Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Summary

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Abstract

Crescimento vascular controlada é crítica para a regeneração de tecidos e cicatrização de feridas bem sucedida, bem como para o tratamento de doenças isquémicas, tais como acidente vascular cerebral, ataque cardíaco ou doenças arteriais periféricas. Entrega direta de fatores de crescimento angiogênicos tem o potencial de estimular o crescimento de novos vasos sanguíneos, mas é freqüentemente associada com limitações como a falta de direcionamento e meia-vida curta in vivo. A terapia genética oferece uma abordagem alternativa ao entregar genes que codificam fatores angiogênicos, mas muitas vezes requer o uso de vírus, e é limitada por questões de segurança. Aqui nós descrevemos uma estratégia desenvolvida recentemente para estimular o crescimento vascular por células-tronco de programação para superexpressão fatores angiogênicos in situ utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Especificamente nossa estratégia utilizada células-tronco como veículos de entrega, tirando partido da sua capacidade de migrar para tecidos isquêmicos in vivo. Usando os vetores poliméricos otimizados, derivadas de tecido adiposoAs células estaminais foram modificados para sobre-expressar um gene que codifica angiogénico factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Nós descrevemos os processos para a síntese do polímero, a formação de nanopartículas, transfecção de células estaminais in vitro, bem como métodos para validar a eficácia das células estaminais que expressam VEGF para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Introduction

O objetivo geral desta técnica é promover a angiogênese terapêutica com células-tronco não-viral programados superexpressão fatores terapêuticos no local da isquemia. As células-tronco foram modificadas ex vivo primeiro usando nanopartículas biodegradáveis ​​sintetizados em laboratório, e depois transplantadas em um modelo murino de isquemia dos membros posteriores para validar o seu potencial para aumentar a angiogênese e salvamento tecido.

Crescimento vascular controlada é uma componente importante da regeneração de tecidos bem sucedido, bem como para o tratamento de várias doenças isquémicas, tais como acidente vascular cerebr....

Protocol

1. Síntese de Polímero

1. Em uma coifa, pesar 3.523 mg de Diacrilato butanodiol (C) e transferir para um frasco de cintilação de vidro contendo uma barra de agitação.
2. Pré-aquecimento de 5-amino-1-pentanol (32) a 90 ° C para solubilizar o sal, depois de uma hotte, pesam-se 1.533 mg de 32 e adicionar ao frasco de cintilação contendo C. Este método irá resultar numa razão molar de C: 32 = 1:1,2.
3. Coloque imediatamente o frasco que contém ambas as soluções em uma placa de agitação. Definir velocidade de agitação de 600 rpm.
4. Transferir o frasco de cintilação a uma estufa a 90 ° C. Definir velocidade de agitação a 1.000 rpm durante 4 h.....

Results

Após a mistura em conjunto, o polímero carregado positivamente (C32-122) e com carga negativa de plasmídeo de DNA auto-montagem em nanopartículas. Nanopartículas de formação pode ser confirmada através de análise de electroforese isto é, a complexação entre o C32-122 e o DNA de plasmídeo vai impedir que a mobilização do ADN durante a electroforese. O polímero funciona como um reagente de transfecção melhorada para facilitar a absorção de ADN para dentro das células alvo e a expressão subsequente de proteínas qu.......

Discussion

Aqui nós relatamos um método para programar células-tronco adultas para superexpressão fatores terapêuticos usando não-virais, nanopartículas biodegradáveis. Esta plataforma é particularmente útil para o tratamento de doenças em que as células estaminais pode, naturalmente, de origem, tais como isquemia e cancro. ^9-10 Além disso, a plataforma de entrega de genes não virais permite a sobre-expressão transitória de factores terapêuticos, o que é adequado para a maioria dos tecidos e de regeneração de feridas pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Soro Bovino Fetal	Invitrogen	10082
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15070
Fator Básico de Crescimento de Fibroblastos	Peprotech	100-18B
1,4-Butanodiol Diacrilato (90%)	Sigma Aldrich	411744	Siglato: C
5- amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acrónimo: 32
Tetraetilenoglicoldiamina > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acrónimo: 122
Acetato de Sódio	G-Biosciences	R010
Fosfato Tamponado Salino	Invitrogen	14190-144
Tetra-hiofurano Anidro (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
éter dietílico anidro (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anidro (> 99,9%)	Sigma Aldrich	276855
Gelatina	Sigma Aldrich	G9391
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferina	GoldBio
Temperatura Ótima de Corte (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rato anti-rato CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa IgG Fluor 594 anti-rato	Invitrogen	A11007