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Summary

A estrutura da solução de RMN de um peptídeo modelo de metalochaperona com (I) foi determinada, e um protocolo detalhado desde a preparação da amostra e coleta de dados 1D e 2D até uma estrutura tridimensional é descrito.

Abstract

A ligação do cobre (I) por proteínas de transporte de metalochaperona evita a oxidação do cobre e a liberação dos íons tóxicos que podem participar de reações redox prejudiciais. O complexo (I) do modelo peptídico de uma proteína metalochaperona ligante a (I), que inclui a sequência MTCSGCSRPG (sublinhado é conservado), foi determinado em solução sob condições inertes por espectroscopia de RMN.

A RMN é uma técnica amplamente aceita para a determinação de estruturas de solução de proteínas e peptídeos. Devido à dificuldade na cristalização para fornecer cristais únicos adequados para cristalografia de raios-X, a técnica de RMN é extremamente valiosa, especialmente porque fornece informações sobre o estado da solução e não sobre o estado sólido. Aqui, descrevemos todas as etapas necessárias para determinações completas da estrutura tridimensional por RMN. O protocolo inclui preparação de amostras em um tubo de RMN, coleta e processamento de dados 1D e 2D, atribuição e integração de picos, cálculos de mecânica molecular e análise de estrutura. É importante ressaltar que a análise foi conduzida pela primeira vez sem ligações metal-ligante predefinidas, para garantir uma determinação confiável da estrutura de maneira imparcial.

Introduction

Os peptídeos são amplamente utilizados como modelos de proteínas, potenciais fármacos e agentes terapêuticos por direito próprio. No entanto, seu pequeno tamanho e alto grau de flexibilidade muitas vezes impedem a determinação da estrutura por raios-X devido a dificuldades na cristalização.

A ressonância magnética nuclear (RMN) pode ser usada para determinar estruturas e interações peptídicas. O método pode fornecer informações sobre a estrutura local e geral, interações de ligação e menor afinidade, e é aplicável a amostras difíceis, pois pode ser feito no estado de solução.

O transporte de cobre em sistemas biológicos é obtido por proteínas metalochaperonas de cobre intracelulares que se ligam especificamente aos íons (I) e os entregam às suas proteínas-alvo por meio de uma série de interações proteína-proteína, para proteger os íons da oxidação e evitar a liberação de cobre tóxico^2-5. O sítio de ligação é caracterizado pela sequência conservada, MXH/TCXanyXanyC, que demonstrou tanto por RMN quanto por cristalografia ligar o (I) pelos ligantes tiolato moles dos dois resíduos de cisteína, embora um ligante externo adicional também tenha sido proposto^6-8. A relação estrutura-função dessas proteínas tem sido objeto de intensa pesquisa⁹.

No estudo aqui apresentado, um modelo de peptídeo que inclui a sequência conservada de metalochaperonas de cobre foi sintetizado e reagiu com (I) em ambiente inerte. O protocolo apresentado descreve as etapas de determinação da estrutura por RMN, incluindo preparação da amostra, coleta de dados, processamento de dados, geração de estrutura e análise estrutural. A análise foi feita em duas etapas: Primeiro as estruturas foram geradas sem informações sobre o modo de ligação do peptídeo ao íon cobre. Uma vez que o modo de ligação foi estabelecido empiricamente, essas restrições foram introduzidas para fornecer uma estrutura de alta resolução. O modo de ligação é o ponto essencial no modelo e, portanto, foi determinado de maneira imparcial.

A determinação estrutural de RMN de peptídeos modelo é uma técnica extremamente valiosa que é frequentemente usada por químicos e biólogos. Pode ser aplicado com relativa facilidade a diferentes peptídeos sob diferentes condições e, portanto, pode lançar luz sobre mecanismos relevantes¹⁰. A compreensão do processo de elucidação da estrutura fornece uma melhor compreensão dos pontos fortes e fracos das estruturas propostas.

