Summary
Utføre cellekultur-analyser for å undersøke bakteriell vedheft og invasjon under aerobe forhold er vanligvis representative for
Abstract
Interaksjonene mellom bakterielle patogener med vertceller har blitt undersøkt grundig ved hjelp av in vitro cellekultur metoder. Men da slike cellekultur-analyser utføres under aerobe forhold, disse in vitro-modeller kan ikke nøyaktig representere in vivo miljøet hvor vert-patogen interaksjoner finner sted. Vi har utviklet en in vitro modell av infeksjon som tillater coculture av bakterier og vertsceller under forskjellige medium-og gass-forhold. Vertikal Diffusion Chamber (VDC) modell etterligner forholdene i tarmen der bakterier vil være under forhold med svært lite oksygen mens vev vil bli levert med oksygen fra blodet. Plassere polariserte intestinal epitelceller (IEC) monolagene dyrket i Snapwell setter inn et VDC skaper separate apikale og basolateral avdelinger. Den basolateral kammer er fylt med cellekulturmedium, forseglet og perfundert med oksygen wHilst den apikale kupé er fylt med kjøttkraft, holdes åpne og ruges i henhold microaerobic forhold. Både Caco-2 og T84 IECS kan opprettholdes i VDC under disse forholdene uten noen tilsynelatende skadelige effekter på celle overlevelse eller monolag integritet. Coculturing eksperimenter utført med forskjellig C. jejuni vill type belastninger og forskjellige IEC linjer i VDC-modellen med microaerobic forholdene i den apikale kupé reproduserbart resultere i en økning i antall samspill (nesten 10 ganger) og intracellulære (nesten 100 ganger) bakterier sammenlignet med aerobic kultur vilkår en. Miljøet opprettet i VDC modellen mer etterligner miljøet støtt av C. jejuni i den menneskelige tarmen og fremhever betydningen av å utføre in vitro infeksjon analyser under forhold som nærmere etterligne in vivo virkelighet. Vi foreslår at bruk av VDC modellen vil tillate nye tolkninger av interaksjoner satseWeen bakterielle patogener og vertscellene.
Introduction
Interaksjonene mellom bakterielle patogener med vertceller har blitt undersøkt grundig ved hjelp av in vitro cellekultur metoder. Ved hjelp av slike cellekulturer analyser, bakteriell vedheft til vertscellene, identifisering av verten celle reseptorer, vert celle signalveier og bakteriell invasjon av vertceller har alle blitt studert i detalj, noe som resulterer i mange viktige observasjoner. Men slike cellekultur-analyser utføres under aerobe forhold som kanskje ikke er representative for in vivo miljø. En viktig begrensning av in vitro-modeller som brukes til å studere gastrointestinale infeksjoner er at kultur tilstander, inkludert høyt oksygennivå generelt favorisere eukaryote celle overlevelse. Men forholdene i den intestinale lumen vil være nesten anaerob. Enteriske patogener i et svært lite oksygen miljø uttrykke virulens gener som uttrykk endringer under aerobe forhold to. Som sådan, innhentet data ved hjelp av standard cellekultur modeller may gi en unøyaktig indikasjon av bakterielle interaksjon med vertsceller.
Campylobacter jejuni er den ledende utløsende agent for bakteriell akutt gastroenteritt på verdensbasis, med symptomer som spenner fra mild diaré til alvorlig inflammatorisk tarmbetennelse. Flertallet av C. jejuni infeksjoner resultat i ukomplisert gastroenteritt, men C. jejuni er også den mest identifisert smittestoff i perifere nevropatier, inkludert Guillain-Barré syndrom (GBS). I Storbritannia er det anslått at det finnes over 500.000 tilfeller av tarmbetennelse forårsaket av C. jejuni infeksjon hvert år med en anslått kostnad for den britiske økonomien på £ 580 millioner. I den tredje verden, C. jejuni er en ledende dødsårsak blant barn. Til tross for utvilsom betydningen av Campylobacter infeksjon og tiår med forskning, inkludert grundig genomikk-basert analyse, C. jejuni patogenesen er fortsatt dårlig understood, i motsetning til andre enteriske patogener som Salmonella, Escherichia coli, Shigella, og Vibrio cholerae. Mangelen på en praktisk liten dyremodell er en vesentlig årsak til dette tre. Også mye brukt in vitro infeksjon modeller er mer upassende for å studere microaerophilic C. jejuni enn for andre enteriske patogener som er fakultative anaerobe bakterier. Mens C. jejuni er anerkjent som en invasiv patogen, mekanismene for C. jejuni invasjonen av intestinal epitelceller (IECS) er fortsatt uklart 4,5. C. jejuni invasjonen har vist seg å være avhengig av enten microfilaments, mikrotubuli, en kombinasjon av begge deler eller ingen av fem. Den forvirring i dette området er mest sannsynlig på grunn av bruk av upassende in vitro analysebetingelser.
