Identificação de populações específicas de neurônios sensoriais para estudo de canais iônicos expressos

Resumo

Os neurônios sensoriais aferentes sinalizam informações sensoriais da periferia para o sistema nervoso central. A identificação de neurônios aferentes específicos ajudará na compreensão de sua fisiologia. Descrevemos um método de marcação retrógrada para identificar neurônios aferentes e estudamos os canais iônicos dependentes de voltagem nesses neurônios usando eletrofisiologia e imunocitoquímica de patch clamp.

Resumo

Os neurônios sensoriais transmitem sinais de várias partes do corpo para o sistema nervoso central. O soma para esses neurônios está localizado nos gânglios da raiz dorsal que revestem a coluna vertebral. Compreender os receptores e canais expressos por esses neurônios aferentes sensoriais pode levar a novas terapias para doenças. O passo inicial é identificar o subconjunto específico de neurônios sensoriais de interesse. Aqui descrevemos um método para identificar neurônios aferentes que inervam os músculos por marcação retrógrada usando um corante fluorescente DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina). Compreender a contribuição dos canais iônicos para a excitação dos aferentes musculares pode ajudar a controlar melhor a excitabilidade excessiva induzida por certos estados de doença, como doença vascular periférica ou insuficiência cardíaca. Usamos duas abordagens para identificar os canais iônicos dependentes de voltagem expressos por esses neurônios, eletrofisiologia de patch clamp e imunocitoquímica. Embora a eletrofisiologia mais bloqueadores farmacológicos possam identificar tipos funcionais de canais iônicos, usamos imunocitoquímica para identificar canais para os quais bloqueadores específicos não estavam disponíveis e para entender melhor o padrão de distribuição de canais iônicos na população de células. Essas técnicas podem ser aplicadas a outras áreas do sistema nervoso para estudar grupos neuronais específicos.

Introdução

Os gânglios da raiz dorsal (DRG) são compostos de soma de neurônios aferentes que inervam várias partes do corpo, e insights importantes podem ser obtidos com o estudo de neurônios sensoriais com diferentes alvos de inervação¹. Vários métodos indiretos ou invasivos são usados para isolar e identificar neurônios aferentes para, por exemplo, injetar o nervo com marcadores como fluoroouro¹, injetar corante nos músculos pelo método cirúrgico². Dos diferentes corantes que foram usados com sucesso para marcar neurônios e tratos neuronais, os corantes fluorescentes como o DiI são amplamente utilizados em traçados neuroanatômicos devido à sua rápida absorção pelos terminais dos neurônios, retenção de longo prazo nos neurônios e falta de transferência entre os neurônios³. Os neurônios aferentes marcados com DiI podem ser facilmente visualizados usando um microscópio fluorescente para um estudo detalhado. No entanto, uma limitação é que marcadores como DiI podem ser perdidos das células durante a permeabilização celular necessária para a imunocitoquímica com epítopos intracelulares⁴. Aqui descrevemos um método que usa DiI injetado no músculo esquelético para identificar neurônios aferentes musculares no DRG. Também descrevemos um método de permeabilização celular que retém DiI no neurônio enquanto permite o acesso de anticorpos a epítopos intracelulares. Demonstramos o uso da eletrofisiologia e da imunocitoquímica do patch clamp para estudar esses neurônios identificados, bem como descrevemos as vantagens distintas de cada técnica no estudo dos canais iônicos que controlam a excitabilidade neuronal. Finalmente, descrevemos problemas potenciais que podem dificultar a interpretação dos dados eletrofisiológicos. Usamos esses métodos para identificar neurônios aferentes musculares e cutâneos e determinar os canais de sódio dependentes de voltagem (NaV) expressos nesses neurônios identificados⁸. No entanto, esses métodos podem ser adaptados a uma variedade de preparações para estudar subconjuntos identificados de neurônios que inervam um determinado tecido-alvo ou núcleo cerebral.

Protocolo

Nota: Todo o trabalho com animais deve ser realizado de acordo com as diretrizes institucionais e de cuidados com os animais.

