Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Neurónios estabelecer o essencial circuitos complexos para a função dos sistemas nervosos central e periférico, através da elaboração de dendrites e axónios receber informação, muitas vezes muito demorado, para se comunicar com os neurónios a jusante. Crescimento de neurites desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento embrionário e na diferenciação e manutenção de neurites neuronal suporta criticamente a função do sistema nervoso. Processos neuriticos também apresentam criticamente em lesões neuronais e de regeneração, bem como distúrbios do sistema nervoso. O estudo da arquitetura neuronal é crucial para entender tanto o cérebro normal e doente. Felizmente, existem sistemas de cultura de células neuronais fisiologicamente relevantes que podem recapitular estruturas celulares complexos e heterogêneos. Com base na elucidação de plataformas experimentais sólidos, estratégias eficazes de visualização que permitem análises qualitativas e quantitativas da morfologia neuronal são necessários. Especialmente útil seriaser uma metodologia detalhada que fornece uma plataforma consistente para a visualização de neurites, ambos os axônios e dendritos em escala nanométrica.

Microscopia tradicional elétron requer o uso de solvente orgânico durante a desidratação e incorporação de resina, o que pode induzir distorções nas amostras de seu verdadeiro estado. Até à data, a maioria das caracterizações estruturais em escala nanométrica são baseados em células ou tecidos maiores, que são submetidos a tais produtos químicos - limitando, assim, a interpretação dos resultados ^4,9,25. Além disso, para a penetração do feixe de electrões, de corte é necessária para que os organismos celulares ou saliências que apresentam uma espessura superior a 1 um ^12. Finalmente, os resultados de tecido seccionados ou branqueado no conjunto de conjuntos de dados discretos específico slice, tornando complicada a definição da característica alongada de neurites. Mesmo para crio-EM, em que o corte de um espécime congelado hidratado é possível, o método apresenta compressão ArtifAtos ^1.

Nos últimos anos, os pesquisadores aprenderam a crescer neurônios do hipocampo diretamente em grades e EM-los em etano líquido para visualizar posteriormente neurites usando crio-ET ^8,10,18,23 de congelamento flash. No entanto, tais estudos ou usar um dispositivo feito sob medida ^10,23, ou detalhes de falta na etapa mata-borrão para a geração de gelo vítreo suficientemente fina para visualização rotina ^8,18. Por exemplo, um estudo recomenda o uso de 30-40 segundos para secar a grade EM ^10, no entanto, este valor não é otimizado para uso geral, mas é específico para esse dispositivo de congelamento mergulho feito por encomenda. Usando um dispositivo feito sob medida, em vez de um comercialmente disponível um ¹⁷ para a manutenção de umidade antes de mergulhar de congelamento da amostra pode representar um obstáculo para a reprodutibilidade generalizada.

Embora esses estudos têm sido inovador em visualizar neurites por crio-ET, demos um passo à frente para explorar a applicability de crio-ET para uma variedade de amostras (neuronais do hipocampo e do gânglio da raiz dorsal, neurónios). Além disso, discute-se ambos os resultados ótimos e subótimos, bem como os possíveis artefatos que se pode encontrar usando crio-ET para tais espécimes.

Definindo uma técnica detalhada para a preservação e visualizar neurites inteiros em escala nanométrica em um estado quase nativo iria aumentar a capacidade para mais pesquisadores para realizar estudos ultra-estruturais. Para este efeito, descrevem um protocolo eficaz e detalhado usando equipamentos disponíveis comercialmente para preparar a não fixadas, os neurónios não-coradas para visualizar as neurites. Este é um primeiro passo importante para detalhar a ultra-estrutura das neurites saudáveis ​​e estabelecer as bases para a compreensão do que estão presentes em modelos de doenças do sistema nervoso diferenças estruturais. Desde crio-ET pode resolver não corrigidos, características neurite não coradas em 3-D em escala nanométrica, o método, será possível, como nunca serantes de definir a arquitetura neuritic ^12.

