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Artigo de método

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

34K vistas

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DOI:

10.3791/50765

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26 de setembro de 2013

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1Department of Microbiology and Cell Science, The University of Florida

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Resumo

Th17 são um subconjunto distinto das células T que foram encontrados para produzir interleucina-17 (IL-17), e diferem em função das outras subpopulações de células T, incluindo Th1, Th2, e células T reguladoras. Th17 surgiram como um culpado central em respostas imunitárias inflamatórias associadas com superzelosos muitas doenças auto-imunes. Neste método purificamos linfócitos T dos baço e linfonodos de camundongos C57BL / 6, e estimular as células T CD4 + purificadas sob controle e ambientes Th17 indutores. O meio de indução de Th17 inclui estimulação na presença de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, IL-6, e do TGF-β. Após incubação durante pelo menos 72 horas e até cinco dias a 37 ° C, as células são subsequentemente analisados ​​para a capacidade de produzir IL-17 por meio de citometria de fluxo, qPCR, e ELISA. Th17 diferenciadas células CD4 + CD25-T pode ser utilizado para elucidar o papel que as células Th17 jogar no aparecimento e progressão de auto-imunidade e de acolhimentofense. Além disso, Th17 diferenciação de CD4 + CD25-linfócitos de modelos nocaute / doença murino distintas podem contribuir para a nossa compreensão da plasticidade destino celular.

Introdução

Os linfócitos T CD4 + (células T) desempenham um papel crítico na defesa mediado pelo sistema imunológico contra microrganismos infecciosos. Por outro lado, as células T são também intimamente associados com o aparecimento e progressão de doenças auto-imunes, tais como diabetes do tipo 1, lúpus eritematoso sistémico e artrite reumatóide. Linfócitos T CD4 + são ativados através de uma combinação de receptor de células T (TCR) interações com antígeno cognato / complexo principal de histocompatibilidade II (MHCII) moléculas e as interações receptor CD28 com B7.1/B7.2 ligantes 15. Em adição à disposição de estimulação de TCR e CD28 co-estimulação, as células apresentadoras de antigénio também proporcionar um ambiente de citocinas, que determina o estado de diferenciação do linfócito T, orientando deste modo a resposta de linfócitos T para o antigénio determinada. Interações patógeno Distinct / célula apresentadora de antígeno criar ambientes de citocinas distintas, que distorcer linfócitos T por caminhos distintos focados na eliminação do patógeno iniciar. Infelizmente, T caminhos linfócitos efetoras, originalmente destinadas a erradicar patógenos invasores, podem ser erroneamente dirigida contra auto-tecidos 15. Portanto, uma melhor compreensão do estado de diferenciação de cada subconjunto de células T CD4 + distinta é fundamental para a nossa compreensão de como a modular o equilíbrio entre a eliminação de patógenos e tolerância à auto.

Além do tipo Th1, Th2, e T reguladoras vias de diferenciação das células indutiveis, linfócitos T virgens, também pode ser conduzido por baixo da via de citocinas Th17. Considerando que as células Th1 patogénios intracelulares de combate, as células Th2 eliminar agentes patogénicos extracelulares, e células T reguladoras (Tregs) minimizar as respostas inflamatórias 1, 16; Th17 desempenhar um papel importante na eliminação de bactérias extracelulares e fungos. Th17 são geralmente indicados por expressão do factor de transcrição específico da linhagem RORγT e produção de IL-17A, que promove a ativação de macrófagos e neutrófilos 1, 7.

Th17 têm sido implicados em várias doenças auto-imunes, e os seus modelos de roedores associados. Por exemplo, tem sido demonstrado que a IL-23 (que é necessária para sustentar o fenótipo Th17), mas não de IL-12, foi o culpado central em encefalite autoimune experimental (EAE), o modelo de roedor para a doença de MS. Foi posteriormente demonstrado que a redução na produção de IL-17, estão correlacionados com a prevenção de EAE 2, 6, 17. Além disso, as células Th17 têm sido associados com outras doenças auto-imunes, incluindo artrite e lúpus eritematoso sistémico (LES), 10, 16. IL-23 p19 deficiente - / - murganhos mostraram ter um número muito baixo de células Th17, e são resistentes ao desenvolvimento não só a EAE, mas também artrite induzida por colagénio, um modelo para a artrite reumatóide 10, 18. Além disso, os ratos tratados com anticorpos neutralizantes de IL-17A a réer o aparecimento de artrite induzida por colágeno também foram encontrados para ter resolução das lesões articulares 18. Deve notar-se que o papel de células Th17 na progressão da doença auto-imune permanece para ser caracterizado como a investigação recente tem mostrado também um papel protector das células Th17 em diabetes do tipo 1 9, 11 e 14 de inflamação intestinal. Estes estudos confirmam a importância da diferenciação Th17 na auto-imunidade.