Protocol

1. Preparação da amostra

1. Apo-amostra: Dissolva aproximadamente 1-2 mg do peptídeo em 450-500 μl de solvente de grau NMR deuterado (as soluções preferíveis para amostras biológicas são 10% D2O em água ou d6-DMSO ^11-12 se a amostra não se dissolver em água ou reagir com ela).
2. Amostra reagida com cobre: Dissolver aproximadamente 1-2 mg do peptídeo com uma quantidade equimolar de sal metálico em 450-500 μl do solvente NMR.
3. Filtrar a solução utilizando um vidro de sinterização, papel de filtração ou qualquer outra técnica que se adapte aos compostos sob investigação e não os adsorva. Isso é essencial para remover quaisquer partículas metálicas, o que afetará a homogeneidade.
4. Transfira a solução para um tubo de RMN e feche-o. Certifique-se de que a qualidade do tubo se ajusta à força do ímã usada (para mais detalhes, consulte a tabela de equipamentos).
5. Se a amostra for sensível ao oxigênio, essas etapas devem ser feitas em um ambiente inerte e o tubo vedado para evitar a oxidação.

2. Coleta e processamento de dados de RMN¹³

1. Registre espectros 1D ¹H das amostras reagidas com apo e cobre e compare. O espectro peptídico contendo cobre deve mostrar uma mudança significativa de deslocamento químico na região da amida e os picos foram resolvidos, uma vez que o apopeptídeo é flexível e mostra uma média de conformações, mas ao reagir com o cobre, as amidas peptídicas ligadas têm uma única estrutura (Figura 2).
   1. Se o espectro não for alterado, presume-se que a reação falhou.
   2. Se a amostra ficar verde, o cobre terá oxidado na atmosfera, o que pode alterar suas propriedades de ligação.
   3. Em ambos os casos, a amostra precisará ser refeita.
2. Encontre condições ideais de temperatura para as medições de RMN que forneçam sobreposição mínima dos resíduos de amida com larguras de linha estreitas.
3. Configure os experimentos de RMN COSY¹⁴, TOCSY¹⁵ e NOESY¹⁶ ou ROESY¹⁷ em condições idênticas (temperatura, pH, etc.) e execute em sequência.
   1. Os experimentos COSY (Figura 3) e TOCSY (Figura 4) detectarão interações de ligação de interações próton-próton adjacentes e vizinhas de longo alcance, respectivamente. O espectro COSY fornece informações sobre as correlações HN-Hα, enquanto o espectro TOCSY fornece, além disso, informações sobre HN e outros prótons alifáticos H de resíduos correlacionados.
   2. Os experimentos NOESY e ROESY (Figura 5) detectam a proximidade através do espaço sem dependência de ligações para fornecer informações estruturais. A escolha entre os dois é de acordo com o tamanho efetivo do composto e a intensidade do campo. Algumas dessas combinações fornecem sinais teóricos de zero (Figura 6) e um experimento ROESY terá que ser executado para detectar interações NOE^10,18.
   3. Se a amostra estiver em água, os experimentos precisam ter um componente de supressão de água. Isso é realizado com mais eficiência usando gradientes¹⁹. Neste caso, é vantajoso executar novamente a amostra, uma vez atribuída, em D₂O puro para obter interações com e entre os hidrogênios Hα.
   4. Otimize a duração dos tempos de mistura TOCSY e NOESY ou ROESY executando uma série de experimentos curtos para encontrar o acúmulo máximo de sinal com perda mínima para a difusão de spin. Certifique-se de que esta é a região linear da curva de acúmulo. Os valores comuns para peptídeos em campos de 600 MHz incluem tempos de mistura de cerca de 100 ms para TOCSY e 150 ms para experimentos NOESY ou ROESY.
   5. Execute experimentos 1D entre cada experimento para garantir que a composição da amostra permaneça constante durante a aquisição de dados (Figura 7).
4. Processe os espectros usando funções de apodização apropriadas para obter resolução máxima com perda mínima de intensidade do sinal, adicionando preenchimento zero na dimensão t1.
   1. Corrija ainda mais a linha de base na dimensão F2 e depois F1 com uma função polinomial quadrática.
   2. Calibrar cuidadosamente o desvio químico dos espectros de acordo com os picos de água residual ou DMSO nos respetivos solventes, de acordo com o seu desvio em relação às normas conhecidas (TMSP ou TMS, respetivamente).