1. Preparar pratos com EM Grids para Galvanização primárias Neurônios

1. Examine a integridade do carbono perfurado nas grades EM ouro usando um microscópio de luz com ampliação de pelo menos 25X. Certifique-se que buracos de carbono são> 98% intacto.
2. Para chapeamento neurônios primários, use um bico de Bunsen para inflamar-esterilizar as grades EM e ao mesmo tempo torná-los hidrofílico. Use uma pinça para pegar a grade EM pelas bordas, e não a área em grade central. CUIDADO: Nunca deixe um bico de Bunsen aceso autônoma, e não use luvas ou pinças com componentes de plástico durante a execução destes passos:
   1. Antes de acender o bico de Bunsen, definir os ajustes de ar e gás para uma posição minimamente aberto.
   2. Acenda o bico de Bunsen usando uma pederneira atacante ou butano isqueiro.
   3. Modifique os ajustes de ar e gás para conseguir uma chama interior pequeno, azul dentro de um mais alto, mais leve chama azul / violeta. A ponta da chama interior é a parte mais quente da chama. O botão sobSob o queimador ajusta a quantidade de gás que entra no tubo do queimador, enquanto o tambor do queimador pode ser rodado para ajustar a quantidade de ar que entra no queimador. Virando o horário de ajuste do ar diminui o ar (resultando em uma chama roxa) e anti-horário aumenta o ar (resultando em uma chama amarela).
   4. Com uma pinça de metal (sem peças de plástico) para manter a grade EM, passá-la rapidamente através da chama duas vezes, voltados para o lado de carbono para cima. O lado de carbono aparece mais mate (menos brilhante) e com mais de uma tonalidade acinzentada que o outro lado.
   5. Transferir imediatamente a rede (lado do carbono para cima) para o centro do prato de fundo de vidro colocadas dentro de 10 cm do bico de Bunsen. Use uma grade EM por prato (Figura 1). Só use pratos com fundo de vidro que são pré-esterilizado, ou seja, através de irradiação gama.
3. Use um microscópio de luz para verificar a integridade da rede (buracos de carbono intacta), enquanto ainda mantém a grade EM dentro do-bott vidroprato om (para evitar contaminação). Ao aplicar qualquer substância no grid ou qualquer coisa que vai entrar em contato com os neurônios, utilize procedimento estéril e pontas de pipetas estéreis.
4. Num capuz de cultura de tecidos usando o procedimento de estéril, aplicar 250 ul da substância de revestimento apropriado, lentamente e com cuidado para a área central de vidro da placa de Petri. Certifique-se que a substância de revestimento apropriado abrange toda a grade de EM.
   1. Para os neurónios do hipocampo, usar poli-L-lisina (PLL, 1 mg / ml) como a substância de revestimento, preparado tal como anteriormente descrito ^19. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo. Para gânglio da raiz dorsal (DRG) neurônios, use uma mistura gelatinosa de proteína secretada pela Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato (ver Tabela de Materiais e reagentes) como a substância de revestimento, preparar o seguinte. Note-se que são necessários 250 ul por grelha EM, por prato, de modo que a escala em lotes de acordo.
      1. Descongelar um frasco de estoqueda mistura de proteínas segregadas por gelatinoso Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), as células de sarcoma de rato durante a noite a 4 ° C.
      2. Manter frio a mistura gelatinosa proteína secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato, e todos os componentes utilizados para tornar a solução, isto é, mantendo-as em gelo.
      3. Enquanto sobre gelo, dilui-se esta mistura de proteína gelatinoso em meio Neurobasal para dar uma diluição de 1:20 (ou seja, diluir 500 uL da mistura de proteína gelatinoso em 10 ml de Neurobasal).
      4. Divide diluída mistura proteína gelatinoso em aliquotas de 1 mL e imediatamente armazenar quaisquer alíquotas adicionais a -20 ° C.
      5. Aplicar 250 mL por grade EM, por prato, conforme descrito na Seção 1.4.
5. Cobrir a placa de Petri, com o seu topo e incubar (ou com PLL em amostras de hipocampo, ou com a mistura de proteína gelatinoso para espécimes DRG) durante 1 hora à temperatura ambiente, na capa de cultura de tecido.
6. Aspiclassificar todos PLL (para amostras de hipocampo) ou a mistura de proteína gelatinosa (para amostras de DRG) dos pratos. Para fazer isso, use o sistema de vácuo na capa de cultura de tecidos. Utilizar uma ponta de pipeta estéril, ligada ao tubo de vácuo. Evite o contato direto com a grade de EM.
7. Usar uma pipeta de deslocamento de ar ajustável para aplicar cuidadosamente 250 ul de PBS estéril (solução salina tamponada com fosfato) para a grelha de EM na área central de vidro de cada caixa de Petri, de tal modo que a grelha de EM é totalmente coberto pela PBS. Em seguida, aspirar o PBS de cada prato. Repita 3x.
8. Permitir que os pratos com grelhas EM secar sob o capuz de cultura de tecidos durante 15 min. Certifique-se de que estão completamente secos, marcando sob o microscópio de luz na sala de cultura do tecido. Certifique-se de que não haja bolhas de umidade na grade. Se assim for, cuidadosamente aspirado ao lado da grelha de EM para eliminar esta humidade adicional. A grade revestida deve ser usado imediatamente para chapeamento os neurônios.

