Este artigo descreve um protocolo de hibridização in situ em otimizado para detecção colorimétrica de expressão de microRNA em seções renais fixados em formalina.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo descrevemos um método de detecção colorimétrica de miRNA no rim através de hibridização in situ com sondas marcadas com digoxigenina microRNA. Este protocolo, desenvolvido originalmente por Kloosterman e colegas para amplo uso com sondas Exiqon miRNA 1, foi modificado para superar os desafios inerentes à análise de miRNA em tecidos renais. Estes incluem questões como a identificação da estrutura e difícil de remover sonda residual e de anticorpos. Utilização de relativamente fina, espessura de 5 mm, as secções de tecido permitido para melhor visualização das estruturas do rim, ao passo que um sinal forte de sonda foi retido nas células. Além disso, as condições de concentração de sonda e de incubação foram otimizados para facilitar a visualização da expressão do microRNA com baixa de fundo e um sinal não específico. Aqui, o protocolo optimizado é descrito, cobrindo a recolha inicial de preparação de tecidos e, através da montagem das lâminas, no final do procedimento. O compone básiconts deste protocolo pode ser alterado por aplicação de outros tecidos e modelos de cultura de células.
Introdução
MicroRNA são pequenos (cerca de 22 nucleótidos de comprimento) que não de codificação RNAs que são produzidos endogenamente. Eles geralmente funcionam para suprimir a expressão da proteína através da repressão de translação ou degradação do mRNA. miRNAs ligam a alvos de RNAm com complementaridade incompleta, tornando possível que um único miRNA para suprimir múltiplos alvos.
Entendimento que tipos e estruturas celulares expressar miRNAs é uma parte importante da compreensão dos mecanismos através dos quais alterações miRNA celular influência expressão e fenótipos de tecido. Enquanto os métodos tais como a sequenciação de miARN, qPCR e Nor....
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Protocolo
1. Rim Tecido Seções
- Fixadas em formalina (10%) secções de rim embebidas em parafina são cortados em lâminas de microscópio a 5 mm de espessura usando um Microm HM 355 S. As lâminas podem ser armazenadas durante vários meses, antes da análise.
2. Preparação de Solução
- Prepare 1 litro de PBS 1x em DDH 2 O em um parafuso de garrafa top autoclave. Encha uma garrafa com 1 L de DDH 2 O. Adicionar 1 ml de DEPC para cada garrafa, tampa e agitar vigorosamente. Deixe a solução assentar durante a noite à temperatura ambiente, para destruir ARNases e, em seguida, autoclave. Adicionar 400 ml de Tween-....
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Resultados
As áreas de uma secção de tecido que se tornam secas durante as hibridações, as incubações ou passos de lavagem geralmente acabam coloração mais escura, durante o desenvolvimento de NBT / BCIP. Figura 1 mostra uma porção de uma secção de rim em que o HybriSlip escorregou da borda o tecido, permitindo tornar-se parcialmente desidratado. Apesar de re-hidratação e de cobertura nas etapas restantes, o sinal na porção desidratado é artificialmente elevada.
A importância de contro.......
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Discussão
O objetivo deste artigo foi descrever um protocolo para miRNA hibridização in situ que funciona bem em tecidos renais formol fixos. Enquanto trabalham fora deste protocolo várias fontes importantes de artefato coloração foram identificados. Atenção especial para estes pontos podem ajudar a evitar manchas artefato e aumentar a probabilidade de uma corrida ISH bem sucedida.
Uma das causas mais evitáveis de artefato coloração pode ocorrer quando cortes de tecidos tornam-se secos dura.......
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Divulgações
Não há nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health dos EUA concede HL082798 e HL111580.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeído | Sigma | P6148 | |
| PBS | Gibco | 70011044 | |
| Dietil Pirocarbonato | Sigma | D5758 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Xilenos | Sigma | 534056 | |
| Etanol | Ultra Puro | 200CSPTP | |
| Tris-HCl | Vida Útil Technologies | 15506-017 | |
| CaCl2 | Sigma | C2536 | |
| Glycine | J.T. Baker | 4059-00 | |
| Ácido Cítrico | Sigma | C2404 | |
| Formamida | Sigma | F9037 | |
| 20x SSC Buffer | Life Technologies | 15557-044 | |
| Heparina | SAGENT | 25021-400-30 | |
| Yeast RNA | Life Technologies | AM7118 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-1004 | |
| NaCl | J.T. Baker | 4058-01 | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| 3' Sonda DIG- miRNA | Exiqon | miR dependente-05 | |
| 3' DIG- Sonda miR embaralhada | Exiqon | 99004-05 | |
| 3' Sonda DIG- U6 miR | Exiqon | 99002-05 | |
| Anti-Digoxigenina-Ab Fab | Roche | 11093274910 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Lamínulas | Fisher | Ajuste ao tamanho | |
| Microtom HM 355 S | Thermo Scientific | 23-900-672 | |
| Forno de Hibridização Deslizante | Boekel | 241000 | |
| Conjunto de Bandeja de Alumínio | Boekel | C2403973 | |
| Inserção de Rack de Aço Inoxidável | Boekel | C2403754 |
Referências
- Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney. Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).
- Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A.
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Reimpressões e permissões
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