Na diferenciação Th17 in vitro é um método necessário na pesquisa de células T, porque há pelo menos duas perguntas intrigantes que requerem investigação adicional: 1) Como exatamente IL-6 regulam o equilíbrio entre Treg e diferenciação Th17, e 2) Quais são os mecanismos exatos trás de IL-17 induzida por doenças inflamatórias? Nosso método utiliza células CD4 + CD25-de baço e gânglios linfáticos do C57BL / 6 mouse. É importante notar que, embora seja possível, para induzir a diferenciação de células Th17 usando um impuropopulação, a aquisição de, pelo menos, um puro CD4 + 80% população de células CD25-T nega qualquer preocupação de contaminação e garante mais bem-sucedidos resultados de diferenciação Th17. A fim de conseguir a diferenciação Th17 adequada, as células T CD4 + CD25-T são incubados na presença de anti-CD3 e anti-CD28, que fornecem sinais de activação, 1 e 2, respectivamente, e de IL-6, e TGF-β. Embora tenha sido relatado que a IL-23 por si só pode ser usada para conseguir a diferenciação Th17, que foi mais tarde demonstrado que a IL-23 é necessária para a estabilidade da população de células Th17, mas TGF-β IL-6 e são essenciais para a diferenciação de células Th17 3, 18, ​​19. Estudos em ratos demonstraram que o receptor de IL-23 é expresso em células T CD4 + apenas depois de terem sido estimuladas com IL-6 e TGF-β 13, 18. Além disso, as células Th17 irá desenvolver com êxito, na presença de anticorpos IL-23 de bloqueio desde que TGF-β IL-6 e que estão presentes 18, 19. Como tal, este protocolo prov diferenciação Th17ides as condições adequadas para induzir com sucesso diferenciação Th17. O desenvolvimento de uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes Th17 diferenciação e a produção de IL-17 apresentam a oportunidade para o desenvolvimento de melhores terapias destinadas a doenças auto-imunes 13.

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Protocolo

Todo o uso de animais foi conduzido de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e uso.

1. Preparação de Misturas e Mídia

  1. Estéril PBS pH: 7.3 (1 L)
    0,23 g de NaH 2 PO 4
    1.15 g de Na 2 HPO 4
    9,0 g de NaCl
    Tome-se o volume com água DI. Esterilizar com autoclave.
  2. Cultura Celular Mídia (100 ml)
    89 ml de RPMI
    10 ml de 10% FBS
    1 ml Antibiótico antimicótica (ABAM) 100 ug de 50 mM de 2-mercaptoetanol (3,5 ug estoque de 2-mercaptoetanol em 96,5 ug PBS)
  3. FACS Buffer (Fluorescent Ativação celular Classificando) (Para ser usado durante a citometria de fluxo) FBS 2% em PBS estéril
  4. iTh17 mistura (com base no número de amostras, determinar o volume necessário para todas as misturas e media)
    1,5 ug / mL de anti-CD28
    20 ng / ml de IL-6
    5 ng / mLTGF-β

2. Células serão semeadas em Triplicate sob as condições a seguir

  1. Placa ligados anticorpos anti-CD3, anti-CD28 (isto é a mistura de controlo de activação).
  2. iTH17: placa ligada anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β.

3. Anti-CD3 ligado à placa (10 ug / ml)

Recomenda-se que a preparação de placas de anti-CD3 ligado à placa é feita, pelo menos, 4 horas antes da hora de células serão adicionados às placas.

  1. Adicionar 30 ul de anti-CD3 para poços (anti-CD3 é diluída em PBS estéril) de um novo 96 poços de microtitulação de fundo U placa de cultura de tecido, e tocar os lados da placa para assegurar uma cobertura uniforme das cavidades. Incubar a 37 ° C, durante 4 horas, e, em seguida, leve à geladeira até a hora de adicionar as mixagens e células para a chapa.

