Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

Sarah H. Shahmoradian; Mauricio R. Galiano; Chengbiao Wu; Shurui Chen; Matthew N. Rasband; William C. Mobley; Wah Chiu

doi:10.3791/50783

É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Preparação de primário neurônios para visualizar Neuritos num Estado Frozen-hidratado Usando Cryo-Electron Tomografia

70.6K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/50783

⸱

12 de fevereiro de 2014

Sarah H. Shahmoradian¹ , Mauricio R. Galiano² , Chengbiao Wu³ , Shurui Chen⁴ , Matthew N. Rasband² , William C. Mobley³ , Wah Chiu⁴

¹Department of Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, ²Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, ³Department of Neuroscience, University of California at San Diego, ⁴National Center for Macromolecular Imaging, Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

Neste artigo

Resumo

Para preservar processos neuronais para análise ultra-estrutural, nós descrevemos um protocolo para revestimento dos neurônios primários em grades de microscopia eletrônica seguido de congelamento flash, rendendo amostras suspensas em uma camada de gelo vítreo. Essas amostras podem ser examinadas com um microscópio crio-eletrônico para visualizar estruturas em escala nanométrica.

Resumo

Neuritos, ambos os dendritos e axônios, são processos celulares neuronais que permitem a condução de impulsos elétricos entre os neurônios. Definir a estrutura de neurites é fundamental para a compreensão de como esses processos mover materiais e sinais que suportem comunicação sináptica. A microscopia eletrônica (EM) tem sido tradicionalmente usada para avaliar as características ultra-estruturais dentro de neurites, no entanto, a exposição a solventes orgânicos durante a desidratação e resina incorporação podem alterar as estruturas. Um objetivo importante não atendida é a formulação de procedimentos que permitam avaliações estruturais não impactadas por tais artefatos. Aqui, nós estabelecemos um protocolo detalhado e reprodutível para o cultivo e de congelamento de flash neurites inteiros de diferentes neurônios primários em grades de microscopia eletrônica, seguido por seu exame com tomografia crio-elétron (crio-ET). Esta técnica permite a visualização 3-D de congelados, neurites hidratados com resolução nanométrica, facilitando assessment de suas diferenças morfológicas. Nosso protocolo produz uma visão sem precedentes da raiz dorsal (DRG) gânglio neurites, e uma visualização de neurites hipocampo em seu estado quase original. Como tal, estes métodos de criar uma base para futuros estudos sobre neurites de ambos os neurônios normais e aqueles afetados por distúrbios neurológicos.

Introdução

Neurónios estabelecer o essencial circuitos complexos para a função dos sistemas nervosos central e periférico, através da elaboração de dendrites e axónios receber informação, muitas vezes muito demorado, para se comunicar com os neurónios a jusante. Crescimento de neurites desempenha um papel fundamental durante o desenvolvimento embrionário e na diferenciação e manutenção de neurites neuronal suporta criticamente a função do sistema nervoso. Processos neuriticos também apresentam criticamente em lesões neuronais e de regeneração, bem como distúrbios do sistema nervoso. O estudo da arquitetura neuronal é crucial para entender tanto o cérebro normal e doente. Felizm....