Behavior

膳食持续时间作为衡量啮齿动物的奥体非感知反应的指标

Published: January 10, 2014 doi: 10.3791/50745

¹Department of Biomedical Sciences, Texas A&M University Baylor College of Dentistry

Summary

延长膳食时间代表啮齿动物的或非感知行为，类似于人类的守护行为与性疼痛。饮食是一种不需要训练或动物操作的行为，需要皮质参与，并且不与其他实验诱导的行为竞争，将此检测与替代反射或操作测量区分开来。

Abstract

延长膳食时间可用于测量与患有或社会疼痛的人类的守卫行为相似的体面机械性高血症的增加。为了测量膳食持续时间，无拘无束的老鼠连续被关在声音衰减、计算机化的喂养模块中数天到数周，以记录喂养行为。这些声音衰减室配备了周颗粒分配器。分配器有一个颗粒槽，在槽底放置了光束，当啮齿动物从喂食器槽中取出颗粒时，这种光束不再被阻塞，指示计算机投下另一个颗粒。计算机记录从低谷中取出颗粒的日期和时间，从这些数据中，实验者可以计算膳食参数。在计算膳食参数时，根据以前的工作定义了膳食，并设定为 10 分钟（换句话说，当动物 10 分钟不进食时，即动物膳食的末日），并且将最低膳食大小设置为 3 个颗粒。然后，您可以通过软件计算操作员希望的任何时间段的用餐时间、膳食数量、食物摄入量、膳食大小和餐间间隔。在可以计算的喂养参数中，膳食持续时间已被证明是雄性大鼠和雌性大鼠中或社会非侵入性生物标志物。膳食持续时间测量是定量的，不需要训练或动物操作，需要皮质参与，并且不与其他实验诱导的行为竞争。这些因素将此分析与其他记录或社会非感知的操作或反射方法区分开来。

Introduction

动物模型已经被用来研究疼痛和与组织损伤和炎症^1，2相关的非感知，但缺乏适当的动物模型导致对机制的不完全了解。虽然目前的模型帮助我们了解与急性和慢性或社会疼痛有关的各种机制，但这些动物模型有优点和缺点。

许多模型测量行为感知反应的持续时间很短。面部梳理是面部神经收缩后的一种已知行为反应^。其他研究测量面部摩擦与ipsilatere前部或后爪，以及，退缩的头部后，管理正式注射到节奏和状关节（TMJ）或嘴唇^4-7。头部抽取延迟是测量无菌行为的另一种模型，其中修改后的尾部轻弹镇痛仪用于在将热量应用于大鼠⁸的剃光振动垫后量化无菌反应（即头部戒断）。在向TMJ⁹注射谷氨酸后，胃部和按摩师的肌肉活动也被记录为疼痛的相关性。另一项研究测量了睡眠参数的变化，以评估发炎的雌雄大鼠的无菌反应，这些参数包括睡眠延迟、快速眼动（REM）、非REM睡眠百分比和REM睡眠百分比^10。大多数测量行为非感应反应的动物模型使用很短的时间框架，即每天^11-14分钟到几个小时。此外，大多数动物模型测试发生在光相和夜间动物，像老鼠，这可能会导致压力，可以混淆非感性结果^15-18。上述检测测量不同或社会条件下的非感性反应，但持续时间短，因此只能用于研究急性疾病。另一种检测方法使用面部表情作为中度持续时间的无感知度，但这种方法可能是主观的^19。

为了评估持续或慢性或长期的非感知，一些人使用冯弗雷丝在皮肤表面的应用来评估受神经收缩或TMJ炎症^3，20的动物的机械敏感性。利弗曼等人 2009年测量退出反应使用分级单片后，CFA注射到大鼠的按摩师肌肉^21，22。山崎等人2008年给TMJ注射了CFA，然后在14天内量化了对TMJ地区施加的机械、热或冷刺激的不敏感行为。不幸的是，这些不敏感的行为检测涉及动物抑制，产生压力激素，学习或替代行为，可能会干扰测量的结果。