1. Preparação do Animal e Rotulagem

1. Anestesiar ratos: Anestesie um rato (normalmente 150-400 g) usando uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (50 mg / kg de peso corporal), xilazina (5 mg / kg) e acepromazina (1 mg / kg). Verifique os reflexos beliscando o pé, espere até que não haja resposta. Como a resposta à anestesia varia entre os animais, é melhor determinar o efeito dos anestésicos testando os reflexos da dor.
2. Solução DiI: Pese o pó DiI e dissolva em DMSO 100% estéril para obter uma solução a 1,5% (15 mg / ml). Conservar a solução à temperatura ambiente em atmosfera seca até à utilização.
3. Injeções DiI: raspe o cabelo sobre a área da panturrilha em ambas as pernas do rato anestesiado usando um barbeador elétrico.
   1. Encha uma seringa estéril de 1 ml (11/4 em agulha de 27 G) com 200 μl de solução DiI a 1,5%. Insira lentamente a agulha paralelamente ao eixo longo de cada músculo gastrocnêmio e injete 100 μl de DiI no músculo enquanto lentamente retira a agulha do músculo (~ 10 segundos) sem se retirar do músculo.
   2. Antes de retirar a agulha do músculo, puxe o êmbolo da seringa para trás para garantir que o corante não escorra mais da ponta, aguarde 10 segundos e, em seguida, retire a agulha do músculo. Esta etapa evita o vazamento de DiI da agulha para a pele, o que poderia rotular aferentes cutâneos.
   3. Repita para a outra perna.
   4. Aguarde de 4 a 5 dias para que o DiI seja transportado do músculo para o DRG.

