Recuperação de antígeno induzida por calor: um método eficaz para detectar e identificar tipos de células progenitoras durante a neurogênese do hipocampo adulto

Resumo

Durante a neurogênese do hipocampo adulto, um conjunto distinto de marcadores genéticos é expresso quando uma célula-tronco neural quiescente progride sequencialmente e se desenvolve em um neurônio funcionalmente integrado no circuito. Usando a recuperação de antígeno induzida por calor, os tipos de células progenitoras que são difíceis de detectar são identificados com maior eficácia.

Resumo

Os métodos tradicionais de imuno-histoquímica (IHQ) após a fixação do tecido permitem a visualização de vários tipos de células. Estes normalmente procedem com a aplicação de anticorpos para ligar antígenos e identificar células com características que são uma função da biologia e desenvolvimento inerentes. A neurogênese do hipocampo adulto é um processo sequencial em que uma célula-tronco neural quiescente pode ser ativada e prosseguir através de estágios de proliferação, diferenciação, maturação e integração funcional. Cada fase é distinta com uma morfologia característica e regulação positiva de genes. A identificação dessas fases é importante para entender os mecanismos regulatórios em jogo e quaisquer alterações nesse processo que fundamentam a fisiopatologia dos transtornos debilitantes. Nossa abordagem de recuperação de antígeno induzida por calor melhora a intensidade do sinal detectado e permite a identificação correta do tipo de célula progenitora. Conforme discutido neste artigo, ele nos permite contornar especialmente os problemas atuais na detecção de certos tipos de células progenitoras.

Introdução

A neurogênese, a geração de novos neurônios a partir de células-tronco neurais, agora é conhecida por ocorrer constantemente na idade adulta em duas regiões especializadas do cérebro. Estes incluem a zona subventricular (SVZ) do bulbo olfatório e a zona subgranular (SGZ) do giro dentado no hipocampo. Na última década, o campo da neurogênese do hipocampo adulto teve um trabalho significativo. A região tem atraído muito interesse, uma vez que os neurônios recém-nascidos na SGZ contribuem para aumentar a plasticidade neural que pode sustentar funções cerebrais específicas^1-5. A neurogênese do hipocampo adulto tem sido implicada em desempenhar papéis importantes na regulação do humor, regeneração, aprendizado e memória. Assim, tem havido um esforço conjunto para entender o desenvolvimento e a regulação dos neurônios neste rico nicho neurogênico.

Um aspecto inevitável e importante do estudo da neurogênese do hipocampo adulto é a identificação de estágios separados pelos quais uma célula-tronco neural ativada passa em seu caminho para se tornar um neurônio totalmente funcional. Nesse processo, a célula-tronco neural quiescente é ativada e prossegue por meio de uma série de tipos de células progenitoras ativas precoces e ativas tardias (Figura 1). Essas populações distintas de progenitores neurais podem ser identificadas pela morfologia e sua expressão de marcadores moleculares como MCM2, nestina, Tbr2 e Doublecortin (DCX) e NeuN que orientam a conversão de RGLs em seus respectivos tipos de células progenitoras. Nestin é uma proteína de filamento intermediário que é expressa nas células semelhantes à glia radial e em alguns tipos de células progenitoras iniciais. Outro marcador é o Tbr2, que é especificamente expresso nas células progenitoras amplificadoras. A expressão do transgene Tbr2 é inicialmente desligada nas células do tipo 1 (como a glia radial), ativada nos progenitores do tipo 2a, tipo 2ab e tipo 2b e desligada entre os neurônios mais diferenciados do tipo 3 e imaturos (Figura 1). DCX é um marcador de migração neuronal que é expresso nos progenitores neurais Tipo 2ab, Tipo 2b e Tipo 3. Usando essa combinação de três marcadores, podemos rotular subtipos distintos de progenitores neurais. Estes incluem o tipo 1 (MCM2+nestina+Tbr2-), o tipo 2a (MCM2+nestina+Tbr2+), o tipo 2ab (MCM2+nestina-Tbr2+ parcial e MCM2+Tbr2+DCX-), o tipo 2b (MCM2+Tbr2+DCX+) e o tipo 3 (MCM2+Tbr2-DCX+). Células pós-mitóticas, como os neurônios imaturos e funcionalmente integrados, podem ser identificadas utilizando DCX e o marcador neuronal maduro, NeuN.