3. Atribuição e integração de pico usando SPARKY²⁰

1. Preparar um conjunto de espectros COSY e TOCSY sobrepostos ao espectro NOESY ou ROESY (figura 8).
2. Atribuir todos os picos NOE no espectro de acordo com a metodologia de atribuição sequencial desenvolvida por Wüthrich²¹.
   1. Comece atribuindo picos que se sobrepõem aos sinais TOCSY na região da impressão digital, pois isso facilitará as entradas de atribuição de pico subsequentes com o programa SPARKY (Figura 9). Registre o deslocamento químico de atribuição (Figura 10) e ^{os valores de 3}JHNHα (Figura 11).
3. Traduza picos em restrições de distância e ^{valores de 3}JHNHα em ângulos diedros.
   1. Isso pode ser feito integrando os picos de dentro do programa e traduzindo-os em restrições de distância usando uma interação de distância conhecida (como a distância entre dois prótons do grupo metileno ou átomos de hidrogênio aromáticos de um aminoácido aromático).
   2. Se os picos se sobrepõem e os métodos de integração não podem ser usados, eles podem ser rotulados como forte-médio-fraco-muito fraco por estimativa visual, e essas designações podem ser traduzidas em distâncias de até 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 Å, respectivamente. Isso é mais eficaz no trabalho com peptídeos.
   3. ^Os valores de 3 JHNHα são indicativos de ângulos diedros de acordo com a equação de Karplus, onde a maioria dos valores de acoplamento dados pode resultar de mais de um ângulo diedro. Estes podem ser indicativos de estrutura secundária (hélices ou folhas), bobina aleatória ou médias conformacionais das mesmas. Portanto, é importante usar as restrições com cuidado ou usá-las como confirmação de resultados conformacionais.

4. Cálculos de mecânica molecular para gerar conjunto de estruturas usando XPLOR22

1. Importe as restrições de distância e os ângulos diedros com o formato correto para XPLOR. (Figura 12, apenas restrições inter-residuais). O XPLOR pesquisará o espaço conformacional para encontrar estruturas que aderem a restrições químicas geométricas canônicas, como comprimentos de ligação, ângulos, quiralidade, etc., além das restrições de distância encontradas experimentalmente, para gerar um conjunto no qual nenhum dos parâmetros acima seja violado. Isso constituirá o conjunto inicial.
2. A primeira execução de determinação da estrutura será sem o uso de nenhuma restrição para o metal. Isso mostrará quais resíduos participam da ligação do metal sem qualquer viés. Pule para a etapa 4.4.
3. Além das restrições de distância derivadas de RMN, adicione restrições de ligação de metal aos resíduos determinados.
   1. Adicione parâmetros apropriados para descrever o íon metálico e sua topologia.
   2. As informações físicas apropriadas (massa, comprimentos de ligação com outros átomos, ângulos e parâmetros de repulsão não ligantes) devem ser colocadas no arquivo de parâmetros.
   3. Adicione as informações de vinculação ao arquivo de topologia: Quais vínculos são formados e quebrados e quais encargos formais são alterados como resultado da vinculação.
4. Crie um pequeno conjunto de geralmente 10 membros.
   1. Introduza as restrições gradualmente, começando com interações de backbone a backbone, depois backbone a sidechain, depois interações de sidechain a sidechain e passando de interações intra-residuais e sequenciais para interações de alcance cada vez mais longo. Isso facilita a identificação de erros na atribuição.
   2. Introduzir a energia NOE como um potencial de poço quadrado com uma constante de força constante de 50 kcal/mol•Å². O recozimento simulado deve ser feito com 1.500 etapas de 3 segundos a 1.500 K e 3.000 etapas de 1 segundos durante o resfriamento a 500 K. Finalmente, minimize as estruturas usando a minimização de energia de gradiente conjugado para 4.000 iterações; essas são variáveis que podem ser alteradas no XPLOR.
5. Crie um conjunto final de geralmente 50 membros. Execute as etapas da etapa 4.4 em todo o conjunto.
   1. Relate o número de cada tipo de interação NOE que foram encontrados, conforme mostrado na Figura 13.
6. Crie um conjunto de estruturas que aderem à geometria química canônica e às restrições empíricas derivadas de RMN.
   1. Relate o número total de conformações, o número delas que têm violações das restrições derivadas de NMR e o RMSD de todo o conjunto, tanto o backbone quanto todos os valores RMSD de átomos pesados.

