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Biofilmes Microativos Eletroativos Derivados de Águas Residuais: Crescimento, Manutenção e Caracterização Básica

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DOI:

10.3791/50800

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29 de dezembro de 2013

 , 
1Department of Environmental Microbiology, UFZ - Helmholtz-Centre for Environmental Research

Neste artigo

Resumo

O crescimento cronoamperométrico de biofilmes microbianos eletroativos anódicos em um reator de batelada alimentada usando uma configuração de três eletrodos, controlado por um potenciostato, é demonstrado. A transferência extracelular de elétrons é caracterizada por voltametria cíclica na presença do doador de elétrons e na ausência do doador de elétrons. A análise fundamental dos dados é demonstrada.

Resumo

O crescimento de biofilmes microbianos eletroativos anódicos a partir de inóculos de águas residuais em um reator de batelada alimentada é demonstrado usando uma configuração de três eletrodos controlada por um potenciostato. Assim, o uso de potenciostatos permite um ajuste exato do potencial do eletrodo e garante condições de cultura microbiana reprodutíveis. Durante o crescimento, a produção atual é monitorada por meio de cronoamperometria (CA). Com base nesses dados, a densidade máxima de corrente (jmax) e a eficiência coulombiana (CE) são discutidas como medidas para caracterização do desempenho bioeletrocatalítico. A voltametria cíclica (CV), uma atividade não destrutiva, ou seja, não invasivo, é usado para estudar a transferência de elétrons extracelular (EET) de bactérias eletroativas. As medições CV são realizadas em eletrodos de biofilme anódico na presença do substrato microbiano, ou seja, condições de rotatividade e, na ausência do substrato, ou seja, condições de não rotatividade, usando diferentes taxas de varredura. Posteriormente, a análise dos dados é exemplificada e os parâmetros termodinâmicos fundamentais do EET microbiano são derivados e explicados: potencial de pico (Ep), densidade de corrente de pico (jp), potencial formal (Ef) e separação de picos (ΔEp). Além disso, são abordados os limites do método e a análise de dados do estado da arte. Assim, este vídeo-artigo fornecerá um guia para as etapas experimentais básicas e a análise fundamental dos dados.

Introdução

A elucidação dos fundamentos da transferência de elétrons extracelulares microbianos (EET) e sua exploração em sistemas de engenharia é um campo vital e em rápido crescimento de pesquisa e desenvolvimento1-3. O estudo desses microrganismos eletroativos (ou bioeletrocatalíticos ou eletroquimicamente ativos), incluindo cepas puras, bem como coculturas definidas e consórcios complexos, requer um arsenal complexo de técnicas, métodos e protocolos4. Esses métodos derivam de diversas disciplinas científicas, por exemplo, eletroquímica, ciência dos materiais, microbiologia, e fornecem insights sobre diferentes níveis hierárquicos, ou seja, de todo o biofilme microbiano a moléculas individuais. Assim, a eletroquímica e os métodos eletroquímicos representam o fundamento de todas as atividades.

Tradicionalmente, as configurações do tipo célula de combustível eram frequentemente usadas para o crescimento e manutenção de culturas microbianas eletroativas no arquétipo desses sistemas de engenharia: células de combustível microbianas (MFCs)5. Infelizmente, esses tipos de MFCs muitas vezes não permitiam monitorar ou mesmo controlar o potencial de um único eletrodo e, portanto, apenas insights limitados nos processos de eletrodos eram possíveis - apenas a tensão da célula era relatada. Agora é cada vez mais reconhecido que o monitoramento individual e o controle dos potenciais de eletrodos individuais em MFCs representam uma clara vantagem, não apenas para a pesquisa fundamental, mas também para a engenharia. Além disso, com a diversificação das aplicações de tecnologias eletroquímicas microbianas que agora incluem, por exemplo, remediação, dessalinização, sínteses e até biocomputação, nos chamados sistemas bioeletroquímicos microbianos (BES) 2 , 6 , 7 um controle externo de potenciais de eletrodos individuais é muitas vezes substancial. Esse controle geralmente é obtido usando fontes de energia externas ou potenciostatos. Assim, o uso de potenciostatos permite - em contraste com outros tipos de configurações - um ajuste exato do potencial do eletrodo individual. Isso é de grande importância, pois o eletrodo representa o aceptor de elétrons microbiano terminal (para ânodos) ou doador de elétrons (para cátodos) da transferência de elétrons extracelular. A Figura 1 mostra o estado atual do conhecimento sobre o EET microbiano nos ânodos - consulte para obter detalhes, por exemplo, 2,4,6,8,9 O EET no cátodo ainda está praticamente inexplorado10.

