Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Os linfócitos T CD4 + (células T) desempenham um papel crítico na defesa mediado pelo sistema imunológico contra microrganismos infecciosos. Por outro lado, as células T são também intimamente associados com o aparecimento e progressão de doenças auto-imunes, tais como diabetes do tipo 1, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatóide. Linfócitos T CD4 + são ativados através de uma combinação de receptor de células T (TCR) interações com antígeno cognato / complexo principal de histocompatibilidade II (MHCII) moléculas e as interações receptor CD28 com B7.1/B7.2 ligantes ^15. Em adição à disposição de estimulação de TCR e CD28 co-estimulação, as células apresentadoras de antigénio também proporcionar um ambiente de citocinas, que determina o estado de diferenciação do linfócito T, orientando deste modo a resposta de linfócitos T para o antigénio determinada. Interações patógeno Distinct / célula apresentadora de antígeno criar ambientes de citocinas distintas, que distorcer linfócitos T por caminhos distintos focados na eliminação do patógeno iniciar. Infelizmente, T caminhos linfócitos efetoras, originalmente destinadas a erradicar patógenos invasores, podem ser erroneamente dirigida contra auto-tecidos ^15. Portanto, uma melhor compreensão do estado de diferenciação de cada subconjunto de células T CD4 + distinta é fundamental para a nossa compreensão de como a modular o equilíbrio entre a eliminação de patógenos e tolerância à auto.

Além do tipo Th1, Th2, e T reguladoras vias de diferenciação das células indutiveis, linfócitos T virgens, também pode ser conduzido por baixo da via de citocinas Th17. Considerando que as células Th1 patogénios intracelulares de combate, as células Th2 eliminar agentes patogénicos extracelulares, e células T reguladoras (Tregs) minimizar as respostas inflamatórias ^{1, 16;} Th17 desempenhar um papel importante na eliminação de bactérias extracelulares e fungos. Th17 são geralmente indicados por expressão do factor de transcrição específico da linhagem RORγT e produção de IL-17A, que promove a ativação de macrófagos e neutrófilos ^{1, 7.}

Th17 têm sido implicados em várias doenças auto-imunes, e os seus modelos de roedores associados. Por exemplo, tem sido demonstrado que a IL-23 (que é necessária para sustentar o fenótipo Th17), mas não de IL-12, foi o culpado central em encefalite autoimune experimental (EAE), o modelo de roedor para a doença de MS. Foi posteriormente demonstrado que a redução na produção de IL-17, estão correlacionados com a prevenção de EAE ^{2, 6, 17.} Além disso, as células Th17 têm sido associados com outras doenças auto-imunes, incluindo artrite e lúpus eritematoso sistémico (LES), ^{10, 16.} IL-23 p19 deficiente ^{- / -} murganhos mostraram ter um número muito baixo de células Th17, e são resistentes ao desenvolvimento não só a EAE, mas também artrite induzida por colagénio, um modelo para a artrite reumatóide ^{10, 18.} Além disso, os ratos tratados com anticorpos neutralizantes de IL-17A a réer o aparecimento de artrite induzida por colágeno também foram encontrados para ter resolução das lesões articulares ^18. Deve notar-se que o papel de células Th17 na progressão da doença auto-imune permanece para ser caracterizado como a investigação recente tem mostrado também um papel protector das células Th17 em diabetes do tipo 1 ^{9, 11} e ^{14 de} inflamação intestinal. Estes estudos confirmam a importância da diferenciação Th17 na auto-imunidade.

