Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Resumo

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Resumo

Métodos simultâneos de registro de imagens eletrofisiológicas e fluorescentes foram usados para estudar o papel das mudanças do potencial ou corrente da membrana na regulação da concentração intracelular de cálcio. Mudanças nas condições ambientais, como o ciclo claro-escuro, podem modificar a atividade neuronal e da rede neural e a expressão de uma família de genes do relógio circadiano dentro do núcleo supraquiasmático (SCN), a localização do relógio circadiano mestre no cérebro dos mamíferos. A transmissão sináptica excitatória leva a um aumento na concentração pós-sináptica de Ca²⁺, que se acredita ativar as vias de sinalização que alteram a expressão rítmica dos genes do relógio circadiano. Cortes hipotalâmicos contendo o NSQ foram clampeados com microeletrodos preenchidos com uma solução interna contendo o indicador de cálcio bis-fura-2. Depois que um selo foi formado entre o microeletrodo e a membrana neuronal do SCN, a membrana foi rompida usando sucção suave e a sonda de cálcio se difundiu no neurônio preenchendo o soma e os dendritos. Medidas raciométricas quantitativas da concentração de cálcio intracelular foram registradas simultaneamente com o potencial ou corrente de membrana. Usando esses métodos, é possível estudar o papel das mudanças na concentração de cálcio intracelular produzidas pela atividade sináptica e pelo potencial de ação disparado de neurônios individuais. Nesta apresentação, demonstramos os métodos para registrar simultaneamente a atividade eletrofisiológica junto com o cálcio intracelular de neurônios SCN individuais mantidos em fatias cerebrais.

Introdução

Sabe-se que ocorrem alterações na expressão gênica nos neurônios como consequência da sinalização sináptica. A sinalização pelo neurotransmissor excitatório glutamato pode despolarizar o potencial da membrana neuronal, levando eventualmente à transcrição e tradução do gene^1,2. A ativação de receptores ionotrópicos pelo glutamato permite que íons de cálcio extracelulares entrem na célula, que se acredita desempenhar um papel crítico como um segundo mensageiro na ativação da transcrição gênica. A avaliação da relação entre a atividade elétrica da membrana, como a frequência de disparo do potencial de ação, e as alterações da concentração de cálcio intracelular requer a combinação de dois métodos - clampeamento de adesivo de células inteiras e imagem quantitativa de sondas fluorescentes de cálcio^3-5, permitindo que a relação seja estudada em neurônios individuais. A técnica de registro de célula única permite o registro da atividade de neurônios individuais em partes identificáveis do cérebro. A técnica de gravação de toda a célula permite que a tensão ou corrente da membrana seja controlada, permitindo a manipulação experimental de correntes específicas do canal iônico. O uso de micropipetas cheias de sondas fluorescentes de cálcio também garante que o neurônio esteja bem preenchido com sonda de cálcio. Essa técnica tem uma clara vantagem ao trabalhar com preparações de fatias de cérebro de preparações de fatias de adultos, uma vez que esses neurônios são particularmente difíceis de carregar usando as sondas permeáveis de células mais comuns e reduzem possíveis problemas de fluorescência de fundo^6-8.

A luz é a principal maneira pela qual os mamíferos ajustam seu relógio circadiano, que está localizado no núcleo supraquiasmático hipotalâmico (SCN). A informação luminosa transduzida na retina é transmitida ^9-11 através do trato retino-hipotalâmico (TRH), onde o glutamato é liberado no NSQ^12,13. O glutamato abre os receptores ionotrópicos NMDA e AMPA localizados nos neurônios SCN, produzindo um influxo de cálcio e sódio e iniciando uma cascata de sinalização intracelular que, em última análise, leva à alteração da expressão de uma família de genes do relógio^14-17 e mudanças na fase do relógio circadiano^18-20. No entanto, o cálcio pode entrar nos neurônios diretamente por meio de receptores ionotrópicos de glutamato ou por meio da despolarização da membrana e ativação de canais de cálcio dependentes de voltagem (VDCC)²¹. Portanto, desenvolvemos um protocolo experimental para investigar a relação entre a concentração intracelular de cálcio e a atividade elétrica da membrana em neurônios do NSQ, como ocorre com o disparo do potencial de ação e a partir da entrada sináptica²².