2. Preparação e Plating primária Neurônios na EM Grids

1. Para placa neurônios primários, primeiro dissecar, trypsinize (usando 2,5% de tripsina) e triturar dissociar a hipocampo (ou gânglio da raiz dorsal de 18 dias de idade embriões de ratos) em células individuais, como descrito anteriormente ^19.
   1. Triturar é um termo comum usado por neurobiologists para descrever dissociação aglomerados de células em células individuais, particularmente por utilização de uma pipeta de vidro com uma ponta polida ao fogo. O resultado é conseguido com cuidado e lentamente desenho e liberar as células, para cima e para baixo, várias vezes (~ 30), por meio da pipeta.
2. Siga os procedimentos como descritos anteriormente para dissecção DRG e isolamento de células ^24, tomando nota de utilizar 0,25% de tripsina (em HBSS) para isolar os neurônios DRG de ratos, ao invés de usar as enzimas sugeridas (papaína, a colagenase / Dispase), que são mais adequados para rato neurônios DRG.
3. Calcule o número de neurônios isolados (ou seja, utilizando um hemocitômetro)e usar este valor para calcular o volume adequado de células para aplicar a cada prato para obter uma concentração de 50.000 células / ml por placa. O volume máximo a aplicar é de 250 mL. Note que isto só preenche a área de vidro central, e não todo o prato.
4. Incubar os pratos durante 30 minutos em uma incubadora de CO ₂ a 37 ° C. Permitir células para recuperar e aderir.
5. Lentamente, adicionar 1,5 ml de meio aquecido para cada prato, tomando cuidado para não perturbar a grade EM. O tipo de mídia depende do tipo celular (hipocampo ou DRG).
   1. Preparar os meios de comunicação apropriada para quer neurónios do hipocampo ¹⁹ ou neurónios do gânglio da raiz dorsal ^24, que é para ser aquecido num banho de água a 37 ° C antes de usar. Incubar os pratos durante a noite na incubadora de CO _2.
   2. Para os neurônios do hipocampo, alterar a mídia no dia seguinte. Mude metade dos media a cada dois dias em diante, durante 14 dias. Aqueça a mídia em um 37 ° C banho de água antes do uso. Para os neurónios DRG, o dia seguinte dissecação / chapeamento, preparar um material fresco de meios de comunicação com um agente anti-mitótico (uridina e 5 '-fluoro-2'-desoxiuridina) fazer uma solução estoque de 10 mM de cada um, separadamente, usar um definitivo concentração de 10 uM para cada. Retirar metade dos meios de DRG (875 mL) e adicionar 875 mL de meio fresco com o agente anti-mitótico.
      1. Para neurônios DRG, a cada dois dias para a primeira semana, alternativo mudando media entre a mídia anti-mitóticas e mídia DRG padrão. Para a segunda semana, altere mídia DRG padrão a cada dois dias.