Os métodos tradicionais de IHC utilizam anticorpos para identificar antígenos para tipos específicos de células com base em sua expressão gênica. A visualização subsequente por meio de técnicas de imagem de alta resolução, como a microscopia confocal, pode ser utilizada para sua identificação. No entanto, atualmente existem problemas com esses métodos que não permitem a identificação eficiente das células semelhantes à glia radial e dos primeiros tipos de células progenitoras. É difícil identificar esses tipos de células específicos porque o anticorpo aplicado não é capaz de penetrar e se ligar eficientemente à proteína nestina. Nestin é a proteína de filamento intermediário que compreende os processos radiais produzidos pela célula radial semelhante à glia. A ligação ineficiente de um anticorpo ao antígeno pode ser resultado de muitos fatores, incluindo tempo de fixação, temperatura e técnica utilizada^6-7. Para ajudar a resolver esses problemas, desenvolvemos um método de recuperação de antígeno ou "fervura". Além da nestina, este método de recuperação de antígeno também melhora a coloração para outros marcadores, como Ki67, BrdU, proteína glial fibrilar ácida (GFAP), Tbr2 e MCM2. Nosso método combina abordagens químicas e físicas. Envolve a fixação química do tecido em paraformaldeído e subsequente ebulição em alta temperatura de finas seções coronais do hipocampo em um tampão de um tratamento desnaturante e caotrópico. Isso aumenta a acessibilidade do antígeno ao anticorpo, melhora a especificidade do anticorpo e permite uma melhor identificação dos tipos de células progenitoras. Nossa abordagem é simples de usar, exigindo principalmente ferramentas e reagentes já disponíveis no laboratório. Nós o utilizamos extensivamente para estudar o desenvolvimento de células-tronco neurais e sua regulação por meio de fatores ambientais genéticos ou extrínsecos intrínsecos⁸.

Protocolo

1. Pré-imuno-histoquímica: perfusão e histologia

1. Perfundir camundongos de acordo com um protocolo transcárdico geral adaptado para camundongos e extrair os cérebros em paraformaldeído a 4% (PFA)⁹.
2. Deixar o cérebro em PFA durante a noite a 4 °C (por exemplo, um tubo cónico de 10 ml cheio de PFA). Mantenha em PFA por pelo menos 12-24 horas, não mais do que 36 horas para fixação completa. Após a fixação durante a noite, esvazie o PFA do tubo cônico, mas deixe o cérebro dentro. Despeje 30% de sacarose no tubo e lave os cérebros por breves 5 segundos para remover qualquer PFA residual. Finalmente, encha o tubo contendo cérebros com 30% de sacarose novamente. Mantenha os cérebros em sacarose a 4 ° C até que os cérebros afundem no fundo do tubo.
3. Corte seções cerebrais de 40 μm em um micrótomo. Consulte um atlas do cérebro de camundongos para começar a coletar seções desde o início do giro dentado até o fim. Conservar secções em solução anticongelante (uma receita simples é 300 g de sacarose em 500 ml de PBS 0,1 M e 300 ml de etilenoglicol) até estarem prontas para a imuno-histoquímica.
4. Monte o tecido cortado em lâminas de microscópio projetadas especificamente para aderir fortemente ao tecido. Essas lâminas fornecem uma forte fixação ao tecido durante o estágio de ebulição. Depois de montar o tecido, deixe a lâmina secar por 10 min ou até que esteja totalmente seca. A secagem pode ser acelerada se a lâmina estiver apoiada contra uma superfície vertical com a borda inferior da lâmina em uma toalha de papel. Se mais de uma lâmina estiver sendo montada, a (s) outra (s) lâmina (s) podem ser deixadas secas durante esse tempo (1-2 horas está bem) até que estejam prontas para prosseguir para a próxima etapa.
5. Quando a lâmina estiver seca, lave com PBS três vezes por 5 min cada e seque novamente (tampão PBS = 0,137 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,0119 M Na₂PO₄). Isso garante que qualquer produto químico anterior (como glicerol da solução de armazenamento anticongelante) seja suficientemente removido e não prejudique a aderência do tecido à lâmina.