Protocolo

1. Preparação de fatias cerebrais hipotalâmicas

1. Obtenha, com antecedência, a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) para qualquer procedimento que envolva animais. Os procedimentos em animais descritos aqui são consistentes com as Diretrizes da AVMA para a Eutanásia de Animais de 2013 e foram aprovados antecipadamente pela Oregon Health & Science University IACUC.
2. Prepare 500 ml do tampão de fatiamento sem o MgCl₂ e CaCl₂ (Tabela 1). Borbulhe a solução com 95% de O₂ e 5% de CO₂ à temperatura ambiente e adicione o MgCl₂ e o CaCl₂ enquanto continua a arejar. Ajuste a osmolaridade para 300 mOsm com sacarose. A osmolaridade é medida com um osmômetro de pressão de vapor.
3. Prepare 1 L do meio de gravação sem o MgCl₂ e CaCl₂ (Tabela 2). Borbulhe a solução com 95% de O₂ e 5% de CO₂ e, em seguida, adicione o MgCl₂ e o CaCl₂ enquanto continua a arejar. Ajustar o pH para 7,2-7,4 com NaOH (10 N) e a osmolaridade para 300 mOsm com sacarose. A adição de tampão HEPES é opcional e foi usada para estabilizar ainda mais o pH.
4. As soluções de fatiamento e registro podem ser armazenadas na geladeira por vários dias antes do uso.
5. Prepare agarose a 3% e despeje em uma placa de Petri estéril (6 mm de profundidade) e leve à geladeira.
6. Corte três cubos de agarose com cerca de 6 mm x 6 mm x 6 mm.
7. Anestesiar profundamente um rato Sprague-Dawley de quatro a oito semanas com isoflurano. Teste a profundidade da anestesia. A profundidade da anestesia é considerada apropriada quando não há reflexo de retirada do membro posterior após pinçamento da almofada do pé. Uma vez devidamente anestesiado, o rato é sacrificado por decapitação rápida.
8. Remova rapidamente o cérebro tomando cuidado para cortar os nervos ópticos primeiro, e coloque em uma solução de fatiamento gelada saturada com 5% de CO₂ e 95% de O₂ e deixe esfriar por 2-3 min.
9. Apare o cérebro. Coloque o cérebro usando uma pinça em um papel de filtro circular umedecido (com solução para fatiar) colocado em uma placa de Petri de vidro apoiada no gelo.
10. Corte o cérebro coronalmente para remover o cerebelo e o tronco cerebral restantes, depois o córtex rostral e os lados, para deixar um bloco de cérebro contendo o hipotálamo, preservando cuidadosamente o lado que contém o SCN, nervos ópticos e quiasma óptico.
11. Espalhe uma fina camada de cola cianoacrílica grande o suficiente para prender o cérebro e os blocos de agarose em uma câmara de corte de micrótomo gelada, mas seca.
12. Transfira o lado caudal do bloco cerebral gelado para baixo para a cola com o lado contendo o SCN posicionado para cortar primeiro com os nervos ópticos formando um "V" apontando para cima.
13. Coloque os blocos de agarose nos outros 3 lados. Encha a câmara com tampão de corte gelado continuamente borbulhado com 5% de CO₂ e 95% de O₂. A cola cianoacrílica solidifica com a umidade que mantém o cérebro e os blocos de agarose no lugar.
14. Corte fatias hipotalâmicas coronais (220-250 μm de espessura) contendo o SCN com o micrótomo da lâmina vibratória. Normalmente, uma fatia é escolhida onde o quiasma óptico tem cerca de 2-4 mm de diâmetro, aparecendo como uma faixa branca com SCN apenas dorsal aparecendo como duas pequenas "reentrâncias" no quiasma óptico em ambos os lados do^3º ventrículo (Figura 1A).
15. Coloque as fatias na câmara de registro (36 °C) montada no palco de um microscópio Leica DMLFS. A câmara é preenchida com solução de registro de fluxo contínuo (2 ml/min) aerada com 95% de O₂ e 5% de CO₂ e pré-aquecida com um aquecedor em linha.
16. Realize registros de grampo de contato de células inteiras e imagens de cálcio em neurônios SCN 0,5-8 horas após a preparação da fatia.