Assim, o controle do potencial do eletrodo permite não apenas o uso de condições de cultura microbiana reprodutíveis, mas também sua adaptação em termos de termodinâmica EET11. Neste artigo, é demonstrado como os parâmetros característicos dos biofilmes microbianos eletroativos podem ser extraídos de experimentos com reatores em batelada alimentada usando cronoamperometria (CA) e voltametria cíclica (CV). Isso inclui os parâmetros de desempenho, densidade máxima de corrente (jmax) e eficiência coulombiana (CE), bem como características EET. Aqui a identificação dos potenciais formais (Ef) de locais de transferência de elétrons possíveis e reais estará em foco. A extração desses parâmetros é mostrada no exemplo de biofilmes de cultura mista derivados de águas residuais que são dominados pela especificação Geobacter. 12 Esses biofilmes derivados de águas residuais são obtidos por um simples procedimento de seleção eletroquímica, conforme demonstrado por vários grupos de pesquisa em todo o mundo13-16.

Técnicas eletroquímicas dinâmicas para estudar a transferência de elétrons extracelulares microbianos

Para uma caracterização termodinâmica do EET de culturas microbianas eletroativas, são necessárias técnicas eletroquímicas dinâmicas. Em geral, essas técnicas incluem potencial controlado, ou seja, voltamétrico, e corrente controlada, ou seja, Galvanodinâmica, Técnicas17. Assim, as técnicas potencialmente controladas são mais prevalentes e incluem, por exemplo, voltametria de onda quadrada e voltametria de varredura linear18. A mais popular, no entanto, é a voltametria cíclica (CV)19,20. O CV é bem conhecido e difundido em diferentes campos da eletroquímica, desde a pesquisa de baterias até a ciência dos materiais até a bioeletroquímica enzimática21. Sua aplicação em células microbianas vivas só pode ser datada de mais de uma década22 e aumenta significativamente nos últimos anos23,24. Especialmente, a combinação de métodos CV e espectroscópicos forneceu insights sem precedentes sobre os mecanismos de EET e sua natureza molecular, por exemplo,25,26 Paralelamente, a estrutura teórica para a extração de características termodinâmicas e teóricas do EET microbiano foi ampliada eaprofundada27-30. Em contraste, no entanto, o manuseio experimental incorreto ou a análise inadequada dos dados muitas vezes dificultam a aplicação apropriada do CV no campo da bioeletroquímica microbiana. Portanto, além de workshops (por exemplo, no EU-ISMET 2012) e tutoriais19, este vídeo-artigo fornecerá um guia básico para a realização de experimentos voltamétricos cíclicos em bactérias eletroativas. Assim, ele está se concentrando nas etapas experimentais básicas e na análise fundamental de dados e não se destina a fornecer os protocolos mais recentes de análise cinética. Os terminais mais importantes para a discussão a seguir estão resumidos no Quadro 1 (adaptado de Harnisch e Freguia19 e modificado).

Protocolo

Como o procedimento de seleção no reator bioeletroquímico em batelada alimentada é muito específico devido à escolha do substrato e das condições anóxicas, o trabalho em condições estéreis não é necessário para o exemplo demonstrado.

