Em larga escala Knockdown Gene em C. elegans Usando bibliotecas de alimentação dsRNA para gerar fenótipos robustos perda de função

Summary

Enquanto dsRNA alimentação em C. elegans é uma ferramenta poderosa para avaliar a função do gene, os protocolos atuais para telas de alimentação em grande escala resultar em eficiências knockdown variáveis. Descreve-se um protocolo melhorado para a realização em grande escala de RNAi telas de alimentação, que resulta em knockdown altamente eficaz e reprodutível de expressão do gene.

Abstract

RNA de interferência, alimentando vermes bactérias expressando dsRNAs tem sido uma ferramenta útil para avaliar a função do gene em C. elegans. Embora esta estratégia funciona bem quando um pequeno número de genes são direcionados para knockdown, telas de alimentação de grande porte mostram eficiência knockdown variáveis, o que limita sua utilidade. Temos Desconstruído protocolos knockdown RNAi publicados anteriormente e descobriram que a fonte primária do knockdown reduzida pode ser atribuída à perda de plasmídeos que codificam dsRNA das bactérias alimentadas aos animais. Com base nessas observações, temos desenvolvido um protocolo de alimentação dsRNA que reduz muito ou elimina a perda de plasmídeo para alcançar eficiente e de alta taxa de transferência knockdown. Demonstramos que este protocolo irá produzir robusto, batida reprodutível para baixo de C. elegans genes em vários tipos de tecidos, inclusive neurônios, e permitirá knockdown eficiente em telas de grande porte. Esse protocolo utiliza uma alimentação de dsRNA disponível comercialmentebiblioteca e descreve todos os passos necessários para duplicar a biblioteca e executar telas dsRNA. O protocolo não requer a utilização de equipamentos sofisticados, e, portanto, pode ser realizada por qualquer C. elegans laboratório.

Introduction

Historicamente, telas genéticas em C. elegans foram realizados pelo tratamento dos animais com um agente mutagénico químico tal como metanossulfonato de etilo para criar mutações aleatórias no DNA. Descendência ou seus netos de animais mutagenizadas são então isolados que exibem um fenótipo anormal desejado. A mutação responsável por causar o fenótipo é, então, identificado através de um procedimento de mapeamento de trabalho intensivo ou por sequenciar todo o genoma do verme mutante. Há muitas vantagens para a realização de tais telas mutagênese química como eles criam lesões permanentes dentro do genoma verme que pode resultar em ambos os fenótipos ganho d....

Protocol

Nota: Este protocolo pode ser utilizado para identificar os genes necessários para uma variedade de processos biológicos, em uma variedade de tipos de tecidos. Como um controlo de qualidade necessários durante a tela, os animais são alimentados tanto positivas como negativas bactérias expressando dsRNA de controlo para demonstrar os efeitos de RNAi no tecido alvo.

Outros protocolos de alimentação publicados crescer as bactérias que expressam ARNcd na presença de qualquer um de 50 ug / ml de ampicilina ou 25 ug / ml de carbenicilina ^8-10. Descobrimos que as bactérias cultivadas em qualquer uma dessas condições perder o ....

Results

P0 fenótipos knockdown vão começar a aparecer depois de 2-3 dias de alimentação de animais expressando dsRNA bactérias. Alguns fenótipos precoces incluem prisão de larvas e letalidade e deve ser observado em 2-3% de todas as cavidades de alimentação. Estes mesmos fenótipos irá também ser observada em animais de geração F1. A presença de ovos de F1 que não para chocar é outro fenótipo F1 comum e, juntos, esses três fenótipos será observado em cerca de 10% de todos os poços em telas de F1.

Uti.......

Discussion

Nós descrevemos um protocolo que utiliza uma biblioteca de alimentação dsRNA comercialmente disponível para realizar telas de grande escala em C. elegans. Nós fornecemos todas as instruções para duplicar a biblioteca e para usá-lo de forma eficaz. Nós demonstramos que este método é capaz de identificar genes envolvidos em diferentes processos biológicos em diferentes tecidos do animal. Enquanto os fenótipos aqui descritos são facilmente observáveis ​​(Unc, Egl, e dpy), este protocolo pode ser adaptada para proc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
96-well Falcon placa de fundo plano Fisher	Scientific	353072	estéril
	USA Scientific	2923-0100
Nunc omniplate	Fisher Scientific	267060
2.0 ml de profundidade 96-well polipropileno Masterblock	USA Scientific	5678-0285	tampas autoclaváveis
para placas de poços profundos	USA Scientific	5665-6101
50 ml combitips	USA Scientific	4796-5000	embalado individualmente
Placas	autoclaváveis
12 poços	Scientific	CC7682-7512	embalada individualmente
	OpenBiosystems	RCE1181	loja -80 ° C
Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760-5
Tetraciclina	Fisher Scientific	BP912-100
A carbenicilina			permite 2-4 semanas para entrega www.biochemicaldirect.com
Ágar bacteriolgical Grau ultrapuro A	Affymetrix	10906	para placas de verme<
Brayer roller	USA Scientific	9127-2940
B– Replicador de 96 pinos Kel	Fisher Scientific	05-450-9
microshaker	Thomas Scientific	1231A93
Pipeta multicanal de 12 canais orbit de 3 mm (0.5-10 μ l)	USA Scientific	7112-0510
pipeta multicanal de 12 canais (30-300 μ l)	Repetidor científico dos EUA	7112-3300
mais pipetador manual	EUA Scientific	4026-0201