2. Gravação de grampo de patch

1. Prepare a solução de eletrodo (intracelular) na metade do volume final total de água.
2. Ajustar a solução a pH 7,3 com KOH (1 N).
3. Adicione a água restante. A osmolaridade final da solução deve estar na faixa de 280-290 mOsm.
4. Passar a solução do eléctrodo através de um filtro de 0,2 μm, alíquota (0,5 ml) para tubos de microcentrífugas e conservar a -20 °C.
5. Prepare a solução de estoque de sal hexapotássico bis-fura-2 da sonda de cálcio (10 mM) misturando 1 mg de sal hexapotássico bis-fura-2 com 99,29 μl de água filtrada de 0,2 μm.
6. Alíquota em tubos separados (2-5 μl cada) e congelar (-20 °C).
7. Descongelar uma alíquota da solução interna e a sonda de Ca²⁺ pouco antes da utilização. Adicionar 2 μl da solução-mãe bis-fura-2 a 400 μl da solução interna para obter uma concentração final de 50 μM da sonda de cálcio. Triturar brevemente para misturar as soluções. A concentração da sonda de cálcio (10-250 μM) varia dependendo do projeto experimental e do sistema de imagem. Observe que bis-fura-2 é composto por duas moléculas de fura-2 ligadas.
8. Puxe os eletrodos de contato de células inteiras, em dois estágios, para um diâmetro de ponta externa de aproximadamente 1 μm e resistências de 7-10 MΩ quando preenchido com a solução intracelular.
9. Encha o eletrodo com alguns μl da solução interna contendo a sonda de cálcio filtrada com um filtro de seringa de 4 mm (0,2 μm) para amostras de baixo volume por meio de um tubo Microfil.
10. Aplique uma pequena quantidade de pressão positiva ao eletrodo enquanto ele é guiado para dentro da câmara de gravação sob iluminação de luz vermelha enquanto é visualizado em um monitor de vídeo.
11. Coloque o microeletrodo sobre o SCN usando uma objetiva de baixa potência (4X). O NSQ é identificado como as duas áreas translúcidas de cada lado do terceiro ventrículo e dorsal ao quiasma óptico (Figura 1A).
12. Mude o microscópio para uma ampliação de alta potência (40X ou 63X). Sub-regiões do SCN e neurônios SCN individuais podem ser direcionados para registro em maior ampliação.
13. Aplique uma leve pressão positiva no microeletrodo à medida que ele avança na superfície de um neurônio.
14. Aplique uma leve pressão negativa no microeletrodo para formar uma vedação com resistências de 3-10 GΩ.
15. Ajuste a tensão da membrana para -60 mV com o amplificador controlado com software de aquisição.
16. Aplique pressão negativa adicional ao eletrodo para romper a membrana celular para o modo de célula inteira.
17. Ao entrar no modo de célula inteira, o soma do neurônio SCN e os dendritos se enchem de sonda fluorescente.
18. A tensão da membrana é medida no modo de pinça de corrente ou a corrente no modo de pinça de tensão enquanto os dados da imagem da sonda de cálcio estão sendo monitorados e armazenados (descritos abaixo). Veja as imagens adquiridas junto com um gráfico de dados de fluorescência de 340 nm/380 nm durante o experimento.

3. Medição de Ca²⁺ intracelular

1. As medições quantitativas de Ca²⁺ são obtidas gravando um par de imagens excitando rapidamente o tecido com luz UV a 340 nm e 380 nm por meio de um monocronômetro com largura de banda de 10 nm e passado por um filtro óptico UG11 para restringir comprimentos de onda harmônicos acima de 400 nm, um DCLP dicróico de 400 nm e luz emitida através de um filtro de emissão de 510±40 nm.
2. As imagens são adquiridas usando uma câmera CCD resfriada com tempo de aquisição e binning ajustados para minimizar o fotobranqueamento e maximizar a velocidade de gravação.
3. O software de imagem quantitativa é usado para adquirir e exibir as imagens.
4. Selecione as regiões de interesse da imagem inicial a serem convertidas em dados de unidade de intensidade de fluorescência relativa (ou seja, soma, dendrito, etc.). Selecione também uma região para medição da fluorescência de fundo (Figura 1B).
5. Imagens brutas e dados ópticos quantificados são continuamente salvos durante o experimento. Após o experimento, as imagens salvas geralmente são reanalisadas quando mais tempo pode ser gasto para selecionar com mais precisão as regiões de interesse a serem quantificadas.
6. Os dados podem ser apresentados como a concentração intracelular estimada de cálcio (Est[Ca^{, 2+}]i). Para calcular^{a concentração de} cálcio, utiliza-se a razão (R) entre a luz emitida após a excitação e a subtracção de fundo a 340 nm, dividida por 380 nm, juntamente com a fluorescência máxima e mínima a 340 nm e 380 nm. A subtração de fundo e outros cálculos são realizados usando um software de análise de dados.
7. Uma determinação in vitro da fluorescência máxima e mínima de bis-fura-2 pode ser realizada usando 10 mM de CaCl₂ para condições ligadas a Ca²⁺ e 10 mM EGTA para condições livres de Ca²⁺. A constante de dissociação de Ca²⁺, Kd da sonda, é considerada 370 nM para bis-fura-2 (Invitrogen).

