Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Summary

Uma plataforma de microcanais-on-a-chip foi desenvolvido pela combinação da técnica fotolitográfica refluído fotossensível, litografia macia, e microfluidos. A plataforma de microcanais reendotelizados imita a geometria tridimensional (3D) de microvasos in vivo, é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada, permite a imagem de alta qualidade e em tempo real, e pode ser aplicado para a pesquisa microvascular.

Abstract

Os esforços têm sido focados no desenvolvimento de ensaios in vitro para o estudo de microvasos porque estudos em animais in vivo é mais demorado, caro e de observação e quantificação são muito desafiante. No entanto, em ensaios in vitro convencional microvasos têm limitações quando representar microvasos in vivo no que diz respeito a geometria tridimensional (3D) e fornecer o fluxo de fluido contínuo. Usando uma combinação de técnicas de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica, temos desenvolvido um multi-profundidade reendotelizados transversais circulares microcanais-on-a-chip, que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob perfusão contínua controlada fluxo. Um fotosensitivo refluído positivo foi usada para fabricar um molde mestre, com uma rede de microcanais transversal semicircular. No alinhamento e união das duas (PDMS) microcanais polidimetilsiloxano replicated do molde mestre, uma rede de microcanais cilíndrico foi criado. Os diâmetros dos microcanais pode ser bem controlada. Além disso, as células primárias endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) semeadas dentro do chip mostraram que as células revestidas a superfície interior dos microcanais em perfusão controlada duradouro durante um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas.

Introduction

Microvasos, como uma parte do sistema de circulação, medeiam as interacções entre o sangue e os tecidos, suporta as actividades metabólicas, definir microambiente do tecido, e desempenham um papel fundamental em muitos estados patológicos e de saúde. Recapitulação de microvasos funcionais in vitro pode fornecer uma plataforma para o estudo de fenômenos vasculares complexos. No entanto, em ensaios convencionais microvasos in vitro, tais como ensaios de migração de células endoteliais, ensaios de formação de tubos endoteliais e de rato e ensaios de anel da aorta do rato, são incapazes de recriar o microvasos in vivo no que diz respeito à geometria tridimensional (3D) e controlo de fluxo contínuo ^1-8. Estudos de microvasos com modelos animais e em ensaios in vivo, tais como o ensaio de angiogénese da córnea, pinto corioalantóico ensaio de angiogénese da membrana e ensaio de tampão de Matrigel, são mais demorado, alto custo, um desafio no que diz respeito à observação e quantificação, elevantar questões éticas ^{1, 9-13.}

Avanços em Microfabricação e tecnologias de chips microfluídicos têm permitido uma variedade de insights sobre ciências biomédicas, enquanto reduzindo os altos custos experimentais e as complexidades associadas com animais e estudos in vivo ^{de 14,} como condições biológicas de forma fácil e rigidamente controlada e ambientes fluidos dinâmicos, que não teriam foi possível com as técnicas convencionais macroescala.

Aqui, apresentamos uma abordagem para a construção de uma reendotelizados microcanais-on-a-chip que imita a geometria 3D in vivo microvasos e é executado sob fluxo de perfusão contínua controlada usando a combinação da técnica de fotolitografia reflowable photoresist, litografia macia e microfluídica.

Protocol

1. Fotolitografia Fabricação de Moldes Mestre Photoresist

O protocolo seguinte ilustra o processo para fabricar os microcanais com diâmetros entre 30-60 um. Para obter um microcanal com um diâmetro mais pequeno (inferior a 30 um), numa única rotação de revestimento de material fotosensitivo é necessário.

1. Transferir o material fotosensitivo de refluxo do frigorífico a 4 ° C e a sala limpa 24 horas antes da utilização e permitir que aqueça até à temperatura ambiente.
2. Limpar uma bolacha de silício e cozê-la durante uma hora a 150 ° C, para permitir que a desidratar. A desidratação irá ajudar a adesão fotossensível à base de silício.
3. Spin-revestir a primeira camada de material fotosensitivo utilizando a seguinte receita:

Passo	Tempo (segundos)	Velocidade (rpm)	Aceleração
1	2	300	maior
2	10	0
3	3	300	maior
4	60	600	maior
5	10	500	maior
6	10	600	maior