3. Vitrificação Neurônios na EM Grids

1. Preparar o equipamento e todos os materiais para congelar e armazenar as grelhas EM ouro à temperatura criogénica: um dispositivo de vitrificação com uma câmara de humidade ^17, uma pinça fina especializados pontos para a máquina de vitrificação, pinças ponto longo plana, Dewar (s) de azoto líquido (LN _2), crecipiente oolant, caixa de armazenamento rede EM, papel de filtro sem cálcio.
2. Inicie o dispositivo de vitrificação. Ajuste a umidade para 100% e temperatura de 32 ° C. Na seção "Console", defina o tempo blot para zero segundos. Isso permite que o manual borrando através da janela lateral de câmara de umidade da máquina de vitrificação.
3. Manuseie o papel de filtro sem cálcio com luvas, mergulhá-los de tal forma que três trabalhos são empilhados. Corte a pilha em 0,5 centímetros de largura tiras que são ~ 2 cm de comprimento. Dobrá-los a um ângulo de 90 ° de tal forma que um dos lados do papel tem de 0,5 cm x 0,5 cm da face (Figura 2). Com uma pinça, retire o papel do meio e colocá-lo em outro papel de filtro isento de cálcio até o uso.
4. Coloque o botão de armazenamento de rede no porta-botão dentro da câmara de vitrificação. Encher a câmara interior do recipiente do líquido de arrefecimento com azoto líquido e esperar até completa evaporação. Encha a câmara externa do the recipiente de líquido de arrefecimento com azoto líquido até atingir uma temperatura estável para prosseguir para o passo seguinte. Encher a câmara interior com elevado grau de pureza de etano gasoso que irá condensar a um estado líquido no interior da câmara refrigerada.
5. Mova o prato (s) da incubadora para um grande prato de 100 mm de poliestireno para o transporte para a sala de vitrificação, se não nas imediações. Use a pinça de vitrificação especializados para escolher com cuidado a grade EM do prato. Observe que lado os neurónios estão crescendo na grelha EM; posição importa para a próxima etapa. Usar o bloqueio de deslizamento preto sobre as pinças para bloquear com segurança as pinça sobre a grelha de EM.
6. Inserir a pinça para dentro da máquina de vitrificação de tal modo que o lado da grade de EM em que os neurónios são aderidas caras para a esquerda, para longe do orifício da máquina de vitrificação de abertura lateral. Recolha os pinças especializados na máquina de vitrificação.
7. Coloque o recipiente do líquido de arrefecimento no suporte apropriadoda máquina de vitrificação. Deve ser preenchido com LN adequada ₂ e etano líquido. Usando o comando de tela apropriada da máquina de vitrificação, levante a câmara de líquido refrigerante para cima até que ele seja liberado com a parte inferior da câmara de umidade.
8. Com as pinças ponto plana, agarrar uma extremidade do papel de filtro de tal forma que o lado mais curto (os 0,5 cm x 0,5 centímetros da face) é perpendicular às pinças. Esse cara vai entrar em contacto directo com a grade EM para secar (Figura 2B). Insira cuidadosamente o papel de filtro para o lado buracos de câmara de umidade da máquina de vitrificação (Figura 2A). Estável segurar o papel contra a grade de EM (o lado virado para longe da amostra) por 10 segundos. Descarte o papel depois e imediatamente mergulhe-congelar as amostras no etano líquido usando a automação da máquina de vitrificação.
9. Transferir cuidadosamente sua grade EM frozen-hidratado a uma das vagas em uma dasbotões de armazenamento de rede. Repita o processo para as redes EM adicionais nos pratos. Os botões de armazenamento grade EM utilizados nesses experimentos pode armazenar vários grades EM congelados hidratado.

