Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

Summary

Nós descrevemos um método analítico para estimar o tempo de vida de glutamato em membranas astrocitários de registros eletrofisiológicos de correntes transportador de glutamato em astrócitos.

Abstract

A maior densidade de transportadores de glutamato no cérebro é encontrada em astrócitos. O glutamato transportadores acoplar o movimento de glutamato através da membrana com o co-transporte de Na ⁺ e 3 1 ^de H ⁺ e a contra-transporte de K ⁺ 1. A corrente estequiométrica gerado pelo processo de transporte pode ser monitorizado com gravações de célula inteira de patch-clamp de astrócitos. O curso de tempo da corrente registada é moldada por o curso de tempo do perfil de concentração de glutamato que astrócitos são expostas, a cinética de transportadores de glutamato, e as propriedades das membranas passivas electrotonic astrocíticos. Aqui, descrevemos os métodos experimentais e analíticos que podem ser utilizados para registar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e isolar o curso de tempo de recarga glutamato de todos os outros factores que moldam a forma de onda das correntes de transportador astrocíticos. Os métodos descritos aqui podem ser usados ​​para estimar o tempo de vida of flash-uncaged e glutamato sinapticamente lançado em membranas astrocitários em qualquer região do sistema nervoso central durante a saúde ea doença.

Introduction

Os astrócitos são um dos tipos de célula mais abundante no cérebro com uma morfologia em forma de estrela e as saliências de membranas finas que se estendem ao longo do neuropil e alcançar vizinha contactos sinápticos ^1,2. Membrana celular dos astrócitos é densamente embalado com moléculas transportador de glutamato ^3. Sob condições fisiológicas, os transportadores de glutamato rapidamente ligar glutamato no lado extracelular da membrana e transferi-lo para o citoplasma da célula. Ao fazer isso, os transportadores mantêm a concentração basal baixa de glutamato no espaço extracelular ^4. Transportadores de glutamato em finas processos a....

Protocol

1. Slice Preparação

1. Prepare uma solução de 500 ml de corte / armazenamento contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 de _CaCl2, 1,3 _MgSO4 · 7H ₂ O, 4 _MgCl2, 26,2 _NaHCO3, 1 NaH ₂ PO _4, e 22 de glucose, 320 mOsm, pH 7,4
2. Usar um copo de 250 ml para preparar uma câmara de imersão para as fatias, encher com 200 ml de solução de cortar / armazenamento, aquecê-lo num banho de água a 34 ° C e borbulhar com 95% _de O2, 5% de CO _2.
3. Manter a solução remanescente que corta / armazenamento numa garrafa de vidro a 4 ° C.
4. Utilização de um adesivo ....

Results

O êxito da abordagem analítica descrita aqui criticamente dependente da obtenção de registos electrofisiolicos de alta qualidade a partir de correntes de transportador astrócitos em qualquer região do sistema nervoso central. Em fatias do hipocampo do rato agudas, os astrócitos podem ser prontamente identificados em Dodt iluminação ou IR-DIC, pois o corpo de célula pequena (Ø = 10 mm) e núcleo proeminente (Figura 1). A sua morfologia distinta em forma de estrela podem ser apreciados com epifluorescência.......

Discussion

Descrevemos aqui uma abordagem experimental para obter registos electrofisiolicos de astrócitos, um protocolo de análise para isolar as correntes do transportador de glutamato em astrócitos e um método matemático para derivar o curso de tempo de depuração a partir das correntes do transportador de glutamato astrocíticos.

O sucesso da análise baseia-se na capacidade de obter alta qualidade gravações de patch clamp de astrócitos e na precisão dos algoritmos de montagem utilizadas para descreve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CGP52432	Tocris	1246
(R,S)-CPP	Tocris	173
DPCPX	Tocris	439
LY341495 sal dissódico	Tocris	4062
MSOP	Tocris	803
NBQX sal dissódico	Tocris	1044
D,L-TBOA	Tocis	1223
Picrotoxina	Sigma	P1675
MNI-L-glutamato	Tocris	1490
Alexa 594	Life Technologies	A10438	Eletrodos de
matriz	Frederick Haer Company	MX21AES(JD3)
Capilares de vidro borossilicato	World Precision Instruments	PG10165-4
Extrator de micropipeta de vidro de duplo estágio	Narishige	PC-10
Loctite 404 adesivo instantâneo	Ted Pella	46551
Lâmpada Xe	Rapp OptoElectronic	FlashMic
Igor Pro 6	Wavemetrics