1. Preparação do meio de crescimento

  1. Prepare uma quantidade adequada do meio de crescimento usando um tampão fosfato de acordo com Kim et al.13 (ver Tabela 1). Aqui, o acetato de sódio (10 mM) está servindo como substrato. O meio de crescimento usado neste artigo é apenas um exemplo e, dependendo do objetivo experimental, pode variar em seus componentes.
  2. Adicionar 1 ml de águas residuais primárias por 20 ml de meio de cultura como inóculo. A amostra de águas residuais é retirada de uma estação de tratamento de águas residuais municipal após a filtração mecânica (ver, por exemplo, Figura 2) e pode ser armazenada por até três meses até ser usada em um recipiente fechado a 4 °C.
    (Nota: Dependendo do objetivo do experimento, a contagem exata de células iniciais pode ser importante e, em seguida, deve ser determinada. No exemplo demonstrado, a contagem inicial de células não é importante, pois o biofilme atinge condições de estado estacionário.)
  3. Lave o meio, incluindo o inóculo, com nitrogênio por pelo menos 30 min para desaerá-lo, inserindo uma agulha no meio e ligue o jato de nitrogênio. O jato deve ser forte o suficiente para que você possa observar uma mistura completa do meio.
    (Nota: Dependendo do volume do meio, deve-se até considerar estender o tempo de desaeração. Durante a configuração de desaeração, o reator de batelada alimentada (etapas 2.1-2.2))

2. Configuração do reator em batelada federal

  1. Pegue um recipiente de reator adequado - aqui é usado um balão modificado de fundo redondo de 250 ml de 4 gargalos.
    (Nota: Em geral, a embarcação deve ter pelo menos quatro entradas. Estes são necessários para os três eletrodos e para amostragem/troca de meios. Os volumes de gás produzidos podem ser negligenciados quando o reator é aberto regularmente devido à amostragem ou mudança de meio, alternativamente, um contador de bolhas deve ser instalado. Para evitar o crescimento fototrópico indesejado, os reatores devem ser protegidos da exposição direta à luz.)
  2. Para a configuração de três eletrodos (consulte a Figura 3 e a seção 3 para obter detalhes), coloque o eletrodo de referência (RE) (aqui Ag/AgCl, sáb. KCl, 0,197 V vs. SHE), o eletrodo de trabalho (WE) e o contra-eletrodo (CE) no frasco através de entradas individuais por meio de plugues de silicone – vedação hermética.
    (Nota: Como as hastes de grafite WE e CE são usadas. O fio dos eletrodos é puxado através do plugue de silicone e fixado externamente. O eletrodo de referência é colocado através do plugue de silicone por meio de um orifício perfurado. Para evitar curtos-circuitos, certifique-se de que não haja contato físico dos eletrodos, mesmo durante a agitação ou recirculação do meio. Coloque os eletrodos que eles estão completamente cobertos com solução média. Para vedação, enrole o plugue de silicone de cada entrada com Parafilm.)
  3. Despejar o meio de cultura, incluindo o inóculo (neste caso, 250 ml), através da porta de recolha de amostras para o reactor, lavando com azoto.
  4. Feche a última entrada com um tampão de silicone e feche-a hermeticamente. Nota: Traços de oxigênio não prejudicam os biofilmes de espécies mistas. Eles são capazes de suportar e até consumir baixos níveis de oxigênio, o que, por sua vez, pode diminuir o CE.

3. Crescimento cronoamperométrico do biofilme

  1. Conecte os eletrodos aos respectivos cabos do potenciostato. Colocar o recipiente numa câmara com temperatura controlada, aqui utiliza-se 35 °C31, a fim de garantir condições ambientais constantes.
  2. Abra o software para controlar o potenciostato e escolha a técnica: Cronoamperometria. Defina os parâmetros, por exemplo, da seguinte forma: Um potencial constante EWE de 0,2 V (vs. Ag/AgCl) por uma duração t de 500 horas (≈ 20 dias). A corrente é registrada em intervalos de tempo dti a cada minuto.
    Nota: A escolha do potencial aplicado depende do sistema/microrganismo estudado. Geralmente, os processos anódicos são estudados em potencial positivo e os processos catódicos em potenciais negativos. Pode-se também deduzir um potencial adequado a partir dos potenciais padrão do doador / aceitador de elétrons e do potencial formal do local de transferência de elétrons microbiano esperado, aqui como ponto de partida, consulte a literatura recente.
  3. Inicie a cronoamperometria. Um gráfico da corrente medida ao longo do tempo é plotado pelo software, a corrente máxima observada (imax) é um importante parâmetro online, conforme discutido nas seções 4 e 5.

