Células-tronco de programação para Therapeutic angiogênese Usando nanopartículas poliméricas biodegradáveis

Summary

Descreve-se o método de células-tronco de programação para superexpressão fatores terapêuticos para angiogênese utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Processos descritos incluem a síntese do polímero, a transfecção de células estaminais derivadas de tecido adiposo, in vitro, e para validar a eficácia das células estaminais programadas para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Abstract

Crescimento vascular controlada é crítica para a regeneração de tecidos e cicatrização de feridas bem sucedida, bem como para o tratamento de doenças isquémicas, tais como acidente vascular cerebral, ataque cardíaco ou doenças arteriais periféricas. Entrega direta de fatores de crescimento angiogênicos tem o potencial de estimular o crescimento de novos vasos sanguíneos, mas é freqüentemente associada com limitações como a falta de direcionamento e meia-vida curta in vivo. A terapia genética oferece uma abordagem alternativa ao entregar genes que codificam fatores angiogênicos, mas muitas vezes requer o uso de vírus, e é limitada por questões de segurança. Aqui nós descrevemos uma estratégia desenvolvida recentemente para estimular o crescimento vascular por células-tronco de programação para superexpressão fatores angiogênicos in situ utilizando nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Especificamente nossa estratégia utilizada células-tronco como veículos de entrega, tirando partido da sua capacidade de migrar para tecidos isquêmicos in vivo. Usando os vetores poliméricos otimizados, derivadas de tecido adiposoAs células estaminais foram modificados para sobre-expressar um gene que codifica angiogénico factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Nós descrevemos os processos para a síntese do polímero, a formação de nanopartículas, transfecção de células estaminais in vitro, bem como métodos para validar a eficácia das células estaminais que expressam VEGF para promover a angiogénese num modelo de isquemia dos membros posteriores de murino.

Introduction

O objetivo geral desta técnica é promover a angiogênese terapêutica com células-tronco não-viral programados superexpressão fatores terapêuticos no local da isquemia. As células-tronco foram modificadas ex vivo primeiro usando nanopartículas biodegradáveis ​​sintetizados em laboratório, e depois transplantadas em um modelo murino de isquemia dos membros posteriores para validar o seu potencial para aumentar a angiogênese e salvamento tecido.

Crescimento vascular controlada é uma componente importante da regeneração de tecidos bem sucedido, bem como para o tratamento de várias doenças isquémicas, tais como acidente vascular cerebral, isquemia e enfarte do miocárdio. Várias estratégias têm sido desenvolvidos para promover o crescimento vascular, incluindo a entrega do factor de crescimento e terapia baseada em célula. ^Uma Apesar da eficácia observada em modelos animais da doença, estes métodos ainda enfrentam limitações, tais como a necessidade de doses suprafisiológicas de entrega do factor de crescimento, ou insuficiente parácrinaliberação pelas células isoladamente. Uma estratégia potencial para superar as limitações acima é combinar terapia celular e terapia génica, em que as células estaminais são geneticamente programados ex vivo antes da transplantação para sobre-expressar factores terapêuticos desejáveis. Esta abordagem tem sido demonstrada em vários modelos de doença incluindo isquemia dos membros posteriores ^2, doença cardíaca ^3, cicatrização do osso ⁴ e lesão neural ^5, etc. No entanto, a maioria das técnicas de terapia genética dependem em vectores virais, os quais estão associados a problemas de segurança, tais como a imunogenicidade potencial e mutagénese insercional. Biomateriais mediadas entrega do gene não-viral pode superar essas limitações, mas muitas vezes sofrem de baixa eficiência de transfecção. Para acelerar a descoberta de novos biomateriais para a entrega do gene não-viral eficaz, estudos recentes têm empregue a química combinatória e de alto rendimento abordagem de triagem. Bibliotecas de polímeros biodegradáveis, tais como poli (es-amino βtros) (PBAE) têm sido desenvolvidos e rastreados, o que levou à descoberta de que conduzem polímeros com marcadamente melhorada a eficiência de transfecção em comparação com os homólogos vector poliméricos convencionais. ^6-7

Aqui, nós descrevemos a síntese de PBAE e verificação da sua capacidade de transfectar células estaminais derivadas de tecido adiposo (ADSCs), in vitro, seguida de transplante subsequente de ADSCs geneticamente modificados que sobreexpressam o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) em um modelo murino de isquemia dos membros posteriores . Os resultados foram avaliados através do rastreamento destino celular usando imagem de bioluminescência, avaliando reperfusão tecidual utilizando laser Doppler perfusão de imagem (LDPI), e determinar a angiogênese e tecido de resgate pela histologia.