4. Rato Dissection

  1. Este protocolo baseia-se na utilização de C57BL / 6 mice, 3-8 meses de idade, e adquirido a partir do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME).
  2. Sacrifício mouse usando asfixia CO 2, e confirmar a morte com deslocamento cervical posterior.
  3. Esterilizar ratos ferramentas de dissecação e área de incisão com etanol 70% e começar a dissecação.
  4. Do ponto de vista ventral, agarre a pele que é anterior à abertura da uretra e começar a cortar com uma tesoura a linha média ventral até atingir a área do queixo. Tome precauções para não rasgar ou cortar no forro da parede peritoneal.
  5. Puxe a pele e fechar para permitir o acesso confortável para os gânglios linfáticos durante a remoção.
  6. Os gânglios linfáticos e baços recolhidos serão todos removidos com uma pinça, e colocado em uma placa de Petri estéril contendo 5 ml de tampão de corrida autoMACS comprado de Miltenyi Biotec (consulte a Figura 2 e 3 para o linfonodo e diagramas de remoção do baço).
    1. Retire os linfonodos axilares que estãoencontrado perto da axila (axila) por trás dos músculos peitorais de cada rato.
    2. Retire os gânglios linfáticos braquial que estão localizados nos tecidos conjuntivos localizados perto de cada axila.
    3. Remover os nódulos linfáticos cervicais superficiais encontrados no pescoço de cada rato.
    4. Remover os nódulos linfáticos inguinais, que estão localizados na região da anca no conjunto dos 3 vasos sanguíneos.
    5. Para acessar os linfonodos mesentéricos, cortados através do revestimento peritoneal até a linha média ventral. Linfonodos mesentéricos são encontrados no tecido conjuntivo que contém os intestinos juntos. Eles são geralmente encontrados em uma série de 4-8 nós e pode aparecer como um "colar de pérolas". Certifique-se de retirar toda a cadeia.
    6. O baço é localizado na região abdominal, atrás do estômago e intestinos. Remova-o puxando e destacando-o do pâncreas.
  7. Moer órgãos sob um capuz estéril com 2 lâminas de microscópio fosco. Coloque gânglios linfáticos ou baço emo lado fosco de uma lâmina de microscópio, e esfregue com o lado fosco do segundo slide até que se desintegrou. Repita até que todos os gânglios linfáticos e baço foram moídos.

Nota: Recomenda-se começar com os gânglios linfáticos e terminar com o baço, como o sangue fará com que seja difícil ver os linfonodos restantes no buffer autoMACS.

  1. Para filtrar os órgãos de solo em uma suspensão de células individuais, começam por dobragem ao longo de um pedaço de nylon 40 um material diversas vezes, e colocar na parte superior de um tubo de centrífuga de 15 ml. O material de nylon devem ser cerca de 3 cm x 3 cm
  2. Use uma seringa de 5 ml e 21 G agulha para aspirar os 5 ml de autoMACS executando órgãos tampão e terrestres. Dispensar lentamente para o material de nylon dobrados. Tome cuidado para evitar a perfuração do material com a agulha.

Observação: Uma vez que a suspensão de célula única é feito, a solução deve aparecer como uma solução clara e consistente sem visible pedaços de tecido sólido. Se permanecer sólidos, re-aspirado e dispensar através de um novo pedaço dobrado de nylon colocado em um novo tubo de centrífuga de 15 ml.

  1. Sempre manter as células no gelo quando não estiver em uso.

5. Separação celular

  1. Para melhores resultados, obter pelo menos um puro CD4 + 80% da população de células CD25 através autoMACS Separador Pro celular usando o MACS CD4 + CD25 + T regulamentar o isolamento de células kit, mouse. O protocolo para a retenção negativa da população de células T CD4 + CD25 é obtido através de Miltenyi Biotec.

6. Th17 Diferenciação

  1. Colete a população CD25 de células CD4 +, após a separação com o autoMACS Pro separador de células.
  2. Contagem de células diluído numa razão de 1:1000 com azul de tripano utilizando um hemocitómetro.
  3. Uma vez que a concentração foi determinada a partir de contagens de células, dilui-se a suspensão de células a 1 x 10 6 células / ml em meio de cultura celular.
  4. Retire placas de 96 poços com placa obrigado anti-CD3 após 4 horas.
  5. Lavar as cavidades anti-CD3-revestidas com 200 ul de PBS. Repita duas vezes.
    1. Para lavar adicionar 200 mL de PBS estéril para poços anti-CD3-revestidos e remover PBS em um recipiente de resíduos.
  6. Adicionar 100 mL da mistura iTh17 ou mix de controle de ativação (ver ponto n º 2) para os poços em triplicado.
  7. Adicionar 100 uL de células para cada poço em que tanto a mistura Th17 ou a mistura de controlo de activação foi colocada.
  8. Incubar as células durante pelo menos 72 horas ou até 5 dias (a diferenciação Th17 pode ser obtido após 72 horas ou após 5 dias.)
  9. Th17 diferenciação pode ser avaliada por coloração de citometria de fluxo e análise intracelular, ELISA, ou qPCR