4. Manutenção de biofilme

  1. Dependendo das condições ambientais, por exemplo, a temperatura, uma corrente oxidativa está começando a fluir e atinge um platô (ver Figura 4). Depois de atingir novamente a corrente zero, pause a medição cronoamperométrica e reabasteça a solução do meio. Para um crescimento mais rápido do biofilme, substitua o meio logo após o platô da corrente máxima ser atingido. Abra a porta de amostragem e com cuidado, sem destruir o biofilme fino, descarregue o meio. Ao reabastecer o meio, lave novamente com nitrogênio. Feche a porta de amostragem e feche hermeticamente.
  2. Repetir o procedimento do passo 4.1. até que a corrente oxidativa máxima atinja um estado estacionário (ver figura 4).
    (Nota: Acredita-se que uma constante imax indique uma formação de biofilme estável em estado estacionário.)
  3. Colher amostras de 1 ml das soluções do meio fresco e do meio trocado para análise do substrato, por exemplo, por HPLC. A concentração inicial do substrato (acetato) (c0), bem como a concentração da solução de substrato restante (c1), são subsequentemente necessárias para os cálculos de eficiência (consulte a seção Análise de dados).
    Nota: Para obter resultados inalterados, por exemplo, devido ao consumo adicional de substrato, analise as amostras de substrato imediatamente. Se tal não for possível, conservar as amostras num congelador a uma temperatura mínima de -18 °C durante um mês não superior.

5. Aplicação da Voltametria Cíclica ao Estudo do EET

  1. Realize voltametria cíclica nos máximos e mínimos do fluxo de corrente, conforme indicado (Figura 4). Dependendo da questão de interesse, o CV geralmente é realizado quando o sistema atinge o estado estacionário para obter resultados comparáveis. (Nota: A geração de corrente é denominada condições de renovação e está relacionada à oxidação microbiana do substrato e subsequente transferência de elétrons: bioeletrocatálise microbiana; enquanto os CVs sem rotatividade são realizados em fluxo de corrente (quase) zero no CA.)
  2. Escolha no software de controle do potenciostato a técnica: Voltametria cíclica e defina os parâmetros apropriados, aqui por exemplo: Um potencial inicial do EWE para Ei de -0,5 V vs. RE com uma taxa de varredura v = dE / dt de 1 mV / seg para um potencial de vértice E1 de 0,3 V vs. RE e de volta ao potencial inicial E2 = Ei de -0,5 V.
    Nota: Ao usar a voltametria cíclica, a tensão aplicada no WE é alterada linearmente com o tempo pelo potenciostato (ver Figura 5) - O Quadro 2 fornece regras básicas para a escolha dos parâmetros do experimento e solução de problemas).
  3. Inicie a voltametria cíclica e registre quantos ciclos forem necessários para realizar um CV reprodutível. Normalmente, são necessários pelo menos 3 ciclos. O gráfico resultante é chamado de voltamograma cíclico (veja também a Figura 7). Nota: Dependendo das condições de medição, diferentes informações podem ser obtidas, conforme demonstrado na próxima seção.

6. Plotagem de dados

Aqui apenas a plotagem dos dados é discutida. Um tratado mais detalhado segue na próxima seção.

  1. Use o software de análise de dados apropriado, aqui todos os dados são exportados como texto e importados como arquivo ASCII.
  2. Calcular e utilizar preferencialmente densidades de corrente (j) e não correntes absolutas (i).
    (Nota: No entanto, como existem diferentes protocolos para calcular j, deixe claro qual deles foi usado. Aqui a densidade de corrente por geométrica, ou seja, projetado, a área de superfície do eletrodo é usada.)
  3. Cronoamperometria: Plote a densidade de corrente medida em função do tempo.
  4. Voltametria cíclica: Traçar a densidade de corrente medida em função do potencial do WE Ewe.