Protocol

1. Síntese de Polímero

1. Em uma coifa, pesar 3.523 mg de Diacrilato butanodiol (C) e transferir para um frasco de cintilação de vidro contendo uma barra de agitação.
2. Pré-aquecimento de 5-amino-1-pentanol (32) a 90 ° C para solubilizar o sal, depois de uma hotte, pesam-se 1.533 mg de 32 e adicionar ao frasco de cintilação contendo C. Este método irá resultar numa razão molar de C: 32 = 1:1,2.
3. Coloque imediatamente o frasco que contém ambas as soluções em uma placa de agitação. Definir velocidade de agitação de 600 rpm.
4. Transferir o frasco de cintilação a uma estufa a 90 ° C. Definir velocidade de agitação a 1.000 rpm durante 4 h. Se a barra de agitação fica preso, diminua a velocidade. Após 4 h, a velocidade mais baixa para 300 rpm e mantida a 90 ° C durante mais 12-16 horas.
5. Adicionar 5 g de C32 a 10 mL de tetrahidrofurano anidro (THF) num frasco de cintilação de vidro, contendo uma barra de agitação. Embrulhe em papel alumínio e vórtice em alta até que esteja totalmente dissolvido.
6. Em um frasco de cintilação de vidro separada Containing uma barra de agitação, adicionar 10 mM de Tetraethyleneglycoldiamine (122). Adicionar 40 ml de THF.
7. Coloque os dois frascos (C32 e 122) em uma placa de agitação durante 5 min, em seguida, se combinam. Cubra em papel alumínio e deixe em temperatura ambiente agitação a 400 rpm por 24 horas. O produto final é denominado C32-122.
8. Pesar 5 x 50 ml tubos Falcon para cada 5 g lote de C32-122. Note-se a massa de cada tubo em um notebook.
9. Transferência de 30 ml de éter dietílico anidro a cada tubo de 50 ml Falcon.
10. Transferência 10 ml de C32-122 a cada tubo de 50 ml Falcon.
11. Tubos Falcon Vortex vigorosamente em seguida, centrifugar a 2.500 rpm por 2 min. Nota: O polímero extraído vai recolher, na base do tubo.
12. Descartar a solução superior e repita os passos 1.9 e 1.11 mais duas vezes.
13. Colocar os tubos abertos contendo o extraiu-C32-122 no exsicador e de vácuo durante a noite. Assegurar que todos os tubos são protegidos da luz.
14. Pesar todos os tubos contendo C32-122 para determinar a massa final dopolímero extraído.
15. Dissolve-se o polímero extraído em DMSO anidro, a uma concentração de 100 mg / ml.
16. Armazenar o polímero dissolvido à temperatura de -20 ° C, protegida da luz e da humidade.

2. Sementeira celular

1. Pré-revestimento a base de um frasco de cultura de tecidos T-150 com 0,1% (p / v) de gelatina. A gelatina deve permanecer no balão durante 30-45 min. O revestimento de gelatina ajuda a aderência de ADSCs.
2. Aspirar gelatina do frasco T-150 pré-revestido.
3. Adicionar 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ passagem 3) para o balão de 20 ml de DMEM contendo 10% de FBS, 1% de Penicilina / Estreptomicina e 10 ng / ml de bFGF.
4. Colocar o frasco T-150 na incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante a noite.
5. Begin processo de transfecção, no dia seguinte.

3. Nanopartículas Preparação e transfecção

1. O procedimento que se segue é para a preparação de nanopartículas contendo o DNA de plasmídeo de 16,1 ug por1,0 x 10 ⁶ células em um polímero de plasmídeo proporção em peso de 30:1.
2. Dilui-se o DNA de plasmídeo (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, EUA) a uma concentração final de 120 ug / ml em acetato de sódio (25 mM) num tubo Falcon de 15 ml.
3. Dilui-C32-122 (100 mg / ml) para uma concentração final de 3,6 mg / ml em acetato de sódio (25 mM) num segundo tubo de 15 ml Falcon.
4. Combinar o conteúdo de cada um dos tubos Falcon para um único tubo de 15 ml Falcon e vórtice imediatamente em alta durante 10 segundos.
5. Deixe o tubo esteja à temperatura ambiente durante 10 minutos para a formação de nanopartículas de ocorrer.
6. Durante a incubação, substitua meio em frascos de cultura de tecidos com 7,8 ml DMEM totalmente complementada por 1,0 x 10 ⁶ células transfectadas.
7. Transferir a solução de nanopartículas para o frasco de cultura de tecidos e de inclinação para a frente e para trás, para espalhar uniformemente.
8. Colocar o frasco de cultura de tecido na incubadora a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 4 horas.
9. Depois de 2 horas, troque o nanopartigo contendo mídia com DMEM.
10. Após uma incubação adicional de 2 horas a 37 ° C, 5% de CO _2, as células estão prontas para injecção in vivo.