测量牙齿新觉的模型利用下颚开口反射，但这种方法可能不可靠²³ 或不精确^24。电密电活性已用于测量牙齿新感^25，但这种方法通常要求动物失去知觉，虽然在一项研究中牙齿新认识被调查在自由移动的老鼠^26。2008年，Khan使用敏感的应变量表²⁷ 研究了牙齿新感与咀嚼功能之间的关系，但这种咬合持续时间模型需要限制动物的正常活动^28。咬伤力是衡量人类牙齿疼痛的可靠指标，但由于大鼠需要训练和/或克制来测量咬伤力，因此引入了压力源，从而得出具有可疑生理意义的发现^29-31

使用操作设计来评估无感性行为，可以克服约束和压力的某些限制。一个操作模型使用避免不舒服的温度来评估和描述或描述社会非感知^32-35。这种奖励冲突模型是基于加糖牛奶的奖励，诱导啮齿动物自愿将脸靠在加热或冷却的热探针^34，36上。然而，测试需要动物训练，但检测的强度是数据以自动化的方式收集。

还有一种动物模型使用非感知诱发的啃食功能障碍作为组织非感知³⁷的指数。然而，啮齿动物被限制在管子里，它唯一的出路就是咬着一只鸽子离开。该模型的一个优点是，它测量小鼠急性或慢性下颚损伤后的下颚功能。然而，啮齿动物是有限的，这增加了一个混淆的替代竞争行为，即逃跑，这将是有压力的，因此可能会影响无菌检测结果。

膳食持续时间已用于测量动物的非感知与TMJ关节炎^38-41，牙髓暴露^42，肌肉损伤^43。在动物开始进餐后，经历过或非社会性非感知的啮齿动物吃得比较慢。患有TMJ疼痛的患者也需要更长的时间来咀嚼他们的食物，当TMJ疼痛减少^44-46时，周期长度缩短。当TMJ疼痛出现时，延长膳食持续时间预计将是一种"保护行为"，在操作上定义为无感性行为^47。

膳食持续时间测量TMJ新感，使用非侵入性方法在雄性大鼠和雌性大鼠中长达19天，在雄性小鼠中测量6天（测试时间最长），可称为新药^38-41的生物标记。为了支持膳食持续时间测量非感性反应，药理干预可减少非感知，导致动物的膳食持续时间恢复正常^{38，40，41。}当无菌神经元被使用辣椒素摧毁时，这也得到了证实：神经破坏后，动物的膳食持续时间没有增加后，注射CFA到TMJ 40。

以下是关于如何获取和统计分析膳食持续时间数据的协议。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

在这个模型中，大鼠或老鼠被给予食物和水的脂肪。德克萨斯A&M大学贝勒牙科学院机构动物护理和使用委员会批准了所有的实验协议。下面的特定设置以对称性显示，并专门用于大鼠 TMJ 关节炎模型。小鼠也可以用于这个模型和替代牙痛和肌源性或社会性疼痛动物模型也可以使用^42，43。