4. Coleção de imagens, Processamento e Anotação

1. Prossiga para coletar 2-D microscopia eletrônica e / ou 3-D inclinação série ⁵ das neurites, utilizando um microscópio crio-eletrônico de sob uma condição de baixa dose. As imagens de 2-D foi concebido para avaliar a qualidade da rede em termos de espessura do gelo e as áreas possíveis de ser útil para o 3-D série de inclinação.
   1. Neste caso, todas as imagens foram coletadas usando uma câmera CCD 4k x 4k acoplada a um microscópio de 200 kV elétron equipado com um único titular tilt nitrogênio líquido transferência crio, a 20k ampliação microscópio em um alvo underfocus de 7 mM e amostragem de 4,4 Å / pixel.
   2. Para obter uma tomografia 3D da amostra, tirar uma série de imagens de projeção, enquanto progressivamente a inclinação do al amostraong um eixo do microscópio eletrônico de transmissão (TEM). Dados os ângulos de inclinação e outras configurações experimentais, existem vários softwares diferentes disponíveis para coletar automaticamente a série de inclinação ^5. A série de inclinação 3-D mostrado aqui foram coletados no mesmo microscópio usando semi-automatizado software aquisição série de inclinação 26 em uma faixa de -60 ° a 60 ° em incrementos de 5 ° com uma dose cumulativa de ~ 60 E / A ^2.
2. Reconstruir a série de inclinação das neurites, utilizando software de processamento de imagem ^21, tal como anteriormente descrito para outras amostras de ^5,29.
3. Cor-anotar as características 3-D de neurites pelo primeiro segmentando o tomograma e criação de um modelo de superfície utilizando um software de processamento de imagem 3-D, conforme descrito anteriormente ^5.

Antes de congelamento e de imagens via crio-ET, devem ser tomadas da rede de EM em que os neurônios estão crescendo imagens de microscópio de luz. Neuritos deve ser claramente visível, sem sobreposição significativa com o outro. Uma caixa colorida na Figura 3A representa uma área que é ampliada em mostrar um maior ampliação na Figura 3B, em que as neurites se estendem através da treliça da grade. Cada grade quadrados é composto por uma película de carbono perfurado que suporta os neurônios e suas neurites. Estes furos são visíveis na imagem de um crio-EM de baixa dosagem feita a ampliação de 4k, que mostra o corpo como um neurónio, escura, de electrões denso objecto relativamente grande (Figura 3C), a partir do qual as neurites projecto para o exterior.

Uma parte do descanso neurite acima de um buraco no carbono é selecionado em uma caixa colorida na Figura 3C, e zoom-in com uma ampliação superior (20k) na Figura 3D. Neste ampliação, estruturas celulares internas claras incluindo microtúbulos, mitocôndrias e vesículas, deve ser claramente evidente (Figura 3D), em particular na forma óptima gelo fino como gerada de acordo com este protocolo. As estruturas preto escuro no centro da imagem (Figura 3D) são partículas de gelo hexagonais que são considerados como contaminação e tipicamente devem ser evitados, no entanto, dado que eles são muito escasso e fora das próprias neurites, que não interfiram com a reconstrução e cor-anotação das estruturas internas para análise e interpretação (Figura 4). Outra imagem de baixa ampliação da dose, de baixo é mostrado na Figura 5, a partir do qual um de neurites pode ser localizado, depois de que várias imagens de 2-D pode ser feita e digitalmente costuradas utilizando software de processamento de imagem para gerar uma montagem (Figura 6).

