Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Resumo

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Resumo

Métodos simultâneos de registro de imagens eletrofisiológicas e fluorescentes foram usados para estudar o papel das mudanças do potencial ou corrente da membrana na regulação da concentração intracelular de cálcio. Mudanças nas condições ambientais, como o ciclo claro-escuro, podem modificar a atividade neuronal e da rede neural e a expressão de uma família de genes do relógio circadiano dentro do núcleo supraquiasmático (SCN), a localização do relógio circadiano mestre no cérebro dos mamíferos. A transmissão sináptica excitatória leva a um aumento na concentração pós-sináptica de Ca²⁺, que se acredita ativar as vias de sinalização que alteram a expressão rítmica dos genes do relógio circadiano. Cortes hipotalâmicos contendo o NSQ foram clampeados com microeletrodos preenchidos com uma solução interna contendo o indicador de cálcio bis-fura-2. Depois que um selo foi formado entre o microeletrodo e a membrana neuronal do SCN, a membrana foi rompida usando sucção suave e a sonda de cálcio se difundiu no neurônio preenchendo o soma e os dendritos. Medidas raciométricas quantitativas da concentração de cálcio intracelular foram registradas simultaneamente com o potencial ou corrente de membrana. Usando esses métodos, é possível estudar o papel das mudanças na concentração de cálcio intracelular produzidas pela atividade sináptica e pelo potencial de ação disparado de neurônios individuais. Nesta apresentação, demonstramos os métodos para registrar simultaneamente a atividade eletrofisiológica junto com o cálcio intracelular de neurônios SCN individuais mantidos em fatias cerebrais.

Introdução

Sabe-se que ocorrem alterações na expressão gênica nos neurônios como consequência da sinalização sináptica. A sinalização pelo neurotransmissor excitatório glutamato pode despolarizar o potencial da membrana neuronal, levando eventualmente à transcrição e tradução do gene^1,2. A ativação de receptores ionotrópicos pelo glutamato permite que íons de cálcio extracelulares entrem na célula, que se acredita desempenhar um papel crítico como um segundo mensageiro na ativação da transcrição gênica. A avaliação da relação entre a atividade elétrica da membrana, como a frequência de disparo do potencial de ação, e as alterações da concentração de cálcio intracelula....

Protocolo

1. Preparação de fatias cerebrais hipotalâmicas

1. Obtenha, com antecedência, a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para qualquer procedimento que envolva animais. Os procedimentos em animais descritos aqui são consistentes com as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais de 2013 e foram aprovados antecipadamente pela Oregon Health & Science University IACUC.
2. Prepare 500 ml do tampão de fatiamento sem o MgCl₂ e CaCl₂ (Tabela 1). Borbulhe a solução com 95% de O₂ e 5% de CO₂ à temperatura ambiente e adicione o MgCl₂ e....

Resultados

Utilizando fatias cerebrais hipotalâmicas, registramos simultaneamente alterações no cálcio intracelular no modo de célula inteira sob condições de fixação de tensão e de fixação de corrente. O microeletrodo mostrado na Figura 1A é posicionado com ampliação elevada (objetivas UV de 40X ou 63X) aplicando-se uma pequena pressão positiva. Após tocar o neurônio, um selo gigohm é formado com sucção suave. No modo de fixação de tensão, após ajustar o potencial da membrana celular para -60 mV, uma sucção adicio.......

Discussão

Os métodos descritos acima fornecem uma ferramenta poderosa para registrar simultaneamente a ligação entre a atividade elétrica da membrana do neurônio e a concentração de cálcio intracelular. O método tem vários pontos fortes, pois combina dois métodos muito bem caracterizados - registro de grampo de adesivo de célula inteira e medição de cálcio intracelular usando corantes fluorescentes. Nossa abordagem é semelhante às descritas por outros pesquisadores^_6,23.

Vários iten.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl	Fisher Scientific Co.	S271-3
KCl	Fisher Scientific Co.	P217-500
NaH2PO4• H2O	Sigma Chemical Co.	S-9638
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-glicose	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Sacarose	Fisher Scientific Co.	S5-500
D-gluconato de potássio	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Adenosina 5′-trifosfato dipotássico sal di-hidratado	Sigma-Aldrich	A8937
Guanosina 5′-trifosfato tris sal	Sigma-Aldrich	G9002
Agarose (ultrapuro)	Vida Tecnologias	15510-027	Gel poroso em placa de Petri estéril Camada de 6 mm de espessura
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, sal hexapotássico	Invitrogen	B6810	Célula impermeável
Nome do equipamento Número de	catálogo	da empresa	Comentários
Micrótomo	Leica	VT1000S	Fatiamento de tecido
Cola cianoacrílica (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Extrator de microeletrodo	Narshige International USA	PP-83
Tubos capilares de microeletrodo	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
Filtro de seringa	Corning	#431212
Microscópio	Leica	DM LFS	Com objetivas 4X, 40X UV e 63X UV, e epifluorescência
Câmera CCD	Hamamatsu	ORCA ER	12 bit CCD
Fura-2 Filtro	Cube Chroma	71500A	Conjunto com filtro UG11
Policromado IV	Até Photonics GmBH		Monocronômetro
Óculos de segurança com bloqueio	ultravioleta Produtos ultravioleta Amplificador
EPC-9	HEKA Eletronik
Metafluor	Molecular Devices		Software de imagem
Patchmaster	HEKA Eletronik		Software de aquisição de dados
Igor versão 6	Wavemetrics		Electrophysiology & Ca2+ Análise de Dados
VAPRO 5520	Westcor		Osmômetro de pressão de vapor