Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Resumo

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Resumo

Th17 são um subconjunto distinto das células T que foram encontrados para produzir interleucina-17 (IL-17), e diferem em função das outras subpopulações de células T, incluindo Th1, Th2, e células T reguladoras. Th17 surgiram como um culpado central em respostas imunitárias inflamatórias associadas com superzelosos muitas doenças auto-imunes. Neste método purificamos linfócitos T dos baço e linfonodos de camundongos C57BL / 6, e estimular as células T CD4 + purificadas sob controle e ambientes Th17 indutores. O meio de indução de Th17 inclui estimulação na presença de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, IL-6, e do TGF-β. Após incubação durante pelo menos 72 horas e até cinco dias a 37 ° C, as células são subsequentemente analisados ​​para a capacidade de produzir IL-17 por meio de citometria de fluxo, qPCR, e ELISA. Th17 diferenciadas células CD4 + CD25-T pode ser utilizado para elucidar o papel que as células Th17 jogar no aparecimento e progressão de auto-imunidade e de acolhimentofense. Além disso, Th17 diferenciação de CD4 + CD25-linfócitos de modelos nocaute / doença murino distintas podem contribuir para a nossa compreensão da plasticidade destino celular.

Introdução

Os linfócitos T CD4 + (células T) desempenham um papel crítico na defesa mediado pelo sistema imunológico contra microrganismos infecciosos. Por outro lado, as células T são também intimamente associados com o aparecimento e progressão de doenças auto-imunes, tais como diabetes do tipo 1, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatóide. Linfócitos T CD4 + são ativados através de uma combinação de receptor de células T (TCR) interações com antígeno cognato / complexo principal de histocompatibilidade II (MHCII) moléculas e as interações receptor CD28 com B7.1/B7.2 ligantes ^15. Em adição à disposição de estimulação de TCR e CD28 co-estimulação, as células a....

Protocolo

Todo o uso de animais foi conduzido de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e uso.

1. Preparação de Misturas e Mídia

1. Estéril PBS pH: 7.3 (1 L)
   0,23 g de NaH ₂ PO ₄
   1.15 g de Na ₂ HPO ₄
   9,0 g de NaCl
   Tome-se o volume com água DI. Esterilizar com autoclave.
2. Cultura Celular Mídia (100 ml)
   89 ml de RPMI
   10 ml de 10% FBS
   1 ml Antibiótico antimicótica (ABAM) 100 ug de 50 mM de 2-mercaptoetanol (3,5 ug estoque de 2-mercaptoetanol em 96,5 ug PBS)

Resultados

Este protocolo de diferenciação Th17 começa com a remoção do baço e axilar, braquial, mesentérica, do colo do útero, e os nódulos linfáticos inguinais. Uma representação dos locais de cada um pode ser encontrado nas Figuras 2 e 3. As Figuras 1 e 5, tanto fornecer uma representação visual dos métodos descritos neste protocolo.

Este protocolo Th17 centra-se na diferenciação da população de linfócitos CD4 + CD25-T. É importante notar que eficiê.......

Discussão

Aqui nós descrevemos o protocolo para alcançar diferenciação in vitro de células Th17. O estudo de diferenciação Th17 é importante, tal como a diferenciação de linfócitos T no subconjunto Th17 é crítico para a eliminação eficaz de agentes patogénicos humanos ^13. Por outro lado, a produção de IL17 tem sido associada com a progressão da doença auto-imune ^13. O método de diferenciação de células Th17 é aplicável a muitas situações de pesquisa, uma vez que pode ser aplicado a numerosos modelos.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
Placa de Petri de Poliestreno Estéril	Fisher Scientific	0875713A	60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
Lâminas de Microscópio Premium, Fosco	Fisher Scientific	12-544-3	3" x 1"1 mm
5 ml Seringa e Agulha Sem Látex 21G1	BD Biosciences	309632
Corning Tubos de centrífuga de 15 ml	Sigma-Aldrich	CLS430791
Nylon 40 mícrons	Miami Aquaculture	Nylon 40/26
Placa de cultura de tecidos microteste 96 poços fundo em U	BD Biosciences	35-3077
Corning Costar 24 placas de cultura de células de poço	Sigma-Aldrich	CL3524
Eppendorf Tubes 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
Hamster Purificado NA/LE Anti-Mouse CD3e	BD Biosciences	553057
Hamster Purificado NA/LE Anti-Mouse CD28	BD Biosciences	553294
Mouse IL-6 Proteína Recombinante	eBioscience	14-8061-62
TGFbeta	R& D Systems	240-B-002
Solução azul de tripano 0,4	Sigma-Aldrich	66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4	BD Biosciences	558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	553035
PE Conjugado Anti-mouse CD25	eBioscience	E01155-516
Alexa Fluor 700 Rato Anti-rato IL-17	BD Biosciences	560820
Kit Inicial de Coloração de Citocinas Intracelulares-Mouse	BD Biosciences	51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ kit de isolamento de células T reguladoras, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-221
ABAM	Cellgro	30-004-CI
RPMI	Corning, Cellgro	10-040-CM
B 2-Mercapt– thanol	MP Biomedical	194834
Perigoso Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)
Ionomicina Sal de Cálcio	Sigma-Aldrich	13909-1ML
Brefeldin A Perigoso (BFA)	MP Biomedicals	159027
ELISA IL-17A Captura	mAb BD Biosciences	555068
ELISA IL-17A Detecção mAb	BD Biosciences	555067
ELISA IL-17A Standard	eBioscience	14-8171-80
IL-2 ELISA Kit	BD Biosciences	555148
Conjunto de Reagentes de Substrato TMB	BD Biosciences	555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
Centrífuga Sorvall Legend RT+	ThermoScientific
Napco série 8000 WJ Incubadora de CO2	Termociclador ThermoScientific
PTC-200 Peltier	Biorad

%