5. Análise de Estrutura

1. O conjunto dissolvido representa o espaço conformacional adotado pelo peptídeo durante a medição da RMN. A flexibilidade local pode mudar em diferentes regiões da molécula e isso pode ser atribuído a razões estruturais ou funcionais (o objetivo da análise estrutural é determinar a base estrutural para a estabilidade e o mecanismo de ação).
   1. Importe todas as conformações da estrutura para o programa MolMol23 para criar um conjunto inicial (Figura 14).
2. Examine o conjunto para determinar a estabilidade local da molécula.
   1. Determine os valores de RMSD de backbone e sidechain selecionando regiões subsequentes de quatro resíduos ao longo da sequência e fazendo com que o programa calcule o RMSD para a estrutura de energia mais baixa ou a média.
   2. Determine quais regiões da molécula mostram estabilidade local (Figura 15) plotando o RMSD local em função da sequência.
   3. Sobreponha o conjunto ao longo desta região da molécula e use este conjunto para análise posterior (Figura 16).
3. Escolha conformações de baixa energia que aderem às restrições derivadas de RMN (não violadas). Estes formarão o “conjunto de baixa energia”.
   1. Relate o número de conformações no conjunto, os critérios para escolhê-las e os valores RMSD conforme definido na etapa 4.6.1.
   2. Se o modo de encadernação de metal já tiver sido determinado, vá para a próxima etapa. Caso contrário: Analise o conjunto de baixa energia e determine quais cadeias laterais residuais estão corretas próximas umas das outras para poder ligar o íon metálico. Uma vez determinados, volte para a etapa 3.3 e refaça a análise incluindo os dados de ligação de cobre (Figura 17 para o conjunto e Figura 18 para o conformador de baixa energia).
4. Examine o conjunto e determine a estrutura secundária local dentro da molécula usando os parâmetros de pesquisa padrão do programa MolMol. As estruturas secundárias são mantidas por ligações de hidrogênio e indicam regiões estáveis da molécula.
   1. Determine a estrutura secundária de cada conformador (Figura 19).
      1. Crie uma tabela da porcentagem de conformadores do conjunto que mostram cada estrutura secundária.
      2. Determine se as regiões da estrutura secundária se sobrepõem às regiões que foram determinadas como as regiões estáveis pelo local-RMSD. Este é frequentemente o caso.
5. Determine distâncias e ligações de hidrogênio dentro da molécula.
   1. Importe o conjunto para o Chimera²⁴.
   2. Use o Chimera para determinar as distâncias intramoleculares entre átomos suspeitos de ligação de metal. Calcule as distâncias médias no conjunto.
   3. Use o Chimera para determinar as ligações de hidrogênio intramoleculares em cada conformador do conjunto (Figura 20), usando os parâmetros padrão de ligação de hidrogênio relaxado (em 20%) do programa.
   4. Crie uma tabela da porcentagem de conformadores do conjunto que mostram cada ligação de hidrogênio. As ligações de hidrogênio que se repetem na maioria das conformações indicam uma ligação estável que aumenta a estabilidade da estrutura.
6. Determine as interações eletrostáticas dentro da molécula.
   1. Identifique interações entre sidechains carregadas.
   2. Crie uma tabela com a porcentagem de conformadores do conjunto que mostram cada interação eletrostática.
7. Calcule a distribuição de potencial eletrostático usando o campo de força Amber²⁵ dentro do programa Delphi²⁶.
   1. Escolha uma única conformação representativa do conjunto no qual realizar os cálculos de potencial eletrostático.
   2. Derive o potencial eletrostático usando a equação de Poisson-Boltzman e um cálculo coulombiano completo. Os parâmetros necessários incluem a força iônica da solução, os valores dielétricos da solução (80 para água; 40 para DMSO); o peptídeo interno (geralmente em torno de 5,0); o tamanho da grade (geralmente 65’65’65 pontos); e a distância mínima entre o peptídeo e a borda da grade (10 Å). Os resultados são geralmente bastante robustos em relação a esses valores, pois o resultado principal é governado pelo próprio peptídeo (Figura 21).
   3. Examine o potencial eletrostático mapeado na superfície de Van der Waals do peptídeo (Figura 22).
   4. Examinar as iso-superfícies de potencial eletrostático, que descrevem posições com o mesmo potencial. Encontre iso-superfícies que sugiram relevância biológica, como superfícies positivas ou negativas estendidas que podem atrair ou repelir outras proteínas ou ligantes, ou distribuições que indicam significância, como distribuição anfipática ou manchas de propriedades diferentes (Figura 23).
8. Resuma todas as descobertas estruturais para ver como elas se reforçam mutuamente.
9. Repita as etapas 4.3 a 5.7.4 quando relevante.