En rekke forskjellige cellekultur-analyser er blitt brukt for å undersøke interaksjonen av C. jejunimed vertsceller. Caco-2 6, har INT 407 7, og T84 8 cellelinjer alle blitt brukt til å studere vedheft og invasjon evner av forskjellig C. jejuni stammer. Nivåene av bakteriell adhesjon og invasjon for C. jejuni med IECS er dramatisk lavere enn for andre enteriske patogener ni. Den coculturing av C. jejuni med IECS er normalt utføres i en CO 2 inkubator under forhold nær atmosfæriske oksygennivå, nødvendig for overlevelsen av IECS. C. jejuni genuttrykk vil være svært forskjellig i lav oksygen miljø av intestinal lumen sammenlignet med atmosfærisk oksygen forhold.
Bruken av en vertikal Diffusion kammer (VDC) system har blitt utviklet som tillater coculture av bakterier og vertsceller under forskjellige medium-og gass-forhold 1,10,11. Dette systemet etterligner forholdene i tarmen der bakterier vil være under forholdene svært lavt oksygeninnhold mens vev vil bli forsynt med oksygen fra blodet. Polarisert IEC monolag dyrket i spesielle 0,4 mikrometer filter ble plassert inn i en VDC skape en apikal-og basolateral kupé, som individuelt ble fylt med bakteriell kjøttkraft og celledyrkingsmedium henholdsvis (figur 1). Den VDC ble anbrakt i den variable atmosfæren inkubator inneholdende 85% N 2, 5% O 2, og 10% CO2 ved 37 ° C, noe som tilsvarer optimale betingelser for C. jejuni. Den apikale kupé ble etterlatt åpen og utsatt for atmosfæren microaerobic innenfor den variable atmosfæren inkubator, mens den forseglede basolateral kammer ble tilført oksygen med konstant administrering av 5% CO 2/95% O 2 gassblanding med et utløpsrør hindre akkumulering av trykk . Caco-2 celle overlevelse og monolag integritet under disse forholdene ble bekreftet ved å overvåke transepithelial electrical motstand (Teer) over monolaget løpet av 24 timer for å demonstrere overlevelse av Caco-2 cellemonoskiktet og fysisk separasjon av apikale og basolateral seksjoner under forhold med lavt oksygennivå i den apikale kupé. Den teer av monolag i VDCs opprettholdt i den variable atmosfæren inkubator (microaerobic forhold) og i en standard cellekultur CO 2 inkubator (aerobe betingelser) viste ingen signifikante forskjeller, noe som indikerer integriteten av cellemonoskiktet under forskjellige atmosfæriske forhold 1. Under microaerobic forhold, forble tett veikryss tilstede og jevnt fordelt mellom cellekantene med en occludin flekker mønster som ligner på cellene opprettholdes under aerobe forhold en.
Interaksjonene mellom C. jejuni med Caco-2 og T84 celler i VDC ble undersøkt ved å vurdere bakteriell interaksjon (heft og invasjon) og invasjon. To forskjellige C. jejuni vill-type Strains ble brukt en. C. jejuni 11168H er en hypermotile derivat av den opprinnelige sekvensen belastningen NCTC11168. Den 11168H belastningen viser mye høyere kolonisering nivåer i en chick kolonisering modell og er dermed ansett som en passende belastning å bruke for host-patogen interaksjonsstudier. 81-176 er et humant isolat, og er en av de mest invasive mye studert laboratoriestammer. C. jejuni isolatene ble lagt til den apikale kupé av en VDC både under microaerobic eller aerobic forhold. Vi observerte høyere priser for både samhandling og invasjonen ble registrert for C. jejuni i henhold microaerobic forhold en. Den økte C. jejuni interaksjoner var ikke på grunn av en økning i bakterielle nummer i microaerobic forhold en. Denne informasjonen støtter vår hypotese om at den lave oksygen miljø i apikale kupé av VDC forbedrer bakterier-vert interaksjoner og viser at de invasive egenskapene til C. jejuni er incrlettet under disse forholdene. Dette var den første rapporten om bruken av VDC-modell for å studere en invasiv bakteriell patogen og belyser betydningen av å utføre in vitro-analyser infeksjon under betingelser som nærmere etterligner in vivo-situasjon. Den VDC-modellen kan brukes til å studere host-patogen interaksjoner for mange forskjellige bakteriearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Vekst av IEC monolayers på Special 0,4 mikrometer Filters
- Kultur Caco-2-celler i Dulbeccos modifiserte essensielle medium (DMEM) supplert med 10% (v / v) føtalt kalveserum, 100 E / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 1% (v / v) ikke-essensielle aminosyrer i en standard vevkultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft. Seed 4 x 10 5 Caco-2 IECS per 0,4 mikrometer filtrere og vokse til polarisering over 21 dager, endre media hver 2-3 dager.
