Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

Resumo

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Resumo

Embriões fase mid-gestação de rato foram cultivadas utilizando um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis em um sistema de cultura em frasco de rolamento oxigenado. Mouse embriões em E10.5 foram cuidadosamente isolada do saco vitelino com útero intacto e num processo que envolve a manobra cirúrgica precisa os embriões foram gentilmente exteriorizado partir do saco vitelino, enquanto mantém a continuidade vascular do embrião com o saco vitelino. Em comparação com os embriões preparados com saco vitelino intacta ou com o saco vitelino removidos, estes embriões apresentaram a taxa de sobrevivência superior e progressão do desenvolvimento, quando cultivadas sob condições semelhantes. Mostramos que estes embriões de ratinho, quando cultivadas num meio definido em uma atmosfera de 95% _O2 / 5% de CO _2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C durante 16-40 horas, exibem crescimento e desenvolvimento morfológico comparável à os embriões em desenvolvimento no útero. Acreditamos ªé o método será útil para pesquisadores que necessitam de utilizar a cultura do embrião inteiro para estudar interações de sinalização importantes na organogênese embrionária.

Introdução

In vitro, utilizando métodos de cultura de embriões inteiros são adequados para estudar mecanismos de sinalização envolvidos na organogênese embrionária que são de outra maneira difícil acesso no útero. Embriões inteiros fornecer a integridade dos tecidos e apoio adequado para as interações de tecido que são cruciais para a ocorrência oportuna de mecanismos de sinalização essenciais para diferentes processos celulares, durante a organogénese. Enquanto as culturas de embriões inteiros fornecer uma plataforma para uma infinidade de aplicações, tais como estudos de transplante, manipulações genéticas e de tecidos, estudos de implantação do grânulo, est....

Protocolo

Rato cultura de embriões:

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com Instituto Nacional de diretrizes de saúde seguindo o protocolo # A2010 07-119, que foi analisado e aprovado pela Universidade de Georgia Institutional Animal Care e do Comitê Use, que mantém a supervisão regulamentar continuou.

1. Preparação de Meios de Cultura

1. Preparar meio de cultura utilizando a mídia e os suplementos de células-tronco disponíveis comercialmente nos seguintes valores: Knockout DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Suplemento (1x), albumina, a partir de soro bovino ....

Resultados

Desenvolvimento de embriões de ratinho ex utero depende de múltiplos factores, a partir do momento em que o útero é isolado a partir do corpo para o momento em que os embriões são cultivados. Como representado na Figura 1, o processo envolve uma série de passos, incluindo, a separação do útero grávido do corpo (Figura 1A), isolamento de embriões com saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorização dos embriões a partir do saco vitelino ( Figura 1C)

Discussão

Embriões fase mid-gestação de ratinho foram cultivadas num meio de cultura livre de soro, numa atmosfera de 95% _O2 / 5% de CO _2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C. O desenvolvimento embrionário ex útero foi criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento que o útero é isolado a partir de murganhos sacrificados para a realização da cultura (Figura 1). O fator mais importante que influenciou o desenvolvi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
KnockOut DMEM	Invitrogen	10829-018
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028
N-2 Suplemento	Invitrogen	17502-048	Estoque: 100x
Albumina, de Soro Bovino	Sigma	A9418-50G	Estoque: 100%
Antibiótico - Solução Antimicótica	Cellgro	30-004-Cl	Estoque: Penicilina (10.000 UI/ml); Estreptomicina (10.000 µ g/ml; Anfotericina (250 µ g/ml)
DMEM	Cellgro	15-013-CV
	B.T.C. Engineering Milton Cambridge Inglaterra	Id.No. 840-374
Garrafas de Vidro para Unidade Rotativa	B.T.C. Engineering
Cortiça de Borracha de Silicone	B.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 Cilindro	AirGas Inc.
Microscópio de dissecação Apo Stemi SV11	Zeiss
Microscópio Stemi SV6	Zeiