Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Resumo

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Resumo

A medula espinhal peixe-zebra é um modelo de investigação eficaz para investigação do sistema nervoso por várias razões. Primeiro, genética, transgénicos e de genes abordagens de knockdown pode ser utilizado para examinar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Em segundo lugar, as grandes garras de embriões developmentally sincronizados fornecem grandes amostras experimentais. Em terceiro lugar, a claridade óptica do embrião zebrafish permite aos pesquisadores visualizar progenitor, glial, e as populações neuronais. Apesar de embriões de peixe-zebra são transparentes, espessura da amostra pode impedir a visualização microscópica eficaz. Uma razão para isso é o desenvolvimento conjunto do tecido da medula espinal e somito sobrejacente. Outra razão é a grande bola de gema, que ainda está presente durante os períodos de neurogênese cedo. Neste artigo, demonstramos microdissecção e remoção da gema em embriões fixos, que permite a visualização microscópica do tecido circundante, preservando somito. Nós also demonstrar montagem semipermanente de embriões de peixe-zebra. Isto permite a observação de neurodesenvolvimento nos eixos dorso-ventral e ântero-posterior, uma vez que preserva a tridimensionalidade do tecido.

Introdução

A visualização da medula espinal no peixe-zebra é inibida por um número de factores. Devido à espessura de somitos sobrepostas e o local interno da medula espinal, a uma distância consideravelmente longo trabalho é necessário para alta resolução celular. A bola gema (que ainda está presente durante os primeiros estágios de neurogênese) aumenta ainda mais a distância de trabalho necessário, e é facilmente danificado pela pressão de uma lamela. Além disso, os restos de gema danificada proíbe clara visualização do tecido. Embora sejam possíveis cortes transversais no eixo dorso-ventral (DV), eles não são facilmente permitir a visualização simultânea no ântero-posterior (AP) Eixo ^1.

Para superar esses obstáculos, os embriões são dissecados e montados em lâminas. Este procedimento proporciona vários benefícios. Primeiro, os embriões de peixe-zebra prontamente se deitar com a lateral voltada para cima, o que facilita a visualização do eixo AP. Em segundo lugar, a remoção da gema ball diminui a distância de trabalho necessário, e limita detritos. Em terceiro lugar, este processo de montagem permite tanto fluorescente e a microscopia de campo claro. Em quarto lugar, os embriões montados são estáveis ​​durante meses a 4 ° C, permitindo a visualização exemplar prolongada. Finalmente, a progressão do desenvolvimento ocorre em que segmentos anteriores são mais maduros do que os segmentos posteriores. A fim de assegurar que encenadas hemisegments espinhais combinados são comparados entre os embriões, que recobre tecido somito é utilizado como um guia. Por exemplo, a décima somito mais posterior sobrepõe hemisegmento espinal décimo, o que é equivalente desenvolvente em embriões combinado da fase. Este procedimento de montagem de embriões intactos permite uma fácil identificação de somitos.

Usamos genética e genes tecnologias knock-down para estudar os mecanismos de orientação do axônio na medula espinhal em desenvolvimento. Em particular, nós determinamos que robo2, robo3, e DCC são necessários para comissural primária Ascending (COPA) pathfinding axônio. Usando o procedimento de montagem descrito aqui, fomos capazes de examinar o crescimento ventral, cruzamento da linha média, a largura da comissura, dorsal e ^2,3 crescimento anterior. Este processo de montagem pode também ser aplicado para DV ou AP padronização da medula espinhal. Temos utilizado este procedimento para determinar os papéis díspares de efetores Wnt a jusante padronização DV da medula espinhal. Usando esta montagem, fomos capazes de obter resolução de marcadores DV no nível da célula única, e determinar mudanças padronização minutos como resultado da alteração da recepção do sinal Wnt ^4,5. Este procedimento também permite a montagem para o cálculo do índice mitótico através de anti-phosphohistone 3 ou rotulagem BrdU (proliferação progenitor) diferenciação ^5.

Protocolo

1. Montagem Embriões (após a conclusão da técnica de visualização selecionado, como imunocitoquímica, hibridização in situ, etc)

1. Coloque embriões num prato 35 milímetros de Petri cheia com tampão de escolha (Figura 1A). A escolha do tampão baseia-se no procedimento de marcação. Tipicamente, tampões à base de PBS, são adequados.
2. Sob um microscópio de dissecação, e usando uma pinça, fixar a cabeça com um par de pinças, enquanto puxa a gema de distância com o outro par (Figura 1B). Como alternativa, use um pino de inseto em um suporte inseto pin para puxar suavemente a gema.
3. Usando o póquer embrião (linha de pesca (0,41 mm de diâmetro) ou colado a um tubo capilar ou uma pipeta de Pasteur) mover os embriões de uma parte da placa de Petri que não tem uma grande quantidade de detritos gema (Figuras 1C-D).
4. Com uma pipeta Pasteur de vidro, aspirar os embriões em tão pouco líquido possível, e gSuavemente pipeta-los sobre uma lâmina (Figura 1E).
5. Gentilmente pavio fora o excesso de líquido usando um laboratório wipe. Evitar o contacto com os embriões.
6. Adicione uma gota de meio de montagem de embriões. No caso de etiquetas fluorescentes, usar um reagente Antifade de escolha. Para sinais colorimétricos, glicerol a 70% pode ser usado como um meio de montagem.
7. Usando o pôquer embrião, orientar os embriões em seus lados em linhas (Figura 1F).
8. Adicione uma "bagatela" de vaselina ou graxa de vácuo elevado para cada canto de uma lamela (Figura 1G). Isso evita danos de embrião de compressão excessiva.
9. Coloque lamela (lado vaselina para baixo) em cima de embriões (Figura 1H).
10. Bata suavemente na lamela em cada canto até o meio de montagem (70% de glicerol ou reagente de montagem anti-fade) está tocando a lamela (Figura 1H).
11. Se necessário, adicione mais mídia montagem pipetando ao lado do coverslip, usando uma pipeta, no intervalo de 20-200 ml. Ele vai pavio para baixo.
12. Usando um laboratório de limpar, completamente limpa ao redor da lamela. Esteja certo de não aplicar pressão sobre a lamela, pois isso irá danificar embriões. Essa área deve ser seco e não tem vaselina ou meios de montagem do mesmo.
13. Use unha polonês para selar em torno da borda da lamela (Figura 1I).

Resultados

Quando elucidar os mecanismos subjacentes a vários eventos de desenvolvimento, tais como padrões celular, diferenciação, e a orientação do axónio, é importante ser capaz de visualizar as células dentro do contexto do seu tecido. Defeitos padronização dorsoventral tipicamente apresentam-se como uma mudança ventral ou dorsal no domínio de fatores de transcrição expressão na pax, NKX ou famílias dbx ^4. Às vezes, as mudanças podem ser sutis, compreendendo apenas alguns diâmetros celulares ^4. Estudo transversal permite que este tipo de análise. No entanto, os reagentes com sinais mais fracos, ou secções transversais que não são perpendiculares ao eixo do AP pode limitar interpretação. Além disso, a análise transversal não facilmente levar em conta se as mudanças persistem no eixo AP, e baseia-se na disponibilidade de um criostato. Essa limitação é contornada por visualizações laterais da medula espinhal. Como pode ser visto na Figura 2B, nkx6.1 ARNm é distributed em aproximadamente a metade ventral da medula espinhal às 24 horas pós-fecundação (hpf), dentro do domínio progenitor. As células progenitoras são distinguíveis das células pós-mitóticas, devido à presença da placa de piso, que se encontra na parte mediana da medula espinal. Visualizado com DIC óptica, as células individuais são claramente distinguíveis, e um limite definido entre expressar e nonexpressing células é evidente.

Saída do ciclo de células progenitoras é acompanhada por alterações na expressão de genes. Por exemplo, todos os neurônios pós-mitóticas expressar HuC / D que é detectável com imunocitoquímica ^1,5. sondas de mRNA para ilhota, gata, e as famílias VSX rotular neurônios pós-mitóticas específicas de posição consistente e número dentro de cada hemisegmento medula espinhal ^6. Além disso, os receptores de orientação do axónio, tais como aqueles na família robo são expressos em populações restritas de neurónios pós-mitóticos (Figura 2C) ^{2,7,8. Montagem lateral de embriões permite contagens precisas de neurônios pós-mitóticas. Do mesmo modo, células progenitoras, que continuam a dividir pode ser quantificada com anti-fosfo-histona 3 imunocitoquímica, bem como a rotulagem BrdU. Além disso, a morte celular pode ser avaliada com TUNEL rotulagem 4-6.}

Aos 24 hpf, os axônios dos neurônios pós-mitóticas seguintes podem ser visualizados com vários métodos, e são distinguíveis no nível da célula única: Dorsal Lateral Ascendente (Dola), comissural primária Ascendente (COPA), comissural Secundária Ascendente (CoSA), Ventral Longitudinal Decrescente (estepe), Kolmer-Agdur (KA), bifurcando comissural / longitudinais (COB / L), circunferencial Crescente (CIA), circunferencial Descendente (CID), e Unipolar comissural Descendente (UCoD), Rohon-Barba (RB), neurônios motores ( M) ^9. Os axônios estendem-se desde esses neurônios no dorsal, ventral, anterior e posterior direções. Eles ramo, cruzar a linha média, e sair tanto o dorsale medula espinal ventral. Quando combinado com microscopia confocal a laser, estes comportamentos celulares variadas são evidentes em embriões lateralmente montados, utilizando imunocitoquímica e proteínas fluorescentes geneticamente codificados como GFP ^2. Na Figura 2D, ZNP-1 imunocitoquímica foi usado para rotular motoneurons desenvolvimento. Os motoneurónios sair da espinal medula ventral a inervam a musculatura desenvolver circundante.

Figura 1. Dissecção e laterais montagem de embriões de peixe-zebra. (A) Após o processamento para imunofluorescência, hibridização in situ, etc, os embriões são colocados em um prato de 35 milímetros Petri cheia de PBT (PBS com 0,5% de Triton X-100) ou PTW (PBS com 0,1% de Tween-20). A gemabola (YB) é evidente. (B) A gema é removido por fixar a cabeça do embrião seguido de dissecção cuidadosa. (C) Um embrião de póquer (linha de pesca colada a uma pipeta de Pasteur) é usada para separar os embriões e os restos da gema (D). Embriões limpos são pipetadas para uma lâmina de microscópio, (E) e alinhados (F). Gelatina (G) de petróleo é aplicada aos cantos da lamela. (H) A lamela é colocada delicadamente em cima dos embriões em meio de montagem. (I) Nail polonês é usado para selar as bordas da lamela. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

< strong> Figura 2. Análise dos padrões de expressão gênica e axônio pathfinding em (A) Desenho de um embrião de peixe-zebra em 24 hpf lateralmente montado embriões de peixe-zebra.. Em BD, aproximadamente quatro hemisegments acima da extensão saco vitelino são visualizados (área de box). (B) nkx6.1 é expresso na medula espinal ventral, incluindo a placa de piso (FP). (C) robo3 é expresso em neurónios pós-mitóticos (PMN). A zona de placa de piso e progenitor não é evidente neste plano focal mais lateral. Em B, C, a espinal medula é delimitado por um suporte, no lado esquerdo da imagem. (D) confocal microscopia foi utilizado para a imagem ZNP-1 de imunofluorescência, que rotula axónios motores que saem da medula espinal ventral. Em todas as imagens, é anterior à esquerda e dorsal é para cima. A 40X distância de trabalho longa, imersão em água (NA 0,8) lente foi usada (3,3 mm).oad/50703/50703fig2highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.

Discussão

Montagem lateral de embriões Zebrafish auxiliares de visualização fixa de desenvolvimento da medula espinhal. Através da remoção da gema de bola, a distância de trabalho necessária para a imagem microscópica excepcional é reduzida. Os resultados representativos foram limitados à fase 24 hpf, no entanto, esta técnica pode ser usado tão cedo quanto 18 hpf, embora embriões precoces são mais difíceis de dissecar devido ao tamanho do embrião e a fragilidade do tecido. Esta técnica é também aplicável aos embriões mais velhos do que 24 hpf. Ajudado pela claridade óptica do peixe-zebra embrionário, a capacidade de executar telas genéticos para a frente, a genética reversa e abordagens transgênicas, vários processos de desenvolvimento podem ser investigadas. Isto inclui os índices de mitose de células progenitoras neuronais com marcadores como BrdU e anti-fosfo-histona ^04-06 março e padronização através da expressão de marcadores progenitoras neuronais e gliais do pax, NKX, dbx, e oligo families ^1,4-6. Reagentes que relatam determinação glial e neuronal (tal como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e HuC / D) ^1,4,5,10 pode ser usado. Subtipo diferenciação neuronal pode ser analisado através da expressão da ilhota, VSX, engrailed e genes gata ^1,4-6. E, finalmente, a análise de orientação axónio é possível por meio de anticorpos, tais como anti-tubulina acetilada, 3A10, e ZNP-1 ^2,11,12. Embora outros sistemas modelo de vertebrados (mouse e galinha) são usados ​​para estudar o desenvolvimento da medula espinhal, apenas o peixe-zebra permite a visualização simultânea de todos os eixos de desenvolvimento do embrião intacto.

A limitação óbvia para esta abordagem é que os embriões são fixas, que se opõe a uma imagem ao vivo. De facto, a remoção do (ou dano para) os resultados de gema de morte embrionária rápida, pelo que não é possível reduzir a distância de trabalho em embriões vivos utilizando esta técnica. No entanto, a alta ampliação co espinhalrd imagem em embriões vivos é possível. A fim de preservar a gema durante a imagem ao vivo, os embriões podem ser colocados em lâminas de depressão, que proporcionam um espaço maior entre a amostra e a lamela. Alternativamente, vários 22 milímetros x 22 milímetros lamelas podem ser colados ou deslizamento de um 3 em x 1 em lâminas microscópicas. As lamelas servir como uma "ponte" para a lamela sobrejacente. Se os embriões são mais velhos do que 18 hpf, tricaina é usada para anestesiar os embriões para evitar o movimento. Enquanto uma distância de trabalho de 0,288 milímetros é necessário para embriões deyolked em 24 hpf, quando se trabalha com embriões vivos incorporados em agarose, com gema intacta, uma lente microscópica com uma distância de trabalho de 3,3 mm é suficiente. Alternativamente, culturas de explantes derivados de embriões deyolked pode ser visualizada utilizando uma técnica de imobilização de coágulo de plasma ^13. Várias populações de células podem ser observados através da utilização de proteínas fluorescentes codificados geneticamente, tais como a GFP, mCherry, ou o photoconcorante convertíveis Kaede (para citar alguns). Além disso, as células marcadas com fluorescência dentro embriões quiméricos também pode ser visto com esta abordagem ^14.

A técnica de montagem consistente que é estável durante meses é uma ferramenta fundamental para os biólogos do desenvolvimento e celulares. Esta técnica simples é reprodutível, permitindo uma fácil comparação entre diferentes ensaios experimentais. Além disso, o alinhamento dos embriões em linhas prontamente permitir a identificação de embriões específicos para análise posterior.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri 35 mm x 10 mm	VWR	p>25373-041
Dumont Fórceps #3	Fisher Scientific	NC9839169
Vidro de cobertura	Fisher Scientific	12-541-B22X22-1.5
Slides	Fisher Scientific	12-550-343
SlowFade Gold	Fisher Scientific	S36936
ProLong Gold	Life Technologies	P36934
Vaseum Jelly	qualquer supermercado
Loop Holders	VWR	80094-482
Insect Pins	Fine Science Tools	26002-10
Nickel Plated Pin Holders	Fine Science Tools	26016-12
Olympus Stereomicroscope	Olympus	SZ61