Resultados

1. Cronoamperometria

A partir das medidas cronopotenciométricas, duas características operacionais podem ser calculadas: a densidade máxima de corrente (jmáx), ou seja., o fluxo máximo de elétrons por segundo, e a eficiência coulombiana (EC), ou seja., o fluxo total de corrente em relação ao substrato consumido. Figura 4 mostra uma curva típica de crescimento de biofilme cronopotenciométrica com vários ciclos de crescimento utilizando um reator em batelada alimentada. Após a fase inicial de adaptação, inicia-se um primeiro máximo de densidade de corrente. Em seguida, a corrente diminui novamente devido ao esgotamento do substrato. Quando o fluxo de corrente atinge (quase) zero, o meio é trocado, conforme indicado. Após este reabastecimento do substrato, a densidade de corrente aumenta novamente e o próximo máximo de densidade de corrente é maior que o primeiro. Após diversos ciclos de crescimento, jmáx torna-se constante – o que indica a formação de um biofilme em estado estacionário14. Como o valor de jmáx em estado estacionário depende de diversos parâmetros, por exemplo., material do eletrodo, temperatura do reator e composição do biofilme, ele frequentemente é considerado uma característica de um determinado sistema de biofilme microbiano eletroativo/eletrodo. (No caso de reatores de fluxo contínuo, não se utiliza jmáx, mas sim a densidade de corrente constante em estado estacionário.) A segunda característica operacional é a eficiência coulombiana (EC) (Equação 1). Trata-se do número de elétrons registrados como fluxo de corrente elétrica, Qp, por ciclo de batelada alimentada, em relação ao número teórico máximo de elétrons Qth, calculado a partir do consumo de substrato durante esse ciclo.

Fórmula do equilíbrio estático CE=QP/Qth×100; cálculo da eficiência em diagrama de processo.

(Equação 1)

A carga total transferida pode ser obtida pela integração da curva de CA (ver também Figura 6):

Cálculo da carga elétrica, equação, \( Q_P = \int_0^t i \, dt \), método de integração.

(Equação 2)

A carga elétrica teoricamente possível é calculada pela lei de Faraday:

Equação termodinâmica Qth=ΔcVzF, análise de potencial químico, uso educacional.

(Equação 3)

Onde V é o volume do meio de crescimento, F a constante de Faraday (F = 96.485,34 C/mol), z o número de elétrons liberados pelo substrato oxidado (no caso do acetato, são liberados 8 elétrons durante a oxidação a CO2) e Δc = c0-c1, que representa o consumo de substrato (determinado por métodos de análise química, por exemplo, por CLAE).

2. Voltametria cíclica:

Os voltamogramas cíclicos são registrados para condições de não conversão e para condições de conversão (como indicado na Figura 4). Em ambos os casos, podem-se obter diferentes tipos de informações. A seguir, discute-se como os locais de TTE possíveis e reais podem ser identificados.

2.1 Condições de não conversão – identificação de sítios possíveis de EET:

Figura 7 mostra curvas típicas de voltametria cíclica para condições sem turnover, ou seja., na ausência de substrato. Figura 7A mostra a voltametria cíclica de um biofilme para altas taxas de varredura (aqui 50 mV/s), na qual apenas um par de picos e, portanto, um único potencial formal Ef podem ser identificados. Em geral, o potencial formal de um par redox pode ser calculado a partir do potencial de pico da oxidação EpA e do potencial de pico da redução da espécie respectiva EpC, obtendo-se a média aritmética (ver também Figura 7C):

Equação de eletroquímica: Ej = (EpA + Epc)/2, analisando potencial redox em estudos de voltametria.

(Equação 4)

Ao aplicar uma taxa de varredura suficientemente baixa ao biofilme idêntico (neste caso, 1 mV/s), é possível identificar até quatro pares redox (os respectivos potenciais formais estão indicados na Figura 7B). Isso ocorre porque a corrente capacitiva de fundo diminui ao se utilizar taxas de varredura mais baixas; ver também Quadro 1 e e.g.17,21 para mais detalhes. No entanto, a voltametria cíclica sem transferência de corrente mostra apenas todos os compostos redox ativos no eletrodo, revelando assim o Ef dos locais de TEE possíveis. Somente a análise da voltametria cíclica com transferência de corrente fornece o Ef dos locais de transferência de TEE reais (ver etapa 2.2.).