- Mål Teer å bekrefte polarisering status for monolaget ved hjelp av en Volt-Ohm motstand meter. I våre studier, den Teer av 21 dagers Caco-2 celler dyrket i disse 0,4 mikrometer filtre er 700-800 Ωcm to.
2. Utarbeidelse av C. jejuni og Bakteriell Medium for Coculturing analysen
- 24 timer før ønsket startpunktet for VDC coculturing analysen, utarbeide en friskt blod agar plate av C. jejuni og Inkuber ved 37 ° C under microaerobic forhold (85% N 2, 5% O 2, og 10% CO 2) i variabelen atmosfæren kuvøse.
- På samme tid, preincubate 30 ml Brucella buljong ved 37 ° C under microaerobic forhold i en variabel atmosfære inkubator.
3. Utarbeidelse og sterilisering av VDC Half Chambers Før analysen
- Helt fordype VDC halv kamre samt O-ringer og plugger i sterilisering løsning.
- Ved hjelp av en steril 20 ml sprøyte, skylle sterilisering løsning gjennom gassen inntakene i begge halv kamre. Unnlatelse av å gjøre det kan resultere i forurensning av prøvene under coculturing.
- Ta komponentene nedsenket i sterilisering løsning for> 1 time.
- Skyll alle komponentene med frisk sterilt vann, ved hjelp av en annen steril 20 ml sprøyte til å spyle gassen inntakene.
4. Forberedelseav Bakteriell Inoculum
- Høste en halv plate av C. jejuni vekst fra blodet agarplate fremstilt dagen før inn i 1 ml av den forinkubert Brucella kjøttkraft. Dette bør gi ~ 10 10 cfu / ml.
- Måle den optiske tetthet av den bakterielle suspensjonen ved 600 nm for å semiquantify bakterielle koloni-dannende enheter (CFUs).
- Juster bakteriell suspensjon til det ønskede nivå inokulatet i 4 ml av den forinkubert Brucella kjøttkraft.
- Utfør en seriefortynning fra dette siste bakteriell suspensjon etterfulgt av plettering av de hensiktsmessige fortynninger på blodagarplater i triplikat, og deretter inkuberes ved 37 ° C i den variable atmosfæren inkubator i 48 timer for å kvantifisere antallet av bakterielle CFUs tilstede i inokulum.
5. Sette opp VDC
- Plasser den nedre halvdelen kammer av en VDC flat på benken. Monter en O-ring på den nedre halvdel kammeret.
- Løsne ett filter bærer IECS fra than bærer og vask tre ganger med 400 mikroliter sterilt PBS. Sett filteret på nedre halvdel kammer, noe som gjør at O-ringen er fortsatt på plass.
- Senk forsiktig den øvre halvdelen kammer på plass. Når de to halv-kamre er satt sammen, klemme sammen ved hjelp av ring-klemmer. Plasser VDC vannrett på benke-platen, med de to åpningene som vender oppover.
- Tilsett 4 ml av bakterielle inokulat til den apikale halv kammeret.
- Tilsett 4 ml cellekulturmedium inn i basolateral halv kammeret.
- Plasser endestykkene inn i åpningene på begge halv kamre.
6. Feste VDC til gass Manifold innen Variabel Atmosfære Inkubator
- Plasser VDC inn i det variable atmosfæren inkubator i umiddelbar nærhet til den gass-manifold.
- Åpne gasstilførsel regulator koblet til gass-manifold. Feste stangen fra manifolden inn i gassinnløpet på basolateral halvdel kammer av VDC. Fest gas utløpsrør som fører ut av den variable atmosfæren inkubator til et av utløpene i den ende-stykket på basolateral halv kammeret.