A inicialbaixa concentração de chapeamento (50.000 células / ml por placa) de neurônios nas grades eletromagnéticas permite neurônios que são separados o suficiente para garantir a visualização nítida das suas neurites (Figura 3C); concentrações superiores às recomendadas (> 50.000 células / ml por placa ) pode resultar em imagens com qualidade inferior de neurites lotados que são difíceis de rastrear ou atributo componentes celulares (Figuras 7B e 7C).

Figura 1. Esquema para o crescimento de neurônios em grades eletromagnéticas dentro de pratos com fundo de vidro. (A) pratos com fundo de vidro são mostrados, parcialmente preenchido com a mídia celular (rosa). (B) Cada prato contém uma grade EM ouro, como uma visão mais de perto revela. (C) de revestimento do EGrade M com poli-lisina é mostrado como um desenho em corte lateral. O prato de fundo de vidro é composta por uma lamela de vidro quadrada que está ligado ao fundo de uma placa de cultura de plástico, que cobre uma abertura circular, que foi originalmente cortada da parte inferior. Estes pratos com fundo de vidro são gamma esterilizados e comercialmente comprado como premade. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 2. Esquema de blotting manual EM grades com os neurônios aderiram. (A) Close-up de deslizamento ranhura de entrada da máquina de vitrificação (seta preta) para o / câmara absorvente de umidade, em que uma pinça será inserido para apagar a amostra manualmente. (B)Esquema dos desenhos animados que mostra como o papel de filtro sem cálcio (0,5 cm x 0,5 centímetros face) devem ser tratadas usando a pinça de ponto plana e inserido através do slot de entrada para a câmara de umidade da máquina de vitrificação para secar a grade EM em que os neurônios são respeitados (gota de mídia celulares rosa mostrado). A grade EM é realizada por pinças de ponta fina especializadas no interior da câmara de umidade. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 3. Visualizando congelados, neurônios hidratados em microscopia eletrônica de ouro (EM) grades. (A) Imagem de microscópio de luz em aumento de 10x da área central de uma rede de EM em que neurônios primários de ratos foram groasa, durante 2 semanas. (B)-zunidas em vista da caixa de água mostrada em (A), em que os neurónios e as suas projecções de neurites são visíveis (setas cor de rosa). (C) Micrografia eletrônica em 4K ampliação de uma neurite projetando para fora do corpo do neurônio (seta vermelha). Esquematicamente corresponde a uma área (isto é, a caixa vermelha) dentro de uma das quadrículas mostrado em (B). Caixa azul é visto em close-up (D), onde os recursos internos da neurite são claramente visíveis na ampliação 20k (seta verde mitocôndrias; microtúbulos seta laranja; vesícula seta azul). Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 4. Reconstrução 3-D e anotação de um axônio tomografia DRG rato. (A) fatia tomográfica de uma pilha reconstruído de imagens tiradas em diferentes ângulos de inclinação de um axônio DRG. (B) correspondente anotação 3-D do mesmo axônio. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 5. 2-D imagem crio-EM de um neurônio DRG rato (centro-esquerda) com projeções axonais (caixa vermelha) em 4k ampliação. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 6. Montagem de quatro 2-D imagens crio-EM de um único axônio DRG rato. Cada imagem foi tomada no 20k ampliação. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 7. Imagens 2-D crio-EM de neurites. (A) Um axônio DRG de rato fotografada perto de proximidade com a soma das células. (B, C) ​​Exemplos de superlotação de neurites, devido à alta concentração de chapeamento de neurônios em redes de EM. Todas as neurites eram de flash congelado duas semanas após o plaqueamento em grids EM ouro. Todas as imagens foram obtidas em 20k,. Ampliação Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Figura 8. Reconstrução 3-D e anotação de uma neurite tomografia do hipocampo de ratos. (A) fatia tomográfica de uma pilha reconstruído de imagens tiradas em diferentes ângulos de inclinação de uma neurite do hipocampo. (B) correspondente anotação 3-D do mesmo neurite. Clique aqui para ver a imagem ampliada .

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.