Ao analisar mais detalhadamente os CVs de não troca, outros parâmetros característicos diferentes, como a separação dos picos ΔEp (Equação 5) ou a corrente máxima do pico ipA e a corrente mínima do pico ipC, podem ser analisados (ver Figura 7C).

Equação de equilíbrio estático ΔEP=EpA-EpC; diagrama de fórmula para fins educacionais.

(Equação 5)

Esses parâmetros, especialmente quando registrados para diferentes taxas de varredura, podem ser utilizados para análise mecanicista e cinética de processos de transferência de elétrons em eletrodos. No entanto, essa análise cinética, bem estabelecida para sistemas químicos, não é direta para biofilmes microbianos eletroativos, ver ex.19,30

  1. Condições de renovação – identificação de sítios de EET reais:

Ao realizar a medição de VC na presença de substrato, obtém-se uma voltametria de turnover (veja Figura 8A). Após plotar os dados, pode-se observar a curva típica em forma de S, denominada bioeletrocatalítica17-19. Ao analisar mais detalhadamente os dados, o máximo da primeira derivada, ou seja., o ponto de inflexão da curva de VC, fornece o potencial formal Ef do(s) sítio(s) de TEE real(is) (veja Figura 8B). No caso de um biofilme jovem, ou seja., fino, dominado por Geobacteraceae, aqui com 168 h após o início da CA, podem ser observados dois pontos de inflexão. Consequentemente, a derivada apresenta dois máximos correspondentes aos potenciais formais dos sítios de TEE ativos na bioeletrocatalise: -0,376 V e -0,295 V vs. Ag/AgCl (KCl sat., 0,197 V vs. SHE). Na Figura 7B, esses sítios são denominados Ef,2 e Ef,3, respectivamente. Esse resultado também mostra que os processos redox associados aos potenciais formais Ef,1 e Ef,4 (na VC sem turnover) não estão relacionados à bioeletrocatalise. À medida que o biofilme cresce e se torna mais espesso, a curva de VC exibe apenas um ponto de inflexão, ou seja., um único máximo na curva derivada. Esse potencial formal Ef, aqui igual a -0,32 V vs. Ag/AgCl (KCl sat.), é (aproximadamente) igual à média aritmética dos dois potenciais formais atribuídos à TEE do biofilme fino (por exemplo., aqui Ef,2 e Ef,3) – veja Figura 9. Isso demonstra que essa análise fundamental de VC fornece informações sobre a termodynamica da TEE de forma rápida e não invasiva, mas é importante ressaltar que não permite tirar conclusões adicionais sobre mecanismos ou cinética.

Nota-se que os biofilmes obtidos sob as condições específicas deste protocolo são altamente dominados por espécies de Geobacter (não demonstrado aqui)12,15. A alteração de parâmetros selecionados, por exemplo, substrato, temperatura, etc., também influenciará a composição microbiana e, consequentemente, as propriedades eletroquímicas.

Tabela 1. Meio de crescimento de acordo com Kim et al.32

Componente(mg/L) / (ml/L)   
NaH2PO4•H2O2,690.00
Na2HPO44,330.00
NH4Cl310.00
KCl130.00
acetato de sódio820.00
solução de metais12.50
solução de vitaminas12.50
Tabela 2. Componentes da solução de metais e vitaminas33.
Solução de elementos traço:Solução de vitaminas:
Componentemg/L   Componentemg/L   
Ácido nitriloacético1,500.0Biotina2.0
MgSO4•7H2O         3,000.0Ácido fólico2.0
MnSO4•2H2O         500.0Cloridrato de piridoxina10.0
NaCl  1,000.0Cloridrato de tiamina5.0
FeSO4•7H2O          100.0Riboflavina5.0
CoSO4 ou CoCl2     100.0Ácido nicotínico5.0
CaCl2•2H2O            100.0DL-Pantotenato de cálcio5.0
ZnSO4   130.0Vitamina B120.1
CuSO4•H2O10.0Ácido p-aminobenzóico5.0
AlK(SO4)2               10.0Ácido lipoico5.0
H3BO3 10.0
Na2MoO4•2H2O     10.0
Observação: Dissolva o ácido nitriloacético com KOH até pH 6,5 e, em seguida, prossiga com a adição dos minerais.