4. Em seguida, coze a bolacha numa placa de aquecimento com uma temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Após a cozer suave da espessura do material fotosensitivo será de 20-30 ^ m.
5. Girar revestimento de uma segunda camada de material fotosensitivo seguindo a mesma receita utilizada para a primeira camada.
6. Assar a bolacha Mole novamente, colocando-o numa placa de aquecimento com uma temperatura de 110 ° C durante 90 seg. Após este coza suave da espessura do material fotosensitivo será de 40-60 ^ m.
7. Gerar padrões de mestre positivos expondo o photoresist à luz UV com uma dose de exposição de 14.500 mJ / cm ^2, por meio de uma máscara de filme.
8. Dilui-se com o desenvolvedor desionizada (DI), água (1:2 (v / v)). Lavar a bolacha repetidamente na solução até que o padrão está completamente desenvolvido. Em seguida, lave o wafer com água DI e seque-o com gás nitrogênio.
9. Refluxo: Coloque a bolacha numa placa de aquecimento com uma temperatura de 120 ° C durante 4 min e com uma tampa de uma placa de Petri de vidro para evitar a evaporação do solvente. Retire o wafer do fogão e deixe esfriar à temperatura ambiente. A espessura do material fotosensitivo após o refluxo será de 50-60 ^ m.

2. Fabricação de litografia suave de PDMS Microcanal Rede

1. Preparar a solução de polidimetilsiloxano (PDMS) com a proporção em peso de 10:01 (base: agente de cura) e misture bem utilizando um misturador planetário centrífuga.
2. Lançai a solução PDMS para o molde mestre photoresist refluído. Colocar o PDMS fundido num exsicador durante 15 min para desgaseificar. Use azoto gasoso para remover quaisquer bolhas restantes, se necessário.
3. Asse o PDMS numa estufa a uma temperatura de 60 ° C durante 3 horas para permitir a cura. Em seguida, retire a camada de PDMS curada do molde mestre.
4. É um perfurador aguçado para criar os orifícios de entrada / saída por furos de perfuração na rede de canais. Limpar a superfície do PDMS usando gás azoto.
5. Trate duas camadas de PDMS com plasma de oxigênio por 30 segundos dentro de um aspirador de plasma a uma pressão de operação de 4,5 x 10 ^-2 Torr e uma taxa de fluxo de oxigênio de 3,5 pés ³ / min. Em seguida, alinhar as superfícies do PDMS manualmente sob um microscópio óptico. Use uma gota de água se necessário, para um melhor controlo do alinhamento.
6. Asse o dispositivo num forno a 60 ° C durante 30 min para conseguir a ligação permanente.

3. Cultura HUVEC e propagação no Chip

1. Cultura das HUVECs com meio de cultura com L-glutamina, suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS). Por diaforam usadas passagens electrónicos experimentais entre 2 e 5.
2. Uma vez que as HUVECs são confluentes, a contagem das células e colhem-lhes, em primeiro lugar a lavagem das células com solução salina tamponada com HEPES (HEPES-BSS) e, em seguida, tratar as células com tripsina / EDTA e incubar durante 2-6 min a 37 ° C. Após a tripsinização é completa, neutralizar a tripsina / EDTA com uma solução de neutralização de tripsina. Centrifugar e suspender as células em meio de cultura com 8% de dextrano para recolhê-las. Dextrano foi usada para aumentar a viscosidade média para ajudar na melhor semeadura de células e do acessório.
3. Tratar o dispositivo com plasma de oxigénio durante 5 min com uma pressão de serviço de 4,5 x 10 ^-2 Torr e uma taxa de fluxo de oxigénio de 3,5 ft ³ / min. Em seguida, carregar o dispositivo com água DI e tratar com luz UV por 8 horas em um laminar capa de biossegurança para a esterilização.
4. Um dia antes das células estão prontas, o dispositivo de lavagem com 1 x tampão fosfato salino (PBS 1x) e depois o revestimento com fibronectina (100 ug / ml, dilbuído com PBS 1x) e incubar no frigorífico a 4 ° C durante a noite.
5. Depois do revestimento com a fibronectina, o dispositivo de lavagem com 1x PBS, em seguida, carregar com meio de cultura. Incubar o dispositivo a uma temperatura de 37 ° C durante 15 min.
6. Carregar as células HUVEC em meio de cultura de 8% de dextrano com uma concentração celular de 3-4 x 10 ⁶ células / ml. Coloque uma gota de 20 ul de células a uma entrada do dispositivo e inclinar-se a introdução das células no interior do canal microfluídico. Depois de 15-20 minutos as células começarão a anexar as paredes laterais dos canais. Girar o dispositivo a cada 15 minutos para criar uma distribuição mais uniforme das células. Se necessário, uma carga adicional pode ser executada.