Na diferenciação Th17 in vitro é um método necessário na pesquisa de células T, porque há pelo menos duas perguntas intrigantes que requerem investigação adicional: 1) Como exatamente IL-6 regulam o equilíbrio entre Treg e diferenciação Th17, e 2) Quais são os mecanismos exatos trás de IL-17 induzida por doenças inflamatórias? Nosso método utiliza células CD4 + CD25-de baço e gânglios linfáticos do C57BL / 6 mouse. É importante notar que, embora seja possível, para induzir a diferenciação de células Th17 usando um impuropopulação, a aquisição de, pelo menos, um puro CD4 + 80% população de células CD25-T nega qualquer preocupação de contaminação e garante mais bem-sucedidos resultados de diferenciação Th17. A fim de conseguir a diferenciação Th17 adequada, as células T CD4 + CD25-T são incubados na presença de anti-CD3 e anti-CD28, que fornecem sinais de activação, 1 e 2, respectivamente, e de IL-6, e TGF-β. Embora tenha sido relatado que a IL-23 por si só pode ser usada para conseguir a diferenciação Th17, que foi mais tarde demonstrado que a IL-23 é necessária para a estabilidade da população de células Th17, mas TGF-β IL-6 e são essenciais para a diferenciação de células Th17 ^{3, 18, ​​19.} Estudos em ratos demonstraram que o receptor de IL-23 é expresso em células T CD4 + apenas depois de terem sido estimuladas com IL-6 e TGF-β ^{13, 18.} Além disso, as células Th17 irá desenvolver com êxito, na presença de anticorpos IL-23 de bloqueio desde que TGF-β IL-6 e que estão presentes ^{18, 19.} Como tal, este protocolo prov diferenciação Th17ides as condições adequadas para induzir com sucesso diferenciação Th17. O desenvolvimento de uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes Th17 diferenciação e a produção de IL-17 apresentam a oportunidade para o desenvolvimento de melhores terapias destinadas a doenças auto-imunes ^13.

Todo o uso de animais foi conduzido de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e uso.

1. Preparação de Misturas e Mídia

1. Estéril PBS pH: 7.3 (1 L)
   0,23 g de NaH ₂ PO ₄
   1.15 g de Na ₂ HPO ₄
   9,0 g de NaCl
   Tome-se o volume com água DI. Esterilizar com autoclave.
2. Cultura Celular Mídia (100 ml)
   89 ml de RPMI
   10 ml de 10% FBS
   1 ml Antibiótico antimicótica (ABAM) 100 ug de 50 mM de 2-mercaptoetanol (3,5 ug estoque de 2-mercaptoetanol em 96,5 ug PBS)
3. FACS Buffer (Fluorescent Ativação celular Classificando) (Para ser usado durante a citometria de fluxo) FBS 2% em PBS estéril
4. iTh17 mistura (com base no número de amostras, determinar o volume necessário para todas as misturas e media)
   1,5 ug / mL de anti-CD28
   20 ng / ml de IL-6
   5 ng / mLTGF-β

2. Células serão semeadas em Triplicate sob as condições a seguir

1. Placa ligados anticorpos anti-CD3, anti-CD28 (isto é a mistura de controlo de activação).
2. iTH17: placa ligada anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.

3. Anti-CD3 ligado à placa (10 ug / ml)

Recomenda-se que a preparação de placas de anti-CD3 ligado à placa é feita, pelo menos, 4 horas antes da hora de células serão adicionados às placas.

1. Adicionar 30 ul de anti-CD3 para poços (anti-CD3 é diluída em PBS estéril) de um novo 96 poços de microtitulação de fundo U placa de cultura de tecido, e tocar os lados da placa para assegurar uma cobertura uniforme das cavidades. Incubar a 37 ° C, durante 4 horas, e, em seguida, leve à geladeira até a hora de adicionar as mixagens e células para a chapa.