2. Dissecção e isolamento neuronal

1. Soluções:
   1. Prepare a solução salina balanceada de Hank (HBSS) e a solução salina balanceada de Earle (EBSS) de acordo com as instruções do fabricante, filtre, esterilize e armazene a 4 °C.
   2. Meios de cultura (MEM Plus): Misturar 89 ml de meios essenciais mínimos (MEM), 10 ml de soro fetal bovino (FBS), 1 ml de solução de penicilina-estreptomicina, filtrar esterilizar e conservar a 4 °C.
   3. Solução de polilisina: dissolver o pó de bromidrato de poli-L-lisina (10 mg/100 ml) em solução de borato de sódio 0,1 M, pH 8,4, filtrar, esterilizar e armazenar alíquotas a -20 °C.
2. Revestimento de lamínulas
   1. Limpe as lamínulas de vidro (12 mm redondas) com etanol a 70% por 3-4 horas e seque ao ar em uma coifa de cultura estéril.
   2. Colocar as lamínulas secas na solução de polilisina O/N.
   3. Retire da solução de polilisina e lave em água destilada estéril 2x por 5 min cada para remover o excesso de polilisina.
   4. Separe as lamínulas, seque na capa de cultura e armazene a 4 ^oC.
3. Configurando para dissecção
   1. Colocar sobre gelo um copo com 10 ml de HBSS, uma placa de Petri de 35 mm e uma placa de Petri de 100 mm.
   2. Pesar enzimas: 7 mg de colagenase, 1 mg de DNAse e 10 mg de tripsina.
   3. Pré-aqueça um banho-maria agitado a 37 ^oC e coloque no banho um tubo de centrífuga de 15 ml contendo 10 ml de EBSS para aquecer.
4. dissecção:
   1. Rato sacrificado de acordo com um protocolo aprovado pela IACUC. Cdióxido de carbono foi usado para sacrificar o rato.
   2. Remova rapidamente as costas cortando a pele das costas, remova o tecido conjuntivo e muscular ao longo da coluna vertebral para melhor exposição e remova a seção lombar da coluna vertebral (extremidade da região torácica ao osso ilíaco; Figura 1).
   3. Coloque a coluna vertebral isolada na placa de Petri de 100 mm e, usando uma pipeta Pasteur estéril, aplique uma solução HBSS gelada para manter a preparação úmida e fria.
   4. Corte os músculos dos lados da coluna vertebral. Realize uma laminectomia dorsal, usando rongeurs ou tesouras, e remova suavemente o osso que envolve os recessos que contêm o DRG.
   5. Aplique repetidamente HBSS gelado (~ 1 ml) durante este procedimento.
   6. Isole o DRG cortando os nervos periféricos e centrais (deixando 1-2 mm de nervo para facilitar o manuseio dos gânglios)
   7. Coloque o DRG isolado na placa de Petri de 35 mm contendo tampão HBSS gelado.
   8. Repita até que todos os DRG L-4 e L-5 tenham sido isolados. O DRG torácico pode ser isolado e processado separadamente como um controle negativo para a marcação de DiI.
   9. Coloque a placa com DRG isolado sob um microscópio de dissecção e remova o excesso de nervos e vasos sanguíneos usando uma microtesoura e uma pinça.
   10. Abra o DRG para melhor exposição às enzimas, mas não desembainhar o DRG.
5. Dissociação do neurônio DRG:
   1. Adicione as enzimas ao meio EBSS quente (mantido no banho-maria). Agite brevemente para dissolver e filtre e esterilize.
   2. Usando uma pipeta Pasteur estéril, coloque todo o DRG na solução enzimática. Minimize o volume de HBSS adicionado com DRG, pois o HBSS diluirá a mistura enzimática. Gaste o frasco com 95% de O₂ e 5% de CO₂ por 60 segundos antes de tampar bem o frasco.
   3. Incubar o balão no banho-maria agitado regulado para 37 °C durante 60 min a 240 rpm.
   4. No final da incubação, agitar vigorosamente o balão 50x para dissociar o DRG⁵.
   5. Em condições estéreis, adicionar 5 ml de MEM Plus ao balão para parar as enzimas.
   6. Transferir o conteúdo do balão para um tubo de centrifugação estéril de 15 ml e centrifugar a 16 x g durante 6 min.
   7. Retirar e rejeitar o sobrenadante, adicionar 5 ml de MEM Plus à amostra. Triture suavemente com pipeta para quebrar o pellet.
   8. Repita a etapa de centrifugação, remova e descarte o sobrenadante e adicione 500 μl de MEM Plus. Triturar suavemente com uma ponta de pipeta de 1 ml numa pipeta para fazer uma suspensão celular.
   9. Colocar uma lamínula de vidro revestida de polilisina numa cápsula estéril vazia de 35 mm. Adicione uma gota (~50 μl) da suspensão celular ao centro da lamínula.
   10. Repita até que a solução celular se esgote.
   11. Coloque os pratos de 35 mm em uma incubadora de 37 °C e CO_{5% 2} por 1 hora para permitir que os neurônios adiram às lamínulas.
   12. Adicione mais 2 ml de mídia em cada prato e retorne à incubadora.

