Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Resumo

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Resumo

Os esforços têm sido focados no desenvolvimento de ensaios in vitro para o estudo de microvasos porque estudos em animais in vivo é mais demorado, caro e de observação e quantificação são muito desafiante. No entanto, em ensaios in vitro convencional microvasos têm limitações quando representar microvasos in vivo no que diz respeito a geometria tridimensional (3D) e fornecer o fluxo de fluido contínuo. Usando uma combinação de técnicas de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica, temos desenvolvido um multi-profundidade reendotelizados transversais circulares microcanais-on-a-chip, que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob perfusão contínua controlada fluxo. Um fotosensitivo refluído positivo foi usada para fabricar um molde mestre, com uma rede de microcanais transversal semicircular. No alinhamento e união das duas (PDMS) microcanais polidimetilsiloxano replicated do molde mestre, uma rede de microcanais cilíndrico foi criado. Os diâmetros dos microcanais pode ser bem controlada. Além disso, as células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) semeadas dentro do chip mostraram que as células revestidas a superfície interior dos microcanais em perfusão controlada duradouro durante um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas.

Introdução

Microvasos, como uma parte do sistema de circulação, medeiam as interacções entre o sangue e os tecidos, suporta as actividades metabólicas, definir microambiente do tecido, e desempenham um papel fundamental em muitos estados patológicos e de saúde. Recapitulação de microvasos funcionais in vitro pode fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, em ensaios convencionais microvasos in vitro, tais como ensaios de migração de células endoteliais, ensaios de formação de tubos endoteliais e de rato e ensaios de anel da aorta do rato, são incapazes de recriar o microvasos in vivo no que diz respei....

Protocolo

1. Fotolitografia Fabricação de Moldes Mestre Photoresist

O protocolo seguinte ilustra o processo para fabricar os microcanais com diâmetros entre 30-60 um. Para obter um microcanal com um diâmetro mais pequeno (inferior a 30 um), numa única rotação de revestimento de material fotosensitivo é necessário.

1. Transferir o material fotosensitivo de refluxo do frigorífico a 4 ° C e a sala limpa 24 horas antes da utilização e permitir que aqueça até à temperatura ambiente.
2. Limpar uma bolacha de silício e cozê-la durante uma hora a 150 ° C, para permitir que a desidratar. A desidratação irá ajudar a adesão fotossensível à base....

Resultados

A nossa abordagem para fabricar a rede de microcanais múltiplos profundidade imita as geometrias complexas 3D de microvasos in vivo, em que os microcanais têm secções transversais arredondadas ^15. Além disso, os diâmetros dos canais de ramificação-mãe e os canais filha aproximadamente obedecem à lei de Murray, para manter o fluxo do fluido em um nível requerido de modo que a resistência global do canal é baixa e velocidades de fluxo são mais uniforme em toda a rede de ^16-18. Os processos e.......

Discussão

1. Fabricação de moldes Mestre

Um dos princípios orientadores para a concepção e morfometria vascular é conhecida como lei de Murray, ^16, que afirma que a distribuição dos diâmetros dos vasos em toda a rede é regida por contrapartida mínima de energia. Afirma também que o cubo dos diâmetros de um navio-mãe a uma bifurcação é igual à soma dos cubos dos diâmetros dos vasos filha (

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Desenvolvedor	AZ Electronic Materials AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Meio de Cultura	Invitrogen	10372-019
Coloração de núcleos NacBlue	Invitrogen	H1399
PKH Mancha vermelha	Sigma	MINI26 e PKH26GL
Fibronectina	Gibco	PHE0023
L-Glutamina	Sigma	G7513
Solução salina tamponada com fosfato	Invitrogen	14040-133
HEPES tamponado solução salina	Lonza	CC-5024
Tripsina / EDTA	Invitrogen	25300-062
Solução Neutralizante de Tripsina	Lonza	CC-5002
Agente de Cura PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana Primária	Lonza	CC-2517
Soro Bovino Fetal	Lonza	14-501F
Diluente C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, pontas de prova moleculares	R37605
Dextran	Sigma	95771
15710-S		microscopia eletrônica	do paraformaldeído de 3,5%
Equipment
Spinner	Corporação	WS-400BZ-6NPP/ das tecnologias de Laurell
	Produtos BelArt	999320237
Microscópio Invertido	Sistema de	Eclipse Ti
	Aparelho Harvard Aparelho	PHD Capuz de
Laminar	Thermo Scientific	1300 Series A2
Misturador Centrífugo Planetário	Thinky	ARE-310
Forno Isotemp	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscópio Óptico	Zeiss	Invertoskop 40C
Limpador de Plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Placa Quente	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscópio Confocal de Varredura a Laser	Zeiss	LSM 510

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