2. Preparação de Reagentes e Equipamentos Menores

1. Prepare a Solução A (0,1 M ou 19,21 g/l de ácido cítrico) e a Solução B (0,1 M ou 24,9 g/l de citrato de trissódio) nas quais as seções de tecido serão fervidas.
2. Numa garrafa graduada, misturar 9 ml de solução A e 41 ml de solução B. Adicionar 450 ml de ddH₂O a esta mistura.
3. Despeje esta mistura em um recipiente vazio (por exemplo, uma caixa vazia de pontas de pipeta) que seja seguro para micro-ondas.

3. Recuperação de antígeno induzida por calor

1. Ferva a solução feita na etapa 2 por 5 min na configuração padrão em um micro-ondas padrão. A solução começará a ferver a uma temperatura igual ou superior a 100 °C.
2. Quando a fervura estiver concluída, remova cuidadosamente o recipiente do micro-ondas e coloque as lâminas secas nele, garantindo que a face da lâmina com as seções do hipocampo esteja voltada para baixo e totalmente exposta ao líquido. Se possível, coloque as lâminas em ângulo contra as paredes da caixa e empilhe outras lâminas ao redor delas. Certifique-se de que seu "encaixe" dentro da caixa esteja apertado para que os slides não tenham espaço para se mover um sobre o outro.
3. Ferva esta mistura com lâminas por 7 min nas configurações padrão no micro-ondas. A solução irá ferver durante este tempo a uma temperatura igual ou superior a 100 °C.
4. Durante este estágio de ebulição, encha dois baldes de gelo até a metade com gelo.
5. Quando a fervura na etapa 3.3 estiver concluída, retire o recipiente do micro-ondas e coloque-o dentro de um dos baldes de gelo. Despeje o resto do gelo do outro balde ao redor do recipiente e cubra-o completamente. Deixe descansar por 1 hora.