Diagrama de terminologias bioeletroquímicas; inclui equações e fórmulas em eletroquímica.
Configurações de parâmetros de voltametria cíclica e guia de solução de problemas, com foco em ajustes da janela de potencial e taxa de varredura para experimentos de CV ideais.

Diagrama de transferência microbiana de elétrons; vias MET, DET, MIET, DIET; análise de transporte de elétrons.
Figura 1. Esquema dos possíveis mecanismos microbianos de transferência extracelular de elétrons. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Processo de amostragem de água; amostrador de balde coletando amostras do fluxo de tratamento de águas residuais.
Figura 2. Coleta de amostras na estação de tratamento de águas residuais após o coletor de grade (estação de tratamento de águas residuais, Alemanha). Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Diagrama e foto da célula eletroquímica com potenciostato, configuração dos eletrodos; CE, RE, WE identificados.
Figura 3. Configuração com três eletrodos. (A) Esquema, (B) reator real; CE = eletrodo auxiliar, RE = eletrodo de referência, WE = eletrodo de trabalho com biofilme microbiano eletroativo, SP = porta de amostragem. Clique aqui para visualizar a imagem em maior tamanho.

Gráfico eletroquímico; análise de CV; corrente versus tempo; abordagem de estado estacionário; dados em microampères e horas.
Figura 4. Gráfico do crescimento de biofilme com inóculo de efluente em batelada alimentada por cronopotenciometria. A corrente oxidativa atinge um estado estacionário após três ciclos de troca de meio. São indicadas a fase de latência e os momentos de troca de meio e realização de voltametria cíclica com turnover (CV) e sem turnover (CV) para condições de biofilme em estado estacionário (dados brutos de Liu14). Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Análise eletroquímica, diagrama E-t, voltametria cíclica, potencial versus tempo, química analítica.
Figura 5. Curso do potencial-princípio ao longo de um ciclo de voltametria cíclica. A VC começa no potencial inicial Ei. A tensão aplicada é então alterada linearmente ao longo do tempo com uma taxa de varredura v. Em um potencial de vértice escolhido E1, a tensão retorna a um potencial final E2, aqui sendo E2 = Ei. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Gráfico de análise eletroquímica com densidade de corrente j versus tempo t, ilustrando o pico jmax.
Figura 6. Croneoamperograma típico de um ciclo de crescimento de um biofilme derivado de águas residuais; aqui são indicadas a densidade máxima de corrente jmax, a carga elétrica (prática) fluída Qp, a amostragem da concentração inicial do substrato c0 e a concentração do substrato após um ciclo de crescimento c1 . Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Gráfico de análise eletroquímica; diagramas de voltametria cíclica mostrando os resultados de corrente versus tensão.
Figura 7. Voltagramas cíclicos sem transformação de um biofilme de G. sulfurreducens. Velocidade de varredura: (A) 50 mV/s, (B) 1 mV/s 23; (C) detalhe de B, demonstrando a densidade de corrente de pico (jpA) e o potencial de pico correspondente (EpA) do ânodo nos máximos. De forma correspondente, nos mínimos, são mostradas a densidade de corrente de pico (jpC) e o potencial de pico correspondente (EpC) do cátodo. O potencial formal Ef e a separação dos picos ΔEp são obtidos a partir da Equação 4 e da Equação 5, respectivamente (para detalhes, veja o texto abaixo). Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Análise eletroquímica; gráfico de voltametria; corrente versus potencial; detecção de picos; análise de dados.
Figura 8. (A) Voltamograma cíclico de turnover de um biofilme metabolizante de G. sulfurreducens. A taxa de varredura foi de 5 mV/s. (B) Derivadas primeiras da curva voltamétrica23. São indicados os potenciais formais dos sítios reais de TEE: Ef,2 e Ef,3. Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Cyclic voltammetry graph; current vs. potential; electrochemical analysis; data results.
Figura 9. (A) Voltamograma cíclico de turnover e (B) derivadas primeiras de um metabólico mais espesso G. sulfurreducens biofilme. A taxa de varredura foi de 5 mV/s (comparar Figura 8). Clique aqui para visualizar a imagem em tamanho maior.