4. Rato Dissection

1. Este protocolo baseia-se na utilização de C57BL / 6 mice, 3-8 meses de idade, e adquirido a partir do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME).
2. Sacrifício mouse usando asfixia CO _2, e confirmar a morte com deslocamento cervical posterior.
3. Esterilizar ratos ferramentas de dissecação e área de incisão com etanol 70% e começar a dissecação.
4. Do ponto de vista ventral, agarre a pele que é anterior à abertura da uretra e começar a cortar com uma tesoura a linha média ventral até atingir a área do queixo. Tome precauções para não rasgar ou cortar no forro da parede peritoneal.
5. Puxe a pele e fechar para permitir o acesso confortável para os gânglios linfáticos durante a remoção.
6. Os gânglios linfáticos e baços recolhidos serão todos removidos com uma pinça, e colocado em uma placa de Petri estéril contendo 5 ml de tampão de corrida autoMACS comprado de Miltenyi Biotec (consulte a Figura 2 e 3 para o linfonodo e diagramas de remoção do baço).
   1. Retire os linfonodos axilares que estãoencontrado perto da axila (axila) por trás dos músculos peitorais de cada rato.
   2. Retire os gânglios linfáticos braquial que estão localizados nos tecidos conjuntivos localizados perto de cada axila.
   3. Remover os nódulos linfáticos cervicais superficiais encontrados no pescoço de cada rato.
   4. Remover os nódulos linfáticos inguinais, que estão localizados na região da anca no conjunto dos 3 vasos sanguíneos.
   5. Para acessar os linfonodos mesentéricos, cortados através do revestimento peritoneal até a linha média ventral. Linfonodos mesentéricos são encontrados no tecido conjuntivo que contém os intestinos juntos. Eles são geralmente encontrados em uma série de 4-8 nós e pode aparecer como um "colar de pérolas". Certifique-se de retirar toda a cadeia.
   6. O baço é localizado na região abdominal, atrás do estômago e intestinos. Remova-o puxando e destacando-o do pâncreas.
7. Moer órgãos sob um capuz estéril com 2 lâminas de microscópio fosco. Coloque gânglios linfáticos ou baço emo lado fosco de uma lâmina de microscópio, e esfregue com o lado fosco do segundo slide até que se desintegrou. Repita até que todos os gânglios linfáticos e baço foram moídos.

Nota: Recomenda-se começar com os gânglios linfáticos e terminar com o baço, como o sangue fará com que seja difícil ver os linfonodos restantes no buffer autoMACS.

9. Para filtrar os órgãos de solo em uma suspensão de células individuais, começam por dobragem ao longo de um pedaço de nylon 40 um material diversas vezes, e colocar na parte superior de um tubo de centrífuga de 15 ml. O material de nylon devem ser cerca de 3 cm x 3 cm
10. Use uma seringa de 5 ml e 21 G agulha para aspirar os 5 ml de autoMACS executando órgãos tampão e terrestres. Dispensar lentamente para o material de nylon dobrados. Tome cuidado para evitar a perfuração do material com a agulha.

Observação: Uma vez que a suspensão de célula única é feito, a solução deve aparecer como uma solução clara e consistente sem visible pedaços de tecido sólido. Se permanecer sólidos, re-aspirado e dispensar através de um novo pedaço dobrado de nylon colocado em um novo tubo de centrífuga de 15 ml.

11. Sempre manter as células no gelo quando não estiver em uso.

5. Separação celular

1. Para melhores resultados, obter pelo menos um puro CD4 + 80% da população de células CD25 através autoMACS Separador Pro celular usando o MACS CD4 + CD25 + T regulamentar o isolamento de células kit, mouse. O protocolo para a retenção negativa da população de células T CD4 + CD25 é obtido através de Miltenyi Biotec.

6. Th17 Diferenciação

1. Colete a população CD25 de células CD4 +, após a separação com o autoMACS Pro separador de células.
2. Contagem de células diluído numa razão de 1:1000 com azul de tripano utilizando um hemocitómetro.
3. Uma vez que a concentração foi determinada a partir de contagens de células, dilui-se a suspensão de células a 1 x 10 ⁶ células / ml em meio de cultura celular.
4. Retire placas de 96 poços com placa obrigado anti-CD3 após 4 horas.
5. Lavar as cavidades anti-CD3-revestidas com 200 ul de PBS. Repita duas vezes.
   1. Para lavar adicionar 200 mL de PBS estéril para poços anti-CD3-revestidos e remover PBS em um recipiente de resíduos.
6. Adicionar 100 mL da mistura iTh17 ou mix de controle de ativação (ver ponto n º 2) para os poços em triplicado.
7. Adicionar 100 uL de células para cada poço em que tanto a mistura Th17 ou a mistura de controlo de activação foi colocada.
8. Incubar as células durante pelo menos 72 horas ou até 5 dias (a diferenciação Th17 pode ser obtido após 72 horas ou após 5 dias.)
9. Th17 diferenciação pode ser avaliada por coloração de citometria de fluxo e análise intracelular, ELISA, ou qPCR