Resultados

Usando fatias de cérebro hipotalâmicas, registramos simultaneamente as mudanças no cálcio intracelular no modo de célula inteira sob condições de pinça de voltagem e corrente. O microeletrodo mostrado na Figura 1A é abaixado para a posição sob alta ampliação (objetivas UV de 40X ou 63X) com uma pequena quantidade de pressão positiva aplicada. Depois de tocar o neurônio, um selo de gigaohm é formado com sucção suave. No modo de grampo de tensão após definir o potencial da membrana celular para -60 mV, a s...

Discussão

Os métodos descritos acima fornecem uma ferramenta poderosa para registrar simultaneamente a ligação entre a atividade elétrica da membrana do neurônio e a concentração de cálcio intracelular. O método tem vários pontos fortes, pois combina dois métodos muito bem caracterizados - registro de grampo de adesivo de célula inteira e medição de cálcio intracelular usando corantes fluorescentes. Nossa abordagem é semelhante às descritas por outros pesquisadores^_6,23.

Vários iten...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaCl	Fisher Scientific Co.	S271-3
KCl	Fisher Scientific Co.	P217-500
NaH2PO4• H2O	Sigma Chemical Co.	S-9638
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific Co.	M33-500
CaCl2• 2H2O	Fisher Scientific Co.	C79-500
D-glicose	Fisher Scientific Co.	D16-500
NaHCO3	Fisher Scientific Co.	S233-500
Sacarose	Fisher Scientific Co.	S5-500
D-gluconato de potássio	Sigma-Aldrich	G4500
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Adenosina 5′-trifosfato dipotássico sal di-hidratado	Sigma-Aldrich	A8937
Guanosina 5′-trifosfato tris sal	Sigma-Aldrich	G9002
Agarose (ultrapuro)	Vida Tecnologias	15510-027	Gel poroso em placa de Petri estéril Camada de 6 mm de espessura
KOH	Sigma-Aldrich	P-6310
NaOH	Sigma-Aldrich	S-5881
Bis-fura-2, sal hexapotássico	Invitrogen	B6810	Célula impermeável
Nome do equipamento Número de	catálogo	da empresa	Comentários
Micrótomo	Leica	VT1000S	Fatiamento de tecido
Cola cianoacrílica (Roti-Coll1)	Carl Roth GmbH+Co	Art-Nr. 0258.1
Extrator de microeletrodo	Narshige International USA	PP-83
Tubos capilares de microeletrodo	World Precision Instruments	1B150F-4
Microfil 34 g	World Precision Instruments	MF34G-5
Filtro de seringa	Corning	#431212
Microscópio	Leica	DM LFS	Com objetivas 4X, 40X UV e 63X UV, e epifluorescência
Câmera CCD	Hamamatsu	ORCA ER	12 bit CCD
Fura-2 Filtro	Cube Chroma	71500A	Conjunto com filtro UG11
Policromado IV	Até Photonics GmBH		Monocronômetro
Óculos de segurança com bloqueio	ultravioleta Produtos ultravioleta Amplificador
EPC-9	HEKA Eletronik
Metafluor	Molecular Devices		Software de imagem
Patchmaster	HEKA Eletronik		Software de aquisição de dados
Igor versão 6	Wavemetrics		Electrophysiology & Ca2+ Análise de Dados
VAPRO 5520	Westcor		Osmômetro de pressão de vapor