- Steng den andre uttaket i endestykket på basolateral halve kammeret. Åpne gasstrømmen på gassen manifold, ta vare å åpne det veldig sakte for å unngå overflødig gass trykk, da dette kan føre til utvisning av basolateral medium.
- Det tas sikte på en gasstrøm av en boble hvert 2-5 sekund. Kontroller med jevne mellomrom på gasstrømmen i løpet av eksperimentet og justere om nødvendig.
7. Demontering av VDC etter coculture
- Etter den passende periode coculture, lukker gasstilførsel regulator koblet til gass-manifold. Steng gassen strømme inn i VDC ved manifold. Koble gassinntak, gassutløpet og stopperen fra VDC.
- Fjern VDC fra en variabel atmosfære inkubator. Fjern de apikale og basolateral supernatants og oppbevar ved -80 ° C for subsequent analyse.
- Fjern ringen klemmer og forsiktig ta fra hverandre VDC. Fjern filteret fra den halve kammer og overføring til en steril 6-brønn cellekultur parabolen. Vask IECS tre ganger med 400 mikroliter sterilt PBS.
- For telling av det totale antall samvirkende bakterier, tilsett 400 mikroliter sterilt PBS inneholdende 0,1% (v / v) Triton X-100 til de IECS og inkuberes i 20 min ved romtemperatur for å lysere IEC. Utfør en seriefortynning fra denne cellelysat fulgt av plettering av de hensiktsmessige fortynninger på blodagarplater i triplikat, og deretter inkuberes ved 37 ° C i den variable atmosfæren inkubator i 48 timer for å kvantifisere antallet av interagerende bakterielle CFUs.
- For telling av det totale antall av invasjon av bakterier, tilsett 400 ul DMEM cellekultur-medium inneholdende 150 ug / ml gentamicin til IECS og inkuberes i 2 timer i en standard vevkultur inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft å drepe ekstracellulære bakterier,deretter følger som for steg 7,4 ovenfor.
8. Rengjøring av VDC etter coculture
Vask VDC med sterilt vann og butikken for neste runde av eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Coculturing eksperimenter utført med en C. jejuni vill-type belastning og IECS i VDC-modellen med microaerobic forhold i den apikale kupé har vist en økning i antall samspill (nesten 10 ganger) og intracellulære (nesten 100 ganger) bakterier sammenlignet med aerobic kultur forhold i en tid -avhengig måte en. Denne observasjonen var reproduserbar ved hjelp av to forskjellige C. jejuni villtype stammer (11168H og 81-176) og to forskjellige IEC linjer (Caco-2 og T84), fremhever gyldigheten av VDC-modellen en.
De representative resultater som presenteres her er en sammenligning mellom antall C. jejuni i samspill med eller invadere Caco-2 celler etter 3, 6 eller 24 timer av coculture under Standard cellekulturanalyse forholdene i en CO 2 inkubator (Tall 2A og B) eller i VDC-modellen med microaerobic forhold i den apikale comterirommet (figurene 2C og D). Data for to forskjellige C. jejuni villtype stammer (11168H og 81-176) presenteres. Under standard cellekultur forholdene som brukes i de aller fleste av studiene i den vitenskapelige litteraturen, ble <10 7 cfu observert samspill med Caco-2 celler (Figur 2A) sammenlignet med ~ 10 8 cfu observert samspill med Caco-2 celler i VDC modell (Figur 2C) etter 24 timer. Etter coculture i VDC modellen, er det ~ 10 7 intracellulær cfu isolert fra Caco-2 celler (figur 2D), sammenlignet med bare ~ 10 5 intracellulær cfu isolert fra Caco-2 celler (figur 2B) etter coculture under standard cellekultur vilkår for 24 hr.
En direkte sammenligning mellom antall C. jejuni i samspill med eller invaderende IECS etter coculture i VDC-modell med enten microaerobic eller aerobic tilstandsjoner i den apikale kupé er utført tidligere en. Bruk av VDC modellen gir en økning i samspill C. jejuni på nesten 10 ganger og en økning i intracellulær C. jejuni på nesten 100 ganger etter 24 timers coculture en.