3. Gravação de grampo de patch

1. Soluções para gravação: essas soluções são para registrar correntes NaV. Exemplos de soluções com composição diferente podem ser encontrados nessas referências^5-7.
   1. Solução externa: (em mM) 45 NaCl, 100 N-metil-d-glucamina (NMG)•Cl, 4 MnCl₂, 10 Na•HEPES e 10 glicose, com pH = 7,4 e osmolaridade = 320 mOsm.
   2. Solução interna: (em mM) 104 NMG•Cl, 14 Creatina•PO₄, 6 MgCl₂, 10 NMG•HEPES, 5 Tris•ATP, 10 NMG₂•EGTA e 0,3 Tris₂•GTP com pH 7,4 e osmolaridade = 300 mOsm.
2. Medição de correntes iônicas:
   1. Puxe os eletrodos de gravação dos capilares de vidro em um extrator de eletrodos e polir as pontas com uma microforja. A resistência dos eletrodos é tipicamente de 2-3 MΩ
   2. Identifique os neurônios DRG marcados com DiI usando um microscópio com epifluorescência e um cubo TRITC. DiI tem um comprimento de onda de excitação de 550 nm e comprimento de onda de emissão de 570 nm.
   3. Encha o eletrodo de vidro com solução interna (apenas lima ~ 1 cm da ponta do eletrodo) e bata suavemente para remover quaisquer bolhas presas. Coloque no suporte do eletrodo e mova para a célula usando um micromanipulador.
   4. Assim que o eletrodo tocar a célula, aplique uma sucção suave através do tubo de sucção, até formar uma vedação hermética (determinada pelo aumento da resistência do eletrodo).
   5. Clamp a tensão da membrana no potencial de retenção desejado (normalmente -60 a -120 mV).
   6. Obtenha a configuração do grampo de remendo de célula inteira aplicando uma sucção mais forte para remover o remendo da membrana na ponta do eletrodo. A transição para a configuração de célula inteira é observada eletricamente como um aumento na corrente capacitativa^8-10.
   7. Compense a resistência em série usando o circuito de compensação do amplificador de patch clamp (use pelo menos 80% de compensação)^8,10.

4. Imunocitoquímica

1. Fixe os neurônios nas lamínulas com paraformaldeído a 4% por 1 hora e, em seguida, permeabilize com Tween 20 a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 10 min.
2. Incubar as células fixadas O/N em uma solução de bloqueio (soro normal ou albumina de soro bovino) mais o anticorpo primário, que é um anticorpo desenvolvido para se ligar a um antígeno específico de interesse.
3. Incube um conjunto de controle de neurônios O/N em solução de bloqueio que não possui os anticorpos primários.
4. Lave as lamínulas com tampão PBS 3x por 5 minutos, seguidas de 2 lavagens de 5 minutos cada com 1% de Tween 20 para remover o anticorpo primário não ligado.
5. Incubar lamínulas de teste e controle com o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado, que se liga ao anticorpo primário para permitir a visualização.
6. Lave as lamínulas com PBS 3x por 5 min para remover o excesso de anticorpos secundários.
7. Monte as lamínulas em uma lâmina de vidro limpa usando mídia de montagem.
8. Aplique esmalte transparente na borda da lamínula para fixá-la no lugar. Depois de secos, visualize os neurônios e capture imagens usando o software que acompanha o microscópio de fluorescência.
   Nota: Neste trabalho, foi utilizado um microscópio Nikon com o software NIS-elements BR 3.2. O tempo de exposição foi otimizado e mantido o mesmo para lâminas de controle e teste.
9. Meça a intensidade da fluorescência e o tamanho das células de neurônios individuais usando um software de imagem como o ImageJ (rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Resultados

Usando o método descrito aqui, identificamos neurônios aferentes musculares no DRG e passamos a determinar os canais de sódio dependentes de voltagem (NaV) expressos por esses neurônios. Os neurônios aferentes musculares marcados com DiI (Figura 1C) compreenderam uma pequena fração da população total de neurônios no DRG, com uma média de 16% dos neurônios (167/1047) marcados. A quantificação foi feita medindo primeiro a fluorescência usando ImageJ e plotando histogramas dos dados de intensidade para dete...

Discussão

Os aferentes musculares originados dos músculos tríceps sural (por exemplo, gastrocnêmio) têm sido utilizados em vários estudos para investigar o reflexo pressor do exercício (RPE)¹³. Dado o interesse em estudar os neurônios sensoriais que medeiam o EPR, os músculos gastrocnêmios foram selecionados para injeção de corante. A DiI foi escolhida devido à sua natureza lipofílica e por não ser perdida do neurônio por difusão através da membrana plasmática intacta^3,14. Usando este método como gui...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaV 1.8	Abcam	Ab93616
NaV 1.1 / 1.6 / 1.7 e 1.9	Alamone Labs, Jerusalém, Israel	ASC- 001 / 009 / 008 / 017
Alexa Fluor anticorpos secundários	Invitrogen
Soro
Fluoro-Gel	Microscopia Eletrônica Ciências	17985