcionar arejamento suficiente para suportar as larvas L1 quando chocam. Dentro de 15 horas todos os ovos devem ter eclodido produzindo uma população sincronizada de larvas L1 preso.

Larvas L1 Preso deve ser feita a cada semana durante uma tela. Uma vez que o primeiro lote tenha sido feito, os lotes subsequentes pode ser iniciado por adição de 500 larvas preso L1 (a partir do lote da semana anterior) para cada um dos quatro padrões, semeadas placas de 6 cm (contendo 100 ul de cultura durante a noite de OP50), e incubou-se a 20 ° C durante 4 dias. No quarto dia, as placas devem contermuitos ovos e adultos grávidas e pode ser branqueada para preparar ovos frescos para as larvas L1 mais sincronizados.

6. Transferindo Preso L1 larvas em placas de alimentação

Resumo: Para executar uma tela de dsRNA, 20-30 larvas L1 presos são transferidos para placas de alimentação de dsRNA. Efeitos precoces knockdown como parada larval ou letalidade será observado após animais alimentados com bactérias dsRNA expressando por 2-3 dias. Dependendo da tela conduzida, fenotipos desejados pode ser observada tanto nos animais originais colocadas sobre a placa de alimentação (animais P0) ou na sua descendência (animais F1). A apresentação do fenótipo irá depender de um número de variáveis, incluindo o perdurance da proteína codificada pelo gene cuja expressão é derrubado e o tempo durante o desenvolvimento, em que é exigido o gene de interesse. Começando culturas alimentares dsRNA com apenas 20-30 animais devem permitir a observação de ambos P0 e F1 fenótipos antes de umanimais produtores esgotar a fonte de alimento.

Para transferir facilmente 20-30 animais para placas de alimentação, primeiro determinar a concentração de L1 preso animais na cultura L1 preso.

1. Misture o Erlenmeyer contendo as larvas L1 preso para distribuir os animais.
2. Retire uma alíquota de 10 mL e local gota a gota para uma chapa unseeded NGM 6 cm de 4-5 cai no centro da placa certificando-se de que todas as mídias é expulso da pipeta.
3. Usando a extremidade da ponta da pipeta espalhar os pontos de suspensão verme para formar uma única linha contínua de líquido que atravessa o diâmetro da placa.
4. Usando um microscópio de dissecação, a contagem de todos os animais a partir de uma extremidade da linha de líquido e continuando para a outra extremidade antes de o líquido absorvido pela placa e os animais dispersar. Isto pode exigir a reorientação constante do escopo dissecar para ter certeza de que nenhum animal são perdidas.
5. Repita isso por três separados 10 mlalíquotas e calcular a média dos três números para determinar o número médio de vermes por mL de suspensão verme e registrar este número diretamente no Erlenmeyer.

7. Comece a tela Feeding

Resumo: Para iniciar a tela de dsRNA, 20-30 larvas L1 presa são adicionados a cada poço de placas de 12 poços de alimentação contendo uma relva fina de bactérias que expressam ARNcd. Placas de alimentação conter padrão meios de crescimento de nemátodos (NGM) e suplementadas com 500 ug / ml de carbenicilina (para evitar a perda de plasmídeo) e IPTG 1 mM (para induzir a expressão do dsRNA). Os animais são deixados a desenvolver e alimentar durante vários dias a 20 ° C. Dois regimes típicos de alimentação para os animais são três dias ao executar uma tela P0 e 6-7 dias ao executar uma tela F1. A duração da alimentação, no entanto, podem ser variadas, dependendo das características fenotípicas específicas pretendidas no ecrã.

1. Use a suspensão de larvas L1 preso e água estéril para preparar um modolução contendo 2.000 worms / ml. Cada placa de alimentação 12, bem exigirá 120 ul desta suspensão de vírus. Misturar cuidadosamente para garantir uma distribuição uniforme dos animais e transferir os animais para um reservatório esterilizado por pipetagem.
2. Utilizando a pipeta multicanal configurado com pontas em cada terceira posição (ver Figura 1) transferência de 10 mL da solução verme directamente sobre a camada de bactérias das placas de alimentação. Tome cuidado para não perfurar a superfície do ágar, como vermes vão enterrar-se no agar e não se alimentam de bactérias expressando dsRNA.
3. Remix A solução verme no reservatório (delicadamente chapinha ele sobre) a cada duas fileiras de placas de alimentação, como worms resolver rapidamente. Continue dispensando a suspensão verme até que todas as placas de alimentação têm vermes. Examine alguns poços no início sob o escopo de dissecação para garantir que cada poço está ficando 20-30 worms.
4. Armazene as placas verticais em uma caixa em um umidificado 20 ° C incubadora. No dia seguinte, após o worm suspensão foi absorvido pela placa, inverter as placas e retornar para o humidificador a 20 ° C. Animais nestas placas pode ser observado após 3 dias (para os fenótipos P0) e, novamente, após 6 dias (para os fenótipos F1).

Atenção: As bactérias que permanecem na placa de alimentação, após 7 dias de crescimento sem fim têm sido testados para a perda do plasmídeo e quase 100% retido no plasmídeo dsRNA.

Resultados

P0 fenótipos knockdown vão começar a aparecer depois de 2-3 dias de alimentação de animais expressando dsRNA bactérias. Alguns fenótipos precoces incluem prisão de larvas e letalidade e deve ser observado em 2-3% de todas as cavidades de alimentação. Estes mesmos fenótipos irá também ser observada em animais de geração F1. A presença de ovos de F1 que não para chocar é outro fenótipo F1 comum e, juntos, esses três fenótipos será observado em cerca de 10% de todos os poços em telas de F1.

Uti...

Discussão

Nós descrevemos um protocolo que utiliza uma biblioteca de alimentação dsRNA comercialmente disponível para realizar telas de grande escala em C. elegans. Nós fornecemos todas as instruções para duplicar a biblioteca e para usá-lo de forma eficaz. Nós demonstramos que este método é capaz de identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos em diferentes tecidos do animal. Enquanto os fenótipos aqui descritos são facilmente observáveis ​​(Unc, Egl, e dpy), este protocolo pode ser adaptada para proc...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
96-well Falcon placa de fundo plano Fisher	Scientific	353072	estéril
	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml de profundidade 96-well polipropileno Masterblock	USA Scientific	5678-0285	tampas autoclaváveis
para placas de poços profundos	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	embalado individualmente
Placas	autoclaváveis
12 poços	Scientific	CC7682-7512	embalada individualmente
	OpenBiosystems	RCE1181	loja -80 ° C
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetraciclina	Fisher Scientific	BP912-100
A carbenicilina			permite 2-4 semanas para entrega www.biochemicaldirect.com
Ágar bacteriolgical Grau ultrapuro A	Affymetrix	10906	para placas de verme<
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
B– Replicador de 96 pinos Kel	Fisher Scientific	05-450-9
microshaker	Thomas Scientific	1231A93
Pipeta multicanal de 12 canais orbit de 3 mm (0.5-10 μ l)	USA Scientific	7112-0510
pipeta multicanal de 12 canais (30-300 μ l)	Repetidor científico dos EUA	7112-3300
mais pipetador manual	EUA Scientific	4026-0201