1. 软件设置

将喂食器单元的动物监视器软件加载到计算机上。
动物监视器软件现在通过单击图标打开，在文件菜单选择下选择"配置"下拉选项。
在"动物监视器配置"窗口中，取消选中标题为"Pellet 交付输入"（图 1A）的框。
注意：此框通常默认在工厂检查。取消选择此选项。一旦调查员取消选择此选项，结果将通过从低谷中取出颗粒而不是在分配颗粒时进行记录。
注意：当检查"自动文件命名"框时，软件将自动命名文件（图 1A）。默认情况下，此框通常在工厂进行选中。
设置定时器灯在 06：00（早上 6：00）打开，并在 20：00（晚上 8：00）关闭。
注意：对馈线器单元的硬件进行了修改，使盒子内的灯不由软件控制，而是连接到隔离的 24 小时定时器。因此，配置软件上显示的"家灯"在这些示例中不起作用。
选择编辑拉下菜单并选择"实验"。显示标题为"框 01 -"的窗口（图 1B）。
输入保存在此窗口中的数据的文件名。
注意：如果没有输入文件名，数据文件将由软件自动命名。实验的详细信息可以在此窗口中添加，并保存在数据文件中。窗口上的信息也可以保存并用于后续实验。
在题为"实验长度（天）"的入口框中输入大于实验总时间的数字。
注意：这将确保软件保存数据，直到实验完成，一个错误可能是设置此值太短，这将阻止软件记录数据，即使动物仍然在喂养模块中。
在题为"一天中的小时数"的条目框中输入 24。
注意：长度可以修改为实验者的规格。
在标题为"用餐期结束标准（最小）"的框中输入 10：
注意：对于大鼠，根据先前的研究^48（即餐前后由10分钟不服用颗粒）定义膳食，并且在此软件包中将最低膳食大小设定为每餐三粒。
在标题为"颗粒大小（mg）"的框中输入45。如果个人想要在此窗口内使用鼠标输入 20。
对于大鼠添加45毫克啮齿动物周丸到喂食器分配器漏斗。
注意：对于小鼠添加20毫克啮齿动物周丸到周漏斗。
在实验窗口的"阶段"部分，在"名称"字段中输入术语日，在"小时#"字段类型 24（图 1B）中输入术语日。
注：在"相"部分下方有两个大的开放领域。第一个大的开放领域将填充在以前的"阶段"和"名称"字段输入的文本。
下一个大的开放领域将有"日相"标题输入字段标题为"名称"字光，并在字段中输入标题为"百分比"的数字60。
注意：此输入的文本将填充下面的大字段。
接下来进入题为"名称"的字段"黑暗"，并在题为"百分比"的字段中输入数字40。注意：有了这些条目，60%的一天将归因于光相，40%将归因于黑暗阶段。当软件计算膳食模式时，将使用此信息。这些设置通常用于循环雌性动物，这些动物保持在 14：10 的光/暗周期中。
选择"设置所有框都这样"按钮。保存此信息，然后点击确定。
"启动框"屏幕出现，选择馈线以激活并点击确定（图1C）。
接下来，动物监视器运行时间窗口将显示与膳食模式数据（图 1D）.
注意：监控并记录此窗口中的"#已分配的颗粒"，以确定大鼠的当前健康状况。体重在300克左右的健康雄性大鼠通常每天吃300-800 45毫克的颗粒。
文件每天生成，并自动保存，有一个。CSV扩展。打开这些文件以检索膳食模式数据，如食物摄入量、膳食数量、用餐时间、膳食大小或餐间间隔。这些膳食模式的间隔可以计算一整天或一天的一个阶段，如黑暗和光明阶段。如上所述，设置为 14：10 光/暗周期。每个颗粒何时从低谷中取出的原始数据也记录为原始数据。CSV文件。
注意：在软件的旧版本中，在生成 " 的计算中未使用 3 个颗粒的最小膳食大小。CSV文件。此外，要使用较旧的软件获得平均用餐时间，您必须从平均膳食持续时间列中的值中减去 10 分钟。CSV文件。
当软件运行时，操作员可以手动选择文件下拉菜单选项，并每天选择"保存原始数据"。这将将原始数据保存 24 小时，而不是整个实验。这些原始数据可由用户自行决定的替代软件处理。
注意：在结果显示，我们使用替代软件，包括至少3粒的膳食大小。

2. 膳食持续时间分析

将单个大鼠放在装有光束计算机激活的颗粒馈线的减声室中。
注意：在这些喂食单位有分级水瓶和废锅，其中放置了一张厚厚的吸水纸。在喂食器分配器漏斗45毫克啮齿动物周丸可以添加到大鼠或20毫克啮齿动物周颗粒可以添加到小鼠。周丸被分配到V形的喂食槽，在这个槽的底部是一个光束。通过打破这个光束，将检测到分配到槽中的颗粒。一旦大鼠从喂食器槽中取出此颗粒，光束就会恢复，这会使计算机发出信号，使计算机再次掉落颗粒。光束的恢复还触发计算机记录日期和时间，并保持分配的颗粒的运行计数。然后使用 Med Assoc. Inc. 软件分析颗粒的计数，以确定一天中任何部分的食物摄入量、膳食数量、用餐时间、膳食大小或餐间间隔。再次原始。CSV数据文件可以通过外部软件^{39，40，49-51}进行分析。
记录在实验期间食用的颗粒总数、消耗的水量和动物的重量，以辨别大鼠的一般健康状况。
每天冲洗水瓶并加满淡水，并在需要时将 chow 添加到喂食漏斗中。
每天将废锅和厚吸水纸倾倒在笼子下面，每天用高压空气吹除进料器部分的灰尘。
注意：需要个人防护设备（如礼服、手套、口罩和口罩）。
实验完成后，取出地板、废锅和水瓶，清洗这些部件。此外，用手或洗碗机将喂食电子产品从洗碗机中取出。