Figur 1. Skjematisk av Vertical Diffusion Chamber (VDC) modell. Intestinal epitelceller (IECS) er dyrket på gjennomtrengelig 0,4 mikrometer filter støtter og settes inn i en VDC, og dermed skape en apikale og en basolateral kupé. Disse avdelinger kan så justeres individuelt i forhold til medium og gass-sammensetningen slik at den coculturing av IECS med C. jejuni med microaerobic forholdene på den apikale overflaten av IECS og aerobic forhold på basolateral overflaten av IECS.
Figur 2. Representative resultater å sammenligne antall av C. jejuni 11168H eller 81-176 villtype stammer samspill med (A og C) eller invaderende (B og D) Caco-2 celler etter 3, 6 eller 24 timer når coculture analysen ble utført under enten standard cellekultur forhold i en CO 2 inkubator (A og B) eller i VDC-modellen med microaerobic forhold i den apikale segment (C og D). Alle eksperimentene representerer minst tre biologisk replikater utført i to eksemplarer i hvert forsøk. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av in vitro cellekultur-metoder for å studere interaksjoner av bakterielle patogener med vertceller er en teknikk mye brukt i mange laboratorier. Men da slike cellekultur-analyser utføres under aerobe forhold, disse in vitro-modeller kan ikke nøyaktig representere in vivo miljøet hvor vert-patogen interaksjoner finner sted. Den er mye brukt i vitro infeksjon modellene er spesielt upassende for å studere microaerophilic C. jejuni sammenlignet med andre enteriske patogener som er fakultative anaerober. Det er stor forvirring i litteraturen om mekanismene for invasjonen av menneskelige IECS av C. jejuni 4,5. Vi foreslår at grunnen mekanismene for invasjonen er så dårlig forstått er fordi de in vitro modeller som brukes i disse studiene ikke nøyaktig gjenspeile in vivo situasjon. Ved hjelp av standard cellekultur-analyser, nivåetav C. jejuni invasjon av IECS er alltid veldig lav ni. Utviklingen av VDC modellen var vår reaksjon å løse dette problemet.
Vi har etablert at to forskjellige IEC linjer kan opprettholdes i VDC med microaerobic forholdene på den apikale overflaten uten observerte ugunstige effekter over en 24 timers periode en. En tidsavhengig økning av antallet både samvirkende og intracellulær C. jejuni 11168H vill type belastning bakterier ble observert etter coculturing med Caco-2 IECS i VDC med microaerobic forholdene i den apikale kupé en. Disse observasjonene ble ytterligere bekreftet ved hjelp av en andre IEC linje (T84), samt en andre C. jejuni vill-type belastning (81-176), som indikerer ingen cellelinje eller bakteriestammen spesifikke effekter en. Disse økte nivåer av bakteriell samhandling og invasjonen resulterte i en økt, polarisert medfødte immunforsvaret fra IECS en. Highennes nivåer av IL-8 ble funnet etter microaerobic coculturing, noe som indikerer at den økte bakterielle utfordringen er avstemt med en økt vertsrespons. Høyere nivåer av IL-8 ble påvist i supernatanter basolateral forhold til den apikale supernatanter, noe som indikerer at IL-8-sekresjon i IECS forekommer hovedsakelig fra den basolateral IEC overflate. IL-8 er som en nøytrofil attraktant, noe som ville ha begrenset nytte i den intestinale lumen. Denne informasjonen viser at de to-kompartment oppsett av VDC også gir mulighet for effektiv identifisering av en polarisert vert respons.