4. Membro Posterior Isquemia Procedimento

1. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o cuidado de animais e uso Diretrizes do Comitê da Universidade de Stanford e protocolos Aplac aprovados. Gerando o modelo murino de isquemia dos membros posteriores é realizada como descrito anteriormente. ⁸ Por favor, consulte a referência para instruções detalhadas. Uma breve descrição é fornecida abaixo.
2. Posicione o mouse sob anestesia com 1-3% de isoflurano dose por inalação e fluxo de oxigênio de 1 L / min. Certifique-se de profundidade anestésica por pitada pés, redução da freqüência respiratória, e letargia.
3. Remover os pêlos da região abdominal e ambas as áreas hindlimb do mouse com creme de barbear.
4. Fazer incisão no centro da coxa medial para linha média e, em seguida, acabar com almofada de gordura sobrejacente a exrepresentar a artéria femoral.
5. Ligadura da artéria em dois locais: Local distal (próximo ao joelho) e local proximal (logo distal ao ligamento inguinal).
6. Para criar as ligaduras, separe a artéria da veia e fio de seda de sutura 5-0 ao redor da artéria. Amarre a artéria com dois nós para fazer a ligadura.
7. Retirar a artéria entre os dois pontos de ligação.
8. Lava-se a área cirúrgica com PBS e em seguida a sutura da incisão fechada.
9. A anestesia pode agora ser removido. Manter o aquecimento do mouse até re-despertar. Para os cuidados pós-operatórios, 2-4 mg / kg de lidocaína pode ser injetado por via subcutânea no local da incisão, antes de voltar a despertar. Além disso o manejo da dor pode incluir entrega subcutânea de 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina em 12 e 24 horas. Monitorizar o estado de saúde dos ratos uma vez por dia, durante sete dias, observando mudanças no padrão de respiração, dor ostensiva ou angústia, e cor da pele.
10. Confirme hindlimb isquemia pelo laser Doppler perfusão de imagem.

5. Injeções de células

1. Quando as células transfectadas e os ratos estão prontos, lavar as células transfectadas com PBS, trypsinize, centrífuga, e depois contar.
2. Ressuspender as células a uma densidade de 10 x 10 ⁶ culas por ml em PBS.
3. As suspensões celulares devem ser separados em tubos Eppendorf separados a um volume de 110 ul. Isto vai assegurar que cada rato recebe uma quantidade igual de células.
4. Colocar cada rato sob anestesia (2,5% de isoflurano, o caudal de 1 L / min de oxigénio).
5. Limpe o local da injecção com algodão embebido em álcool.
6. Utilizando uma seringa de tuberculina de 27 L, retirar as células para cima e para baixo para dentro da seringa para assegurar uma suspensão homogénea é atingida. Desenha-se 100 ul do volume de suspensão de células para dentro da seringa.
7. Injectar a metade da suspensão de células na região do músculo adutor e depois injectar a outra metade para a região de sural. Após a injeção, deixe a seringa no local por pelo menos 15-30 segundos paraimpedir a fuga da suspensão de células.
8. Controles adequados para o estudo em animais incluem: 1) células transfectadas com um plasmídeo não codificadora (por exemplo, o plasmídeo sem qualquer actividade biológica), 2) apenas as células, e 3) PBS.
9. Quando as injeções são concluída, remova o mouse de anestesia e manter aquecido até que os re-desperta do mouse.

6. Bioluminescência Imagem

1. Para iniciar a imagem de bioluminescência (BLI), anestesiar os ratos, tal como descrito acima.
2. Limpe o local da injecção com algodão embebido em álcool.
3. Utilizando uma seringa de insulina, de carga de 100 ul de 15 mg / ml de D-luciferina (o substrato para a luciferase do pirilampo). Mantenha substrato da luz.
4. Para realizar injeções intraperitoneais, segure camundongos pela pele de suas costas para puxar a pele esticada anterior. Inserir a agulha intraperitonealmente para a região abdominal e injectar 100 ul de substrato.
5. Posicione o mouse na câmara de imagem IVIS luciferase sob anestesia.
6. Imagem os ratos com um tempo de exposição de 1,0 min. Quando os parâmetros são definidos, começam a adquirir imagens.
7. Quando a imagem é adquirida, marcar a região de interesse para medir o sinal da luciferase. Neste caso, marcar o membro isquémico no local de injecção das células.
8. Continue a medir o sinal luciferase cada 3-5 min até que o sinal atinge um pico e começa a declinar. Este é o valor utilizado para comparação entre os ratinhos, e ao longo de vários pontos de tempo.
9. Quando concluída, remova os ratos da câmara e anestesia. Mantenha ratos quente até re-despertar.