3. TMJ 关节炎诱导

在实验前至少4天将动物放在喂食器中。
注意：此数据将作为获取基线喂养行为的节前报告。然后，动物被从喂食器中取出进行治疗。一种治疗方法是诱导关节炎TMJ。对于此模型，大鼠在 08：00（即光相的开始）用异氟素麻醉后注射完整的 Freund 辅助剂（CFA）（即光相的开始）。
将 250 毫克 CFA 在 50 L 中双边注入每个 TMJ 的围场空间。
注意：在示例中（图 2） 250 毫克 CFA 在 50 L 被注射到每个 TMJ 中，但小至 15 μl 的体积低至 10 毫克的剂量在较短的时间^{段 52}有效。
注射控制大鼠TMJ与50升的0.9%盐水。注意：所有动物在麻醉后5分钟或更短的时间内移动。如果给予较小剂量的终审法院，对照大鼠将获得同样数量的盐水。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

膳食持续时间是组织疼痛的行为相关性，膳食持续时间测量已应用于患有TMJ关节炎（图2）和蛀牙的动物（图3）。在一项实验中，大鼠在施用了250毫克高剂量的终审法院后，患有TMJ关节炎，这种治疗导致19天的膳食持续时间显著增加（图2）。注射到每个 TMJ 关节的低剂量 CFA （10 毫克）仅在 2-3 天⁵²中产生较小的膳食持续时间增加，表明使用此膳食持续时间检测对 CFA 管理的剂量响应。膳食持续时间测量了组织区域的非感知反应，但没有检测到膝盖内关节炎的反应（图2）。

在第二个实验中，膳食持续时间还检测到接触纸浆的老鼠的无菌反应（图3）。纸浆暴露导致蛀牙，^是人类牙痛的典范。其他喂养模式，如食物摄入量、膳食数量和膳食大小，在一定程度上不会像膳食持续时间那样有太大变化，也不会在一段时间内表明，这些其他膳食模式不像膳食持续时间³⁹那样敏感。随着膳食持续时间的显著增加，膳食数量和膳食大小通常有不小的趋势，导致食物摄入量接近正常水平，因此被处理动物的体重与假动物或控制动物的体重相等。

从 图 1 中的数据和以前的均值和标准偏差数据^38-42 来计算至少 2 分钟的治疗组（使用 ANOVA）之间的显著差异将需要大约 9 个动物/治疗组。

图1。动物监视器软件的屏幕截图。 面板 1A 是动物监视器配置窗口。面板 1B 是选择编辑拉下菜单并从此菜单中选择"实验"时显示的窗口。面板 1C 是允许选择性激活特定馈线单元的窗口。面板 1D 是下一个窗口，该窗口显示并命名为"动物监视器"。此窗口显示活动馈线单元的膳食参数的实时计算。单击此处查看更大的图像。

图2。在有关节炎的发炎性关节（TMJ）的雄性大鼠中，膳食持续时间显著延长了19天。 对于对照组，斯普拉格·道利大鼠被注射50升盐水到每个TMJ（盐/TMJ，n = 13）。在实验组250克完整的弗伦德的辅助剂（CFA）被注射到TMJ（CFA/TMJ，n = 14）或膝盖（KNEE/CFA，n = 7）。膳食持续时间数据计算在注射前一天（0）和天 1-21 （1， 2， 3 等）后 TMJ 或膝盖注射.行为测试后，通过解剖检查每个关节，以验证注射部位。值被赋予作为SEM±手段。双向ANOVA与重复测量有独立的变量处理（盐水和CFA）和时间和依赖的可变膳食持续时间用于这些研究。观察到对终审法院治疗有显著的主要影响，F（2，31）=4.7，p<0.05。使用邓肯的临时测试进一步分析了数据。对于 = p<0.05，将 SALINE/TMJ 组与 CFA/TMJ 组进行比较。对于 b = p<0.05 CFA/TMJ 组与 CFA/KNEE 组进行了比较。