Flere trekk ved teknisk / setup siden av VDC modellen må vurderes før påføring av modell for å studere eventuelle sykdomsfremkallende organisme. For det første må de IECS dyrkes for å danne en ugjennomtrengelig monolag på spesielle 0,4 mikrometer filtre. Dette tar mellom 14-21 dager, avhengig av den cellelinjen som benyttes og gjør forsøkene forholdsvis lange i forhold til klassisk coculturing eksperimenter utført i cellekultur plater og bruke IECS dyrket for mellom 1-7 dager. På den annen side, bare etter en så lang periode med vekst har IECS blitt vist å danne et fullstendig monolag polarisert. Slike polariserte monolag etterligne situasjonen in vivo i den menneskelige tarm epitel mye tettere enn de nonpolarized, nonconfluent IEC linjer som brukes i noen studier, og som sådan gir en annen fordel av VDC-modellen. Dernest den spesielle 0,4 mikrometer filter er betydelig dyrere enn en standard 24-brønn cellekultur plate. Den viktigste begrensningen av VDC er relativt lav gjennomstrømming. Dette er hovedsakelig på grunn av tilgjengeligheten av VDC kamre og oppsettet krever gass manifold. Kun relativt lavt antall parallelle replikerer kan utføres på en gang, i motsetning til den klassiske metode cellekultur. Den VDC modellen er derfor mindre egnet for storskala screening eksperimenter eller eksperimenter som krever et høyt antall replicates. En annen faktor å vurdere er at alvoret effekten av å utføre coculture analyser i VDC-modellen betyr at over tid bakterier vil begynne å samle på bunnen av den apikale kupé som resulterer i redusert mulighet for interaksjoner med IEC monolayer. Men bruker VDC modellen har vi vist at interaksjoner av en nonmotile, nonaggregating 11168H rpoN mutant er dramatisk redusert i forhold til bevegelige, samles 11168H vill-type belastning etter 6 hr en. Vi jobber for tiden med modifikasjoner på VDC modell som ville tillate noen å blande i den apikale kupé som ville nærmere etterligne peristaltikk i tarmen lumen. Derfor, mens den VDC-modellen er bedre enn de klassiske, aerobe cellekultur metoder på grunn nærmere etterligne in vivo situasjonen, spesielt for bakterier slik som C. jejuni som har en strengere atmosfæriske krav, har VDC modellen fremdeles visse begrensninger som må tashensyn til ved utformingen av eksperimenter.
Våre data støtter funnene rapportert for en tilsvarende VDC-modellen benyttet for å studere gastriske humant patogen Helicobacter pylori, som viste økt bakteriell adhesjon til vertsceller, økt syntese av bakteriell virulens faktorer, så vel som en økt vert medfødte immunrespons når H. pylori ble cocultured med epiteliale cellene under microaerobic forhold til aerobe forhold 11. Som både H. pylori og C. jejuni krever microaerobic forhold for vekst, er funn som microaerobic forhold fremmer samspillet mellom organismene med vertscellene overraskende. Imidlertid viste en annen studie med et VDC system for å analysere interaksjoner av de fakultative anaerobe enterohemorrhagic Escherichia coli med IECS økte nivåer av bakteriell samhandling under anaerobe / microaerobic coculture forholdene i VDC apical kupé 10. Thans indikerer at atferden til bakterier som er i stand til voksende under atmosfæriske oksygenforhold er også endret når cocultured med IECS under anaerobe / microaerobic forhold. Dette tyder på at VDC-modellen er en forbedret og verdifull modell for analyse av host-patogen interaksjoner av mange ulike patogene bakterier under forhold som mer trofast likne in vivo situasjonen i de menneskelige intestinal lumen.
Fra modellen perspektiv har VDC-modellen viste seg å ha noen klare fordeler fremfor aerobic in vitro C. jejuni-IEC coculturing modeller. Miljøet opprettet i VDC modellen mer etterligner miljøet i tarmen under C. jejuni, som fører til en meget vesentlig økning i antall bakterier i samspill med og invaderende IECS. Den VDC modellen i denne aktuelle formatet er ideelt for å studere samspillet mellom enteriske bakterier med mage eller tarmepitelceller, men det er potensial til å tilpasse VDC modell for studiet av strenge anaerobe fra avføringsprøver eller for oral mikrobiologiske prøver, som bare to eksempler. Den viktig prinsipp bør alltid være å ta sikte på å utføre disse eksperimentene coculture under betingelser som nærmere etterligner in vivo-situasjon. Den VDC modellen vil være et viktig verktøy for videre studier av C. jejuni host-patogen interaksjoner og bør gjelde for studiet av de sykdomsfremkallende mekanismer av mange forskjellige bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dominic Mills ble støttet av en Bloomsbury høyskoler PhD Studentship (2007-2010). Forfatterne ønsker å takke både Ozan Gundogdu og Abdi Elmi for deres hjelp i utviklingen av VDC-modellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts | Harvard Apparatus | 66-0001 | Manifold & six Snapwell chambers |
| Caps | Harvard Apparatus | 66-0020 | |
| O-rings | Harvard Apparatus | 66-0007 | |
| Clamps | Harvard Apparatus | 66-0012 | |
| Snapwell filters (pore size 0.4 μm) | Corning Costar | 3407 | |
| Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter | Millipore | MERS00002 | |
| WPA Lightwave II spectrophotometer | Biochrom | 80-3003-72 |
References
- Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
- Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
- Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
- Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
- Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
- Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
- Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
- Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
- Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
- Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
- Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).