4. Coloração de anticorpos primários e secundários

1. Ao final do período de espera de 1 hora, remova as lâminas do recipiente e lave com tampão TBS-T 3x por 5 min cada. Qualquer aparelho pode ser usado para realizar essas lavagens básicas. (Tampão TBS = 50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, TBS-T = 0,05% Triton X-100 TBS tampão, TBS-TT = 4% tampão TBS-T de soro de burro).
2. Após a lavagem, deixe as lâminas secarem em um local escuro (por exemplo, dentro de uma gaveta de bancada, coloque uma toalha de papel dentro da gaveta e incline a lâmina contra ela) por 5-10 min ou até que a lâmina esteja totalmente seca. Durante este período, prepare uma câmara para coloração noturna de anticorpos primários. Uma câmara de coloração simples pode incluir um recipiente com grande área de superfície preenchido com ddH₂O e um estágio dentro do recipiente, sobre o qual a lâmina pode ser apoiada acima do ddH₂O.
3. Depois que a lâmina secar, desenhe um contorno ao redor das seções de tecido usando uma caneta repelente de água. Durante a etapa 4.5, esse contorno atua como uma barreira que impede que a mistura de anticorpos flua.
4. Preparar a mistura de anticorpos primários em TBS-TT. São necessários pelo menos 500 μl para cobrir uma lâmina inteira, por exemplo, se o estoque de anticorpos estiver na concentração de 1:500, adicione 1 μl de anticorpo específico a 500 μl de TBS-TT). Utilize anticorpos primários conforme mencionado na tabela de reagentes.
5. Coloque a lâmina seca em cima do stage na câmara de coloração. Adicione 500 μl dos anticorpos primários lentamente e cubra toda a superfície. Cubra todo o aparelho e embrulhe em papel alumínio para bloquear a luz externa. Deixe descansar durante a noite em temperatura ambiente.
6. No dia seguinte, lave a lâmina três vezes por 5 min cada com tampão TBS-T. Deixe secar em uma área escura, conforme descrito na etapa 4.2.
7. Preparar uma mistura de anticorpos secundários semelhante ao passo 4.4. Consulte a tabela de reagentes para anticorpos secundários.
8. Coloque a lâmina seca na câmara de coloração conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.5. Adicione 500 μl dos anticorpos secundários lentamente e cubra toda a superfície. Enrole a câmara de coloração em papel alumínio para protegê-la da luz externa. Deixe-o coberto e protegido da luz externa por pelo menos 2 horas em temperatura ambiente.
9. Após a conclusão da coloração secundária, lave a lâmina três vezes por 5 min cada com tampão TBS-T. Deixe a lâmina secar em uma área escura. Após a secagem, coloque a solução de montagem e cubra a corrediça com uma lamínula evitando cuidadosamente qualquer introdução de bolhas. Deixe a lâmina descansar em uma área escura por pelo menos 2 horas antes da análise subsequente.
10. Realize lapso de tempo ou análise confocal no tecido corado.

Resultados

A neurogênese hipocampal adulta é um processo sequencial no qual o tipo representativo de célula progenitora em cada estágio pode ser identificado por meio de uma combinação de marcadores. A fixação química cuidadosa e a recuperação de antígenos melhoram a eficácia e a detecção de marcadores que, de outra forma, seriam difíceis de identificar. Um desses marcadores é a nestina, expressa nas células-tronco neurais semelhantes a glia radial e em alguns tipos precoces de células progenitoras ativas. A nestina pode ser uma pr...

Discussão

As etapas mais críticas para a recuperação e coloração bem-sucedidas de antígenos de tipos de células progenitoras são: 1) utilização de tecido bem perfundido e fixado com a espessura coronal ideal; 2) permitir tempo suficiente para a ebulição e subsequente resfriamento durante a recuperação do antígeno; 3) destreza manual na montagem de cortes coronais fixos e prevenção de danos ao fazê-lo.

É fundamental na IHQ usar tecido perfundido que tenha sido submetido a fixação suficiente, mas não a fi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
SuperFrost Plus Slide	Fisherbrand	12-550-15	Fornece forte aderência ao tecido do hipocampo durante a fervura
PVA/DABCO Mídia de montagem	Sigma Aldrich	10981-100 ml
Nestin (frango)	Aves Lab	NES	Marcador de células-tronco neurais
GFAP (coelho)	Dako North America	Z033401-2	Marcador de células-tronco neurais e astrócitos
MCM2 (camundongo)	Laboratório de Transdução BD	610701	Marcador
de proliferação DCX (cabra)	Santa Cruz Biotechnology	SC8066	Marcador de neurônio imaturo
Tbr2 (coelho)	Abcam	Ab23345	Marcador progenitor amplificador
NeuN (camundongo)	Millipore	MAB377	Marcador de neurônio maduro
Cy2 (anti-coelho)	Jackson Immunoresearch	111-226-047
Cy2 (anti-frango)	Jackson Immunoresearch	303-165-006
Cy5 (anti-mouse)	Jackson Immunoresearch	315-175-047
Cy5 (anti-cabra)	Jackson Immunoresearch	305-165-047
DAPI	Life Technologies Corporation	D1306
Dako Pen	S2002	Dako	Caneta repelente de água