图3。六只雄性斯普拉克道利大鼠的毛细摩尔暴露在外，手术后测量了6天的膳食持续时间。 对照大鼠没有进行纸浆暴露手术，但确实进行了麻醉。使用独立的治疗变量（控制、暴露）和时间以及依赖的可变膳食持续时间进行重复测量的双向 ANOVA 用于分析膳食持续时间数据。观察到纸浆暴露的重要主要影响，F（1，12）=66，P<0.001。使用邓肯的临时测试进一步分析了数据。比较对照与露出摩尔的老鼠时**=p<0.05，**=p<0.01。意味着± Sem. 每个治疗组有五只老鼠。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TMJ患者的体痛报告增加疼痛与增加咀嚼时间，这样，咀嚼周期延长越长，个人已经咀嚼^{45，53-56。}我们的行为检测允许在测量膳食持续时间³⁹时对大鼠和小鼠进行类似的测试。最近一项未发表的研究表明，冯弗雷灯丝测试比膳食持续时间测量具有更大的灵敏度，显示较长时间内有显著变化，但冯弗雷灯丝测试可以具有反射反应成分，而膳食持续时间测量需要中枢神经系统区域进行处理。因此，通过冯弗雷灯丝测试，灵敏度可能会更高，但反应可能部分反映反射。虽然，治疗药物具有中央效果修改丝测试结果表明，检测反映了中央疼痛处理的某些方面^57。

在膳食持续时间检测中，应每天监测分配的颗粒总数。雄性大鼠通常会摄入45毫克颗粒中的400-800粒，雌性大鼠会摄入300-600粒颗粒。如果每日颗粒值低于这些典型值，实验者应检查馈线单元，如果颗粒分配器在从槽中取出颗粒时掉落 5 颗颗粒：颗粒漏斗附近的颗粒传感器（不在槽中）可能尘土飞扬，需要清洁。即使分配器掉了5个弹丸，计算机将指示只有一个颗粒被丢弃（给低计数）。因此，无论五颗还是一颗颗粒在低谷中，计算机只记录一个事件。清洁传感器后，从进料槽中取出颗粒时应分配单个颗粒。或者，可以更换传感器。如果每日颗粒值高于这些典型值，则喂食槽上的传感器可能尘土飞扬，需要清洁。清洁传感器，第二天检查，以确定掉落的颗粒数量是否在典型范围内。

膳食持续时间是一种行为检测，可受物种差异的影响。在先前的一项研究中，使用患有TMJ关节炎³⁹ 的小鼠，有一些小鼠菌株会囤积颗粒。老鼠会从喂食槽里取出颗粒，把颗粒扔到笼子的角落里，扔进废锅里，而不是吃颗粒。由于囤积行为，膳食模式测量不能反映小鼠进食的速度，也不会反映患有TMJ关节炎的小鼠的机械性过敏水平。排除这种囤积行为的一种方法是在预处理阶段对小鼠进行筛查。从先前的研究中，大约40-70%的小鼠会囤积超过5%的颗粒。这导致膳食模式数据发生重大变化。为了消除囤积问题，老鼠被预先选中，这样它们囤积的颗粒就不到5%。对预选动物进行了实验，并在整个实验中监测了囤积行为。在实验的任何一点，囤积超过食物摄入量5%的动物都从实验结果中被淘汰。这个预选过程有两个问题，一是需要时间对足够的小鼠进行预筛选，以获得完成实验的动物数量：二是这个过程需要筛选很多动物，其中大多数不会用于实验，导致成本过高。

总之，膳食持续时间是一种定量测量，对实验者不主观。像操作方法吃是一种行为，需要皮质参与，但吃不同于许多反射测量，如划伤，冯弗雷头发，或热。在测量进餐时间时，动物不必在测试前接受训练，也不必固定或处理，这会加重压力和交替行为。膳食持续时间测量是连续的，因此测试发生在黑暗和光相，与啮齿动物正常睡觉时的光相测试形成鲜明对比。膳食持续时间测量可以持续数天，而不是在特定时间间隔内短暂执行测试的其他方法。这些优点使膳食持续时间测量成为研究头部区域新感学机制的有力工具。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

没有什么可透露的。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal Monitor software	Med Assoc. Inc	SOF-710	East Fairfield, VT
Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based	Bio-Serv	F0165	45 mg pellets, 50,000/box
Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based	Bio-Serv	FO163	20 mg pellets
Complete Freund's Adjuvant	Chondrex, Inc.	7001	No loger provides the 5 mg/ml concentration. Can use CFA from other sources as long as the investigator consistently uses this source