7. Laser Doppler Perfusão Imagem

1. Laser Doppler imagiologia de perfusão é realizada como anteriormente descrito. ⁸ O procedimento é descrito resumidamente aqui.
2. Antes de Doppler o mouse deve ser barbeado para as áreas que recobrem os dois membros posteriores e na região abdominal para evitar artefato devido ao cabelo.
3. Quando preparado imagem Doppler para o mousi deve ser anestesiado, tal como descrito acima.
4. Aqueça o mouse para 36 ° C em uma placa quente, enquanto controlo da temperatura corporal por termômetro retal.
5. Posicione o mouse em uma superfície preta não-reflexivo e manter anestesiado pelo nariz cone. O mouse deve ser colocado em sua superfície dorsal, com seus membros expostos de maneira uniforme.
6. Posicione o sensor laser Doppler cerca de 15 cm acima do rato e direcionando o ponteiro laser do sensor para a região da virilha do mouse.
7. Quando o mouse eo sensor Doppler estão em posição, é possível criar imagens utilizando o software LDPIwin pressionando o botão Start.
8. Medições de perfusão relativos poderiam ser tomadas, indicando os dois membros posteriores (isquêmica e não isquêmica) como a região de interesse (ROI). A proporção de perfusão significativo da isquêmica do membro posterior não isquémico indicará perfusão relativa.

8. Tissue Colheita Procedimento

1. Quando preparado para a colheita do mouse tisprocessar por histologia e / ou processamento bioquímico, o mouse deve ser sacrificado. Aqui, o rato é sacrificado por exposição a 5% de isoflurano para 3-5 min, em seguida, o rato eutanásia por deslocamento cervical.
2. Cortar a pele sobrepondo-se em torno do membro posterior circunferencialmente na região abdominal distal e proximal ao dos membros posteriores. A pele é cortada a partir da ventral para as superfícies dorsal, de modo a que a pele pode ser puxado para trás por cima do membro posterior do pé.
3. Ao puxar a pele para trás, o membro poderá ser amputada, utilizando uma tesoura de dissecção romba para cortar na articulação pélvica e fêmur.
4. Dois tecidos principais são levados para análise: os músculos adutores medial e os músculos gastrocnêmio.
5. Para histologia, incorporar um ou ambos os tecidos da temperatura de corte ideal (OCT) para cryosectioning.
6. Para a análise bioquímica, recolher um ou ambos os tecidos num Eppendorf de 1,5 ml e submergir num banho de azoto líquido durante pelo menos 2 min. As amostras podem serarmazenados a -80 ° C para futuro processamento.

Results

Após a mistura em conjunto, o polímero carregado positivamente (C32-122) e com carga negativa de plasmídeo de DNA auto-montagem em nanopartículas. Nanopartículas de formação pode ser confirmada através de análise de electroforese isto é, a complexação entre o C32-122 e o DNA de plasmídeo vai impedir que a mobilização do ADN durante a electroforese. O polímero funciona como um reagente de transfecção melhorada para facilitar a absorção de ADN para dentro das células alvo e a expressão subsequente de proteínas qu...

Discussion

Aqui nós relatamos um método para programar células-tronco adultas para superexpressão fatores terapêuticos usando não-virais, nanopartículas biodegradáveis. Esta plataforma é particularmente útil para o tratamento de doenças em que as células estaminais pode, naturalmente, de origem, tais como isquemia e cancro. ^9-10 Além disso, a plataforma de entrega de genes não virais permite a sobre-expressão transitória de factores terapêuticos, o que é adequado para a maioria dos tecidos e de regeneração de feridas pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Soro Bovino Fetal	Invitrogen	10082
Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15070
Fator Básico de Crescimento de Fibroblastos	Peprotech	100-18B
1,4-Butanodiol Diacrilato (90%)	Sigma Aldrich	411744	Siglato: C
5- amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acrónimo: 32
Tetraetilenoglicoldiamina > 99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acrónimo: 122
Acetato de Sódio	G-Biosciences	R010
Fosfato Tamponado Salino	Invitrogen	14190-144
Tetra-hiofurano Anidro (> 99,9 %)	Sigma Aldrich	401757
éter dietílico anidro (> 99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anidro (> 99,9%)	Sigma Aldrich	276855
Gelatina	Sigma Aldrich	G9391
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferina	GoldBio
Temperatura Ótima de Corte (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rato anti-rato CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa IgG Fluor 594 anti-rato	Invitrogen	A11007