Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D 1H

Resumo

A estrutura da solução de RMN de um peptídeo modelo de metalochaperona com (I) foi determinada, e um protocolo detalhado desde a preparação da amostra e coleta de dados 1D e 2D até uma estrutura tridimensional é descrito.

Resumo

A ligação do cobre (I) por proteínas de transporte de metalochaperona evita a oxidação do cobre e a liberação dos íons tóxicos que podem participar de reações redox prejudiciais. O complexo (I) do modelo peptídico de uma proteína metalochaperona ligante a (I), que inclui a sequência MTCSGCSRPG (sublinhado é conservado), foi determinado em solução sob condições inertes por espectroscopia de RMN.

A RMN é uma técnica amplamente aceita para a determinação de estruturas de solução de proteínas e peptídeos. Devido à dificuldade na cristalização para fornecer cristais únicos adequados para cristalografia de raios-X, a técnica de RMN é extremamente valiosa, especialmente porque fornece informações sobre o estado da solução e não sobre o estado sólido. Aqui, descrevemos todas as etapas necessárias para determinações completas da estrutura tridimensional por RMN. O protocolo inclui preparação de amostras em um tubo de RMN, coleta e processamento de dados 1D e 2D, atribuição e integração de picos, cálculos de mecânica molecular e análise de estrutura. É importante ressaltar que a análise foi conduzida pela primeira vez sem ligações metal-ligante predefinidas, para garantir uma determinação confiável da estrutura de maneira imparcial.

Introdução

Os peptídeos são amplamente utilizados como modelos de proteínas, potenciais fármacos e agentes terapêuticos por direito próprio. No entanto, seu pequeno tamanho e alto grau de flexibilidade muitas vezes impedem a determinação da estrutura por raios-X devido a dificuldades na cristalização.

A ressonância magnética nuclear (RMN) pode ser usada para determinar estruturas e interações peptídicas. O método pode fornecer informações sobre a estrutura local e geral, interações de ligação e menor afinidade, e é aplicável a amostras difíceis, pois pode ser feito no estado de solução.

O transporte de cobre em sistemas bio....

Protocolo

1. Preparação da amostra

1. Apo-amostra: Dissolva aproximadamente 1-2 mg do peptídeo em 450-500 μl de solvente de grau NMR deuterado (as soluções preferíveis para amostras biológicas são 10% D2O em água ou d6-DMSO ^11-12 se a amostra não se dissolver em água ou reagir com ela).
2. Amostra reagida com cobre: Dissolver aproximadamente 1-2 mg do peptídeo com uma quantidade equimolar de sal metálico em 450-500 μl do solvente NMR.
3. Filtrar a solução utilizando um vidro de sinterização, papel de filtração ou qualquer outra técnica que se adapte aos compostos sob investigação e não os adsorva. Isso é essencial para remover quaisque....

Resultados

Como parte de um estudo contínuo sobre modelos de proteínas ligadoras de cobre, a estrutura da sequência conservada MT/HCXXC dentro do peptídeo linear MTCSGCSRPG foi determinada por RMN em estado de solução. O peptídeo foi reagido com CuCl em ambiente inerte e o pH foi medido em aproximadamente 3,0 por meio de um papel indicador universal. A região das amidas do peptídeo mostrou uma expansão após a reação com cobre, de 6,7-8,5 para 6,6-9,0 ppm (Figura 2). O alargamento de linha devido à leve oxidação do .......

Discussão

A contribuição da informação estrutural para entender os mecanismos de ligação é bem aceita. Os peptídeos são úteis como modelos para ligação e interações de proteínas; no entanto, eles não são passíveis do principal método de determinação da estrutura, a cristalografia de raios-X. A RMN é particularmente útil para esses sistemas, uma vez que as estruturas podem ser facilmente resolvidas em solução. Isso é especialmente para o caso de metalochaperonas-miméticos que adicionalmente requerem determinação da estrutura em um .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Espectrômetro Avance DMX 600 MHz	Tubos
	Wilmad	535-PP
	MBraun	LM05-019
Liofilizador	VirTis	benchtopK
Peptide	BioChemia	Feito sob medida	>95% de pureza
Cloreto de cobre (1)	Aldrich	224332
Ácido clorídrico	BioLab	231-595-7
Hidróxido de sódio	Gadot	1310-73-2
d6-Dimetilsulfóxido	Aldrich	236926
Óxido de deutério	Aldrich	151882

de amostra de RMN BrukerCaixa de luvas