4. Configuração de perfusão de longo prazo

Depois de 5-6 horas de cultura estática, os HUVECs anexados vai começar a espalhar totalmente. Configure perfusão usando um sistema de bomba de seringa controle remoto com um fluxo constante de 10 mL / h. A perfusão pode ser ajustada fou uma taxa de fluxo mais elevada, e pode durar por um período de tempo entre 4 dias a 2 semanas.

5. Coloração celular e Caracterização Microscópio

1. Quando as células atingem confluência no interior do dispositivo, em primeiro lugar, o dispositivo de lavagem com 1x PBS para remover completamente o meio. Em seguida, carregar o aparelho com corante vermelho diluído com diluente (4 ul-1 ml). Carregar o corante semelhante ao procedimento de carregamento da célula. Incubar o dispositivo no escuro durante 5 min à temperatura ambiente, e, em seguida, o dispositivo de lavagem com meio de cultura para parar a coloração. Comprida incubação do corante pode causar toxicidade celular e disadhesion.
2. Carregar o dispositivo com o corante azul diluída com PBS 1x (2 gotas por ml). Incubar no escuro durante 5 min à temperatura ambiente e depois lavar com o dispositivo de 1x PBS.
3. Examine a coloração de células em microscópio óptico invertido. Se a coloração era bom, carregar os microcanais com meio de fixação (3,5% paraformaldeído diluído com PBS 1x), em seguida submergiro dispositivo de fixação no suporte e cobri-lo completamente com folha de alumínio. Armazenar o dispositivo no frigorífico a uma temperatura de 4 ° C para evitar que o dispositivo de secagem e fotobranqueamento. O dispositivo fixo está agora pronto para imagiologia confocal, o que pode ser feito por um microscópio de varrimento de laser confocal.

Results

A nossa abordagem para fabricar a rede de microcanais múltiplos profundidade imita as geometrias complexas 3D de microvasos in vivo, em que os microcanais têm secções transversais arredondadas ^15. Além disso, os diâmetros dos canais de ramificação-mãe e os canais filha aproximadamente obedecem à lei de Murray, para manter o fluxo do fluido em um nível requerido de modo que a resistência global do canal é baixa e velocidades de fluxo são mais uniforme em toda a rede de ^16-18. Os processos e...

Discussion

1. Fabricação de moldes Mestre

Um dos princípios orientadores para a concepção e morfometria vascular é conhecida como lei de Murray, ^16, que afirma que a distribuição dos diâmetros dos vasos em toda a rede é regida por contrapartida mínima de energia. Afirma também que o cubo dos diâmetros de um navio-mãe a uma bifurcação é igual à soma dos cubos dos diâmetros dos vasos filha (

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
Reflow Photoresist	AZ Electronic Materials	AZP4620
Desenvolvedor	AZ Electronic Materials AZ	400K
PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
MCDB 131 Meio de Cultura	Invitrogen	10372-019
Coloração de núcleos NacBlue	Invitrogen	H1399
PKH Mancha vermelha	Sigma	MINI26 e PKH26GL
Fibronectina	Gibco	PHE0023
L-Glutamina	Sigma	G7513
Solução salina tamponada com fosfato	Invitrogen	14040-133
HEPES tamponado solução salina	Lonza	CC-5024
Tripsina / EDTA	Invitrogen	25300-062
Solução Neutralizante de Tripsina	Lonza	CC-5002
Agente de Cura PDMS	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana Primária	Lonza	CC-2517
Soro Bovino Fetal	Lonza	14-501F
Diluente C	Sigma	CGLDIL
Hoechst33342	Invitrogen, pontas de prova moleculares	R37605
Dextran	Sigma	95771
15710-S		microscopia eletrônica	do paraformaldeído de 3,5%
Equipment
Spinner	Corporação	WS-400BZ-6NPP/ das tecnologias de Laurell
	Produtos BelArt	999320237
Microscópio Invertido	Sistema de	Eclipse Ti
	Aparelho Harvard Aparelho	PHD Capuz de
Laminar	Thermo Scientific	1300 Series A2
Misturador Centrífugo Planetário	Thinky	ARE-310
Forno Isotemp	Fisher Scientific	13-246-516GAQ
Microscópio Óptico	Zeiss	Invertoskop 40C
Limpador de Plasma	Harrick Plasma	PDC-32G
Placa Quente	Barnstead/Thermolyne Cimarec	SP131635
Microscópio Confocal de Varredura a Laser	Zeiss	LSM 510