7. A ativação celular (somente necessário para coloração intracelular)

  1. Remover placas de 96 poços de incubação no final de uma das 72 hr ou 5 dias
    1. Lembre-se que Th17 differentiation pode ser atingida após quer 72 horas ou 5 dias.
  2. Para cada condição (por exemplo, controlo de activação ou iTh17), transferir as células que são, em triplicado, para um poço de uma placa de cultura de células 24. As células para uma condição já foram reunidas em um poço da placa de 24 poços de cultura, em vez de ser em triplicado na placa de cultura bem fundo em U 96.
  3. O volume total de cada poço na placa de 24 poços de cultura de células é agora de 600 ul. Aumentar o volume de cada poço a 1 ml com o meio de cultura celular.
  4. Adicionar PMA (forbol miristato acetato) (50 ng / ml), ionomicina (1 | iM), e BFA (brefeldina A) (10 ug / ml) a cada poço na placa de cultura celular de 24 poços com as concentrações indicadas.
  5. Incubar a 37 ° C durante 4 h.

8. A coloração intracelular

  1. Células mancha com os marcadores extracelulares e intracelulares desejadas para análise por citometria de fluxo. Para detectar a presença of IL-17, de coloração intracelular é realizado com anticorpos anti-IL-17A. Marcadores de superfície extracelulares recomendados incluem CD4, CD8, e CD25.
    1. Use o intracelular de citocinas Coloração Starter Kit-Rato de BD Bioscience para a coloração de IL-17 intracelular.
    2. Para cada amostra, as células de pelotas, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 200 uL de tampão de SCAF (SFB a 2% em PBS).
    3. Transferir as células ressuspensas para 96 ​​células por citometria de fluxo de placa.
    4. Girar para baixo células durante 5 min a 1200 rpm e descartar o sobrenadante.
    5. Adicionar 200 ul de tampão PBS FACS, centrifuga-se durante 5 min a 1200 rpm, e rejeitar o sobrenadante.
    6. Ressuspender as células em 100 ul de tampão de FACS e aplicar 100 ul de anticorpo extracelular (Ab) mistura (mistura Ab extracelular é feita em tampão de SCAF). Incubar por 15 min em temperatura ambiente, coberto com papel alumínio.
    7. Repita a etapa 8.1.4.
    8. Repita o passo 8.1.5 2x.
    9. Ressuspender as células em 100 ul de BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubcomeu por 20 minutos em temperatura ambiente, coberto com papel alumínio.
    10. Adicionar 100 ul de 1x tampão BD Perm / Wash, centrifugar durante 5 minutos a 1.200 rpm, e rejeitar o sobrenadante. Repetir.
    11. Adicionar 50 ul de mistura de Ab intracelular. (Mistura intracelular Ab é feita em 1x BD Perm / Wash) Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente, coberto com folha de alumínio.
    12. Repita o passo 8.1.10.
    13. Ressuspender as células em 200 mL de BD de coloração Buffer.
    14. Colocar as células ressuspensas em citometria de fluxo tubos contendo 200 ul de Tampão de Coloração BD (volume final é de 400 uL).
    15. Armazenar a 4 ° C, até as amostras estão prontas a ser lido.

9. Análise por citometria de fluxo

  1. População de células vivas Gate.
  2. Da população de células vivas, portão em CD4 + CD8-população.
  3. Do CD8-população CD4 +, portão em IL-17A + população.
    1. Com base em nossos resultados experimentais anteriores, 100% da população + IL-17A será CD25 +.

* Contagens de células absolutas totais foram obtidos após reunir as triplicatas das amostras
** Número absoluto de células CD4 + CD25 + IL-17A + foi determinado multiplicando o número total de células por a percentagem portão vivo e a percentagem do total de células que carregam os marcadores específicos de linhagem, CD4, CD25 e IL-17A, tal como determinada por citometria de fluxo.