Discussão

O protocolo apresentado mostra uma maneira fácil e direta de cultivar biofilmes microbianos eletroativos a partir de águas residuais inoculadas usando uma configuração de três eletrodos em um reator de batelada alimentada. A cronoamperometria permite o crescimento e a seleção de biofilmes microbianos eletroativos de diversos inóculos, bem como a caracterização fundamental dos biofilmes em termos de densidade máxima de corrente e eficiência coulombica. A voltametria cíclica, por ser uma técnica não invasiva, permite realizar estudos fundamentais sobre a termodinâmica do EET do biofilme microbiano e, assim, identificar possíveis e reais locais de transferência de EET. Juntos, esses parâmetros permitem i) caracterizar e comparar diferentes biofilmes microbianos para condições idênticas, bem como ii) estudar o impacto de diferentes condições operacionais em biofilmes microbianos eletroativos idênticos. No entanto, esses experimentos podem ser apenas um ponto de partida. Por um lado, o campo multifacetado da bioeletroquímica microbiana requer uma exploração mais aprofundada de métodos e protocolos eletroquímicos. Isso inclui, por exemplo, modelos para extração de dados cinéticos e mecanicistas, bem como outros métodos, como espectroscopia de impedância eletroquímica34,35. Por outro lado, os métodos eletroquímicos não podem fornecer informações sobre a natureza molecular, a composição microbiana, a organização microbiana espacial, etc. Aqui, são necessárias outras técnicas não invasivas e acopladas à eletroquímica ou invasivas4. O Quadro 2 fornece uma breve discussão sobre as etapas críticas ao realizar os experimentos, bem como sobre a solução de problemas inicial.

Do ponto de vista da engenharia, deve-se levar em consideração que o ânodo de biofilme eletroativo é apenas um componente dos atuais sistemas bioeletroquímicos microbianos e uma infinidade de outros fatores devem ser analisados para sistemas completos36. No entanto, esperamos que este vídeo-artigo ajude a entender e adaptar os elementos centrais do BES, ou seja , os eletrodos microbianos, no futuro.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

F.H. reconhece o apoio do BMBF (Prêmio de Pesquisa "Processos biotecnológicos de próxima geração - Biotecnologia 2020+") e da Associação Helmholtz (Grupo de Jovens Pesquisadores).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Águas residuais primáriasde tratamento de águas residuaisTomadas após filtração mecânica
250 ml Frascos de fundo redondo com três entradas adicionaisTh.Geyer Berlin GmbH, Alemanha9.011 845Entradas adicionais foram fixadas pelo nosso soprador de vidro interno
Eletrodo de referência Ag/AgCl (sat. KCl, 0,195 V vs. SHE) com diafragma cerâmicoSensortechnik Meinsberg, AlemanhaSE 11
Hastes de grafite (Ø=1 cm, l=3 e 5 cm)CP-Handels-GmbH, Wachtberg, AlemanhaUsado como material de eletrodo
Aço inoxidável, nº 1.4301, Fio Fe/Cr18/Ni10Goodfellow GmbH, Bad Nauheim, Alemanha155-923-05
Tampões de siliconeTh.Geyer Berlin GmbH, Alemanha9.230 512 e
ParafilmneoLab, Heidelberg, Alemanha3-1011Para vedação para manter condições anaeróbicas
Potenciostato/Galvanostato Modelo MPG2BioLogic Science Instruments, França
EC-LabBioLogic Science Instruments, FrançaSoftware para realizar medições eletroquímicas
Origem 8.6Software de análise de dadosOriginLab
Estação

Referências

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