7. A ativação celular (somente necessário para coloração intracelular)

1. Remover placas de 96 poços de incubação no final de uma das 72 hr ou 5 dias
   1. Lembre-se que Th17 differentiation pode ser atingida após quer 72 horas ou 5 dias.
2. Para cada condição (por exemplo, controlo de activação ou iTh17), transferir as células que são, em triplicado, para um poço de uma placa de cultura de células 24. As células para uma condição já foram reunidas em um poço da placa de 24 poços de cultura, em vez de ser em triplicado na placa de cultura bem fundo em U 96.
3. O volume total de cada poço na placa de 24 poços de cultura de células é agora de 600 ul. Aumentar o volume de cada poço a 1 ml com o meio de cultura celular.
4. Adicionar PMA (forbol miristato acetato) (50 ng / ml), ionomicina (1 | iM), e BFA (brefeldina A) (10 ug / ml) a cada poço na placa de cultura celular de 24 poços com as concentrações indicadas.
5. Incubar a 37 ° C durante 4 h.

8. A coloração intracelular

1. Células mancha com os marcadores extracelulares e intracelulares desejadas para análise por citometria de fluxo. Para detectar a presença of IL-17, de coloração intracelular é realizado com anticorpos anti-IL-17A. Marcadores de superfície extracelulares recomendados incluem CD4, CD8, e CD25.
   1. Use o intracelular de citocinas Coloração Starter Kit-Rato de BD Bioscience para a coloração de IL-17 intracelular.
   2. Para cada amostra, as células de pelotas, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 uL de tampão de SCAF (SFB a 2% em PBS).
   3. Transferir as células ressuspensas para 96 ​​células por citometria de fluxo de placa.
   4. Girar para baixo células durante 5 min a 1200 rpm e descartar o sobrenadante.
   5. Adicionar 200 ul de tampão PBS FACS, centrifuga-se durante 5 min a 1200 rpm, e rejeitar o sobrenadante.
   6. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS e aplicar 100 ul de anticorpo extracelular (Ab) mistura (mistura Ab extracelular é feita em tampão de SCAF). Incubar por 15 min em temperatura ambiente, coberto com papel alumínio.
   7. Repita a etapa 8.1.4.
   8. Repita o passo 8.1.5 2x.
   9. Ressuspender as células em 100 ul de BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubcomeu por 20 minutos em temperatura ambiente, coberto com papel alumínio.
   10. Adicionar 100 ul de 1x tampão BD Perm / Wash, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm, e rejeitar o sobrenadante. Repetir.
   11. Adicionar 50 ul de mistura de Ab intracelular. (Mistura intracelular Ab é feita em 1x BD Perm / Wash) Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente, coberto com folha de alumínio.
   12. Repita o passo 8.1.10.
   13. Ressuspender as células em 200 mL de BD de coloração Buffer.
   14. Colocar as células ressuspensas em citometria de fluxo tubos contendo 200 ul de Tampão de Coloração BD (volume final é de 400 uL).
   15. Armazenar a 4 ° C, até as amostras estão prontas a ser lido.

9. Análise por citometria de fluxo

1. População de células vivas Gate.
2. Da população de células vivas, portão em CD4 + CD8-população.
3. Do CD8-população CD4 +, portão em IL-17A + população.
   1. Com base em nossos resultados experimentais anteriores, 100% da população + IL-17A será CD25 +.

* Contagens de células absolutas totais foram obtidos após reunir as triplicatas das amostras
** Número absoluto de células CD4 + CD25 + IL-17A + foi determinado multiplicando o número total de células por a percentagem portão vivo e a percentagem do total de células que carregam os marcadores específicos de linhagem, CD4, CD25 e IL-17A, tal como determinada por citometria de fluxo.

