Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.
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Artigo de método
Em larga escala Knockdown Gene em
Neste artigo
Resumo
Resumo
RNA de interferência, alimentando vermes bactérias expressando dsRNAs tem sido uma ferramenta útil para avaliar a função do gene em C. elegans. Embora esta estratégia funciona bem quando um pequeno número de genes são direcionados para knockdown, telas de alimentação de grande porte mostram eficiência knockdown variáveis, o que limita sua utilidade. Temos Desconstruído protocolos knockdown RNAi publicados anteriormente e descobriram que a fonte primária do knockdown reduzida pode ser atribuída à perda de plasmídeos que codificam dsRNA das bactérias alimentadas aos animais. Com base nessas observações, temos desenvolvido um protocolo de alimentação dsRNA que reduz muito ou elimina a perda de plasmídeo para alcançar eficiente e de alta taxa de transferência knockdown. Demonstramos que este protocolo irá produzir robusto, batida reprodutível para baixo de C. elegans genes em vários tipos de tecidos, inclusive neurônios, e permitirá knockdown eficiente em telas de grande porte. Esse protocolo utiliza uma alimentação de dsRNA disponível comercialmentebiblioteca e descreve todos os passos necessários para duplicar a biblioteca e executar telas dsRNA. O protocolo não requer a utilização de equipamentos sofisticados, e, portanto, pode ser realizada por qualquer C. elegans laboratório.
Introdução
Historicamente, telas genéticas em C. elegans foram realizados pelo tratamento dos animais com um agente mutagénico químico tal como metanossulfonato de etilo para criar mutações aleatórias no DNA. Descendência ou seus netos de animais mutagenizadas são então isolados que exibem um fenótipo anormal desejado. A mutação responsável por causar o fenótipo é, então, identificado através de um procedimento de mapeamento de trabalho intensivo ou por sequenciar todo o genoma do verme mutante. Há muitas vantagens para a realização de tais telas mutagênese química como eles criam lesões permanentes dentro do genoma verme que pode resultar em ambos os fenótipos ganho d....
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Protocolo
Nota: Este protocolo pode ser utilizado para identificar os genes necessários para uma variedade de processos biológicos, em uma variedade de tipos de tecidos. Como um controlo de qualidade necessários durante a tela, os animais são alimentados tanto positivas como negativas bactérias expressando dsRNA de controlo para demonstrar os efeitos de RNAi no tecido alvo.
Outros protocolos de alimentação publicados crescer as bactérias que expressam ARNcd na presença de qualquer um de 50 ug / ml de ampicilina ou 25 ug / ml de carbenicilina 8-10. Descobrimos que as bactérias cultivadas em qualquer uma dessas condições perder o ....
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Resultados
P0 fenótipos knockdown vão começar a aparecer depois de 2-3 dias de alimentação de animais expressando dsRNA bactérias. Alguns fenótipos precoces incluem prisão de larvas e letalidade e deve ser observado em 2-3% de todas as cavidades de alimentação. Estes mesmos fenótipos irá também ser observada em animais de geração F1. A presença de ovos de F1 que não para chocar é outro fenótipo F1 comum e, juntos, esses três fenótipos será observado em cerca de 10% de todos os poços em telas de F1.
Uti.......
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Discussão
Nós descrevemos um protocolo que utiliza uma biblioteca de alimentação dsRNA comercialmente disponível para realizar telas de grande escala em C. elegans. Nós fornecemos todas as instruções para duplicar a biblioteca e para usá-lo de forma eficaz. Nós demonstramos que este método é capaz de identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos em diferentes tecidos do animal. Enquanto os fenótipos aqui descritos são facilmente observáveis (Unc, Egl, e dpy), este protocolo pode ser adaptada para proc.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por fundos dos Institutos Nacionais de Saúde MH097163. Algumas cepas foram fornecidos pelo CGC, que é financiado pelo Escritório de Investigação NIH Programas de Infra-estrutura (P40-OD010440).
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Materiais
Equipment
folha adesiva reservatório de USA biblioteca de alimentação de dsRNA td colspan="4"> autoclavável
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagent/Material | |||
| 96-well Falcon placa de fundo plano Fisher | Scientific | 353072 | estéril |
| USA Scientific | 2923-0100 | ||
| Nunc omniplate | Fisher Scientific | 267060 | |
| 2.0 ml de profundidade 96-well polipropileno Masterblock | USA Scientific | 5678-0285 | tampas autoclaváveis |
| para placas de poços profundos | USA Scientific | 5665-6101 | |
| 50 ml combitips | USA Scientific | 4796-5000 | embalado individualmente |
| Placas | autoclaváveis | ||
| 12 poços | Scientific | CC7682-7512 | embalada individualmente |
| OpenBiosystems | RCE1181 | loja -80 ° C | |
| Ampicilina | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Tetraciclina | Fisher Scientific | BP912-100 | |
| A carbenicilina | permite 2-4 semanas para entrega www.biochemicaldirect.com | ||
| Ágar bacteriolgical Grau ultrapuro A | Affymetrix | 10906 | para placas de verme< |
| Brayer roller | USA Scientific | 9127-2940 | |
| B– Replicador de 96 pinos Kel | Fisher Scientific | 05-450-9 | |
| microshaker | Thomas Scientific | 1231A93 | |
| Pipeta multicanal de 12 canais orbit de 3 mm (0.5-10 μ l) | USA Scientific | 7112-0510 | |
| pipeta multicanal de 12 canais (30-300 μ l) | Repetidor científico dos EUA | 7112-3300 | |
| mais pipetador manual | EUA Scientific | 4026-0201 | |
Referências
- Mello, C. C., Conte, D. Jr Revealing the world of RNA interference. Nature. 431 (7006), 338-342 (2004).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Tabar....
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Reimpressões e permissões