Representative Results

Discussion

The contribution of structural information to understand binding mechanisms is well-accepted. Peptides are useful as models for protein binding and interactions; however they are not amenable to the main method for structure determination, X-ray crystallography. NMR is particularly useful for these systems, since the structures can be readily solved in solution. This is especially for the case of metallochaperone-mimetics that additionally require structure determination under an inert environment to prevent oxidation of the metal ion.

The MTCSGCSRPG peptide, containing the conserved MT/HCXXC motif, bound Cu (I) as was evident by the significant change of spectrum from the apo-form to the peptide reacted with copper. The need for a ROESY experiment at the field of 600 MHz, due to a spectrum with null interactions in the NOESY spectrum, indicates a compact peptide, since our experience shows that smaller peptides of 6-7 residues fall in the null signal of the NOESY regime, but peptides of this size usually give adequate signal. In the ROESY spectrum 81 cross-peaks were observed, N of these were inter-residue cross-peaks and (81-N) were intra-residue cross-peaks. This is a small number of peaks compared to proteins, but is expected in small peptides; Particularly cyclic peptides, which tend to give a small number of interactions since all the sidechains point outward and undergo little interaction with one another.

As the metal itself cannot be detected directly by the ¹H NMR measurements, one must conclude on the metal binding residues from the distances obtained between suspected donor atoms. To assure a reliable structure, no metal-ligand binding constraints should be added to the initial calculations. Previous studies have shown that forcing metal binding in an incorrect form may still lead to reasonable structural factors even if the structure is incorrect¹⁰.

The experiments gave highly nonviolated conformations in an ensemble of low RMSD. The low RMSD of a potentially flexible peptide lends further support for copper binding, which would reduce the conformational flexibility of the molecule. The RMSD values of the binding region were reduced to values around 0.05 Å, which shows tremendous stabilization as expected by the ring closure. The secondary bend and hydrogen-bonding found in the 3-7 region, also indicated binding in this region.

The negative charge obtained when two thiols bind the copper (I) peptide is offset by the N-terminal amine that was held proximate to the bound copper.

When inspecting the resulting distances between potential donor atoms, including the two cysteine residues and the methionine group, the ones located at positions most probable to bind metal were the sidechains of Cys3 and Cys6. Therefore, binding constraints were added between these residues and the metal center, and the resulting structure was evaluated. To further support the resulting structure, various additional control measurements that include preset bonds to other residues may be performed and the structural factors compared. This is especially important where the result of the model is unexpected. In previous studies using similar measurements using protein-mimetic peptides, unusual binding modes were observed, including methionine instead of cysteine⁷.

Excess copper is toxic to biological systems and copper transport is very tightly controlled. Therefore, it is interesting and mechanistically important to understand how copper is transferred from one protein to another. The transport cannot depend on simple release and acquire mechanism, but must somehow include both stronger and weaker modes of binding, much like how one would transfer an object carefully from the fingers of one hand to another. This type of study provides much information regarding the mechanism of copper binding in biological systems and can be used to further investigate many different aspects of metallochaperone activity in nature. The systems may be easily mutated and manipulated to mimic many different aspects of copper-binding in nature, and may be analyzed without using prior assumptions of the binding mode.

Materials

Avance DMX 600 MHz Spectrometer	Bruker
NMR sample tubes 	Wilmad	535-PP
Glove box	MBraun	LM05-019
Lyophilizer  	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Custom made	>95% purity
Copper (1) chloride	Aldrich	224332
Hydrochloric acid	BioLab	231-595-7
Sodium hydroxide	Gadot	1310-73-2
d<sub>6</sub>-Dimethylsulfoxide	Aldrich	236926
Deuterium oxide	Aldrich	151882