10. qPCR e ELISA

1. Colocar as células não utilizado para a análise de citometria de fluxo em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e centrifugar a 13000 rpm durante 5-10 min. As células presentes no sedimento celular após centrifugação vai ser utilizado para a análise de qPCR. A análise foi realizada utilizando qPCR PTC-200 Peltier termociclador (Biorad).
2. Recolher o sobrenadante dos tubos centrifugados para os testes ELISA. IL-17A ELISA foram realizados utilizando par de anticorpos TC11-18h10 (captura, código 555068) e TC11-8H4 biotina (detecção, código 555067) adquirido da BD Biosciences. IL-17A ELISA standards foram obtidos a partir de eBioscience (número de catálogo 14-8171-80).
3. Depois de retirar o sobrenadante, ressuspender as células restantes a serem utilizados para qPCR em 175 mL de tampão de lise RNA (usar imediatamente para a extração de RNA, síntese de cDNA, e qPCR, ou armazenar a -80 ° C para uso posterior).
   1. Consulte a Tabela II para seqüências de primers para IL-17A e actina (gene casa de manutenção)

Este protocolo de diferenciação Th17 começa com a remoção do baço e axilar, braquial, mesentérica, do colo do útero, e os nódulos linfáticos inguinais. Uma representação dos locais de cada um pode ser encontrado nas Figuras 2 e 3. As Figuras 1 e 5, tanto fornecer uma representação visual dos métodos descritos neste protocolo.

Este protocolo Th17 centra-se na diferenciação da população de linfócitos CD4 + CD25-T. É importante notar que eficiência da separação celular autoMACS Pro enriquece o CD4 + CD25-desejada população a partir do nó de linfa total de interligação e do baço (Figura 4). A, nó não fraccionada reunidas linfa e esplenócitos, e as fracções autoMACS-separadas foram coradas com anticorpos antiCD4 antiCD25 e seguido de análise de citometria de fluxo (Figura 4). Figura 4A mostra um perfil representativo da percentagem de células T CD4 + CD25 +e CD4 + CD25 linfócitos presentes nos nodos, não fraccionadas reunidas linfáticos e do baço, por citometria de fluxo. O processo de isolamento também proporciona uma população de células CD4 + CD25 + Treg enriquecido a partir de ratinhos C57BL / 6, que pode ser utilizado em experiências adicionais (Figura 4B). Figura 4C mostra o enriquecimento de células desejada com uma população que é 84% de células T CD4 + CD25-, com a grande maioria das células T CD4 + CD25 + removido. Temos consistentemente ter uma população de células não-pequenas linfóide que está presente no T CD4 + CD25-enriquecido, mas que não interferem com o processo de diferenciação (Figura 4C). Nossa população de células CD4 + CD25-T enriquecido ajuda a garantir uma diferenciação Th17 mais bem sucedido.

A Figura 5 mostra um diagrama esquemático do nosso processo de diferenciação Th17. Nossa enriquecido CD4 + CD25-população ou é incubada sob condições de diferenciação Th17 (anti-CD3, anti-CD28, IL-6, e TGF-β) ou de controlo (anti-CD3, anti-CD28). Pode ser visto na Figura 6 que, enquanto a incubação de linfócitos T CD4 + CD25-T com anti-CD3, anti-CD28, durante 5 dias produziram linfócitos CD25 +, a incubação sob condições de indução Th17 produziu um subconjunto de IL17 produção de linfócitos T CD4 + CD25 +. Por favor, consulte a Tabela 1 para exemplos de CD4 + CD25 + IL-17A + rendimentos número de células absolutas após incubação de 5 dias sob condições iTh17.

Estado de diferenciação Th17 podem ainda ser avaliados através de PCR quantitativo e ELISA. Figura 7 apresenta dados de enriquecidos linfócitos CD4 + CD25-incubados sob controle ou condições Th17 indutores. Os linfócitos T CD4 + CD25-incubados sob condições Th17-regulam IL17A, o que pode ser determinado através de qPCR (figura 7A) e ELISA (Figura 7B). O factor de transcrição específico da Th17 RORγT também é regulada por células T CD4 + CD25-incubados sob condições Th17 indutores, e pode ser determinado thrOugh qPCR (figura 7A).

Figura 1. Th17 Diferenciação esquemática. 1. Poços do revestimento de L-placa de 96 poços de fundo com anti-CD3 (10 ng / ml) diluído em PBS. 2. Colocar a placa na incubadora durante 4 horas a 37 ° C. Enquanto placa está incubando, dissecar os linfonodos (LN) e do baço de rato. Moer órgãos e filtrar para obter uma suspensão de célula única. Isolar células CD4 + CD25-utilizando o Kit de isolamento de células CD4 + CD25 + Regulatory T e Miltenyi autoMACS Pro Separador. As células-T CD4 + CD25 + devem ser diluídas a 1 x 10 6 células / ml. 3. Após 4 horas de incubação da placa de 96 poços é completa, lavar os poços com PBS (200 ul / poço) 3x. 4. Adicionar 100 ul de células CD4 + células CD25-a placa-bound (PB) anti-CD3 poços revestidos 5.. Adicione 100 l anti-CD28 ou 100 l iTh17 cocktail (antiCD28, TGF-β, e IL-6). 6. Incubar a placa durante 3 ou 5 dias a 37 ° C. Após a incubação avaliar a diferenciação por coloração intracelular, qPCR, e / ou ELISA.

Figura 2. Guia Dissecção LN. A) linfonodo 1 braquial podem ser encontrados no tecido conjuntivo localizado perto de cada axila (axila) do rato. B) nódulo linfático axilar 1 pode ser encontrada em cada axila, por trás dos músculos peitorais. C) nódulos linfáticos mesentéricos são localizados em no tecido conjuntivo dos intestinos. Eles se assemelhar a um colar de pérolas. D) 4 nódulos linfáticos cervicais superficiais são encontrados no pescoço do rato. E) 2 nodos linfáticos inguinais (um em cada lado) pode estar localizado na região da anca no local em que três vasos sanguíneos correspondem .

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Figura 3. Spleen guia de dissecação. Rato baços são encontrados no lado esquerdo do corpo atrás do estômago e intestinos. Basta retirar puxando e separando com a pinça.

Figura 4. Frações celulares de LN combinada e células do baço antes e depois de células autoMACS separação Pro. A) LN e baço foram coradas, ex vivo, para estabelecer populações de células basais antes da separação. Após a separação, + CD25-(C) fracções CD4 T CD4 + CD25 + (B), e foram coradas para avaliar a pureza das populações de linfócitos CD4 + CD25-T CD4 + CD25 +, e, respectivamente. Todas as amostras foram coradas com CD4 + e CD25 + anticorpos e analisadas por citometria de fluxo.

Figura 6. Diferenciação Th17 avaliada por citometria de fluxo. Os linfócitos T CD4 + CD25-T foram incubadas na presença de anti-CD3 ligado à placa, anti-CD28, IL-6, e TGF-β (iTh17) ou prato ligado anti-CD3 e anti-CD28 (controlo) para 5 dias. As células foram, em seguida, activadas com PMA e ionomicina durante 4 h a 37 ° C. Após a activação, as células foram coradas com anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 e anticorpos anti-IL-17A para a análise de citometria de fluxo para avaliar a diferenciação Th17. iTh17 = Th17 induzir cCONDIÇÕES.

Figura 7. Diferenciação Th17 avaliada por qPCR e ELISA. Linfócitos de ratinhos C57BL / 6 foram separadas e as células T CD4 + CD25-T foram incubadas na presença de anti-CD3 (10 ng / mL) ligados a placas, anti-CD28 (1,5 ug / ml ), IL-6 (20 ng / ml), e TGF-β (5 ng / ml) ou prato ligado anti-CD3 e anti-CD28 sozinho (controlo), durante 5 dias. A) As células foram então colhidas para avaliar RORγT e expressão de mensagem de IL-17A através de qPCR. B) Os sobrenadantes foram colhidos para avaliar a expressão da proteína IL-17A por ELISA.

Não há divulgações a declarar.