10. qPCR e ELISA

  1. Colocar as células não utilizado para a análise de citometria de fluxo em um tubo Eppendorf de 1,5 ml e centrifugar a 13000 rpm durante 5-10 min. As células presentes no sedimento celular após centrifugação vai ser utilizado para a análise de qPCR. A análise foi realizada utilizando qPCR PTC-200 Peltier termociclador (Biorad).
  2. Recolher o sobrenadante dos tubos centrifugados para os testes ELISA. IL-17A ELISA foram realizados utilizando par de anticorpos TC11-18h10 (captura, código 555068) e TC11-8H4 biotina (detecção, código 555067) adquirido da BD Biosciences. IL-17A ELISA standards foram obtidos a partir de eBioscience (número de catálogo 14-8171-80).
  3. Depois de retirar o sobrenadante, ressuspender as células restantes a serem utilizados para qPCR em 175 mL de tampão de lise RNA (usar imediatamente para a extração de RNA, síntese de cDNA, e qPCR, ou armazenar a -80 ° C para uso posterior).
    1. Consulte a Tabela II para seqüências de primers para IL-17A e actina (gene casa de manutenção)

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Resultados

Este protocolo de diferenciação Th17 começa com a remoção do baço e axilar, braquial, mesentérica, do colo do útero, e os nódulos linfáticos inguinais. Uma representação dos locais de cada um pode ser encontrado nas Figuras 2 e 3. As Figuras 1 e 5, tanto fornecer uma representação visual dos métodos descritos neste protocolo.

Este protocolo Th17 centra-se na diferenciação da população de linfócitos CD4 + CD25-T. É importante notar que eficiê...

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Discussão

Aqui nós descrevemos o protocolo para alcançar diferenciação in vitro de células Th17. O estudo de diferenciação Th17 é importante, tal como a diferenciação de linfócitos T no subconjunto Th17 é crítico para a eliminação eficaz de agentes patogénicos humanos 13. Por outro lado, a produção de IL17 tem sido associada com a progressão da doença auto-imune 13. O método de diferenciação de células Th17 é aplicável a muitas situações de pesquisa, uma vez que pode ser aplicado a numerosos modelos...

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Divulgações

Não há divulgações a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado em parte pelo NIH / NCATS clínica e translacional Ciência para a Universidade da Flórida TL1 TR000066 e UL1 TR000064, um suplemento diversidade de Pais Grant R01AI056152 do Instituto Nacional de Saúde, um subsídio reagente BD Biosciences, e da Universidade da Flórida.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagent/Material
Placa de Petri de Poliestreno EstérilFisher Scientific0875713A60 mm x 15 mm
autoMACS Running BufferMiltenyi Biotec130-091-221
Lâminas de Microscópio Premium, FoscoFisher Scientific12-544-33" x 1"1 mm
5 ml Seringa e Agulha Sem Látex 21G1BD Biosciences309632
Corning Tubos de centrífuga de 15 mlSigma-AldrichCLS430791
Nylon 40 mícronsMiami AquacultureNylon 40/26
Placa de cultura de tecidos microteste 96 poços fundo em U BD Biosciences35-3077
Corning Costar 24 placas de cultura de células de poçoSigma-AldrichCL3524
Eppendorf Tubes 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Hamster Purificado NA/LE Anti-Mouse CD3eBD Biosciences553057
Hamster Purificado NA/LE Anti-Mouse CD28BD Biosciences553294
Mouse IL-6 Proteína RecombinanteeBioscience14-8061-62
TGFbetaR& D Systems240-B-002
Solução azul de tripano 0,4Sigma-Aldrich66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4BD Biosciences558107
APC Rat Anti-Mouse CD8aBD Biosciences553035
PE Conjugado Anti-mouse CD25eBioscienceE01155-516
Alexa Fluor 700 Rato Anti-rato IL-17BD Biosciences560820
Kit Inicial de Coloração de Citocinas Intracelulares-MouseBD Biosciences51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ kit de isolamento de células T reguladoras, mouseMiltenyi Biotec130-091-221
ABAM Cellgro30-004-CI
RPMICorning, Cellgro10-040-CM
B 2-Mercapt– thanolMP Biomedical194834
Perigoso Phorbol 12-Miristato 13-Acetato (PMA)
Ionomicina Sal de CálcioSigma-Aldrich13909-1ML
Brefeldin A Perigoso (BFA)MP Biomedicals159027
ELISA IL-17A Captura mAb BD Biosciences555068
ELISA IL-17A Detecção mAb BD Biosciences555067
ELISA IL-17A StandardeBioscience14-8171-80
IL-2 ELISA KitBD Biosciences555148
Conjunto de Reagentes de Substrato TMB BD Biosciences555214
Equipment
autoMACS Pro Cell SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
Centrífuga Sorvall Legend RT+ThermoScientific
Napco série 8000 WJ Incubadora de CO2Termociclador ThermoScientific
PTC-200 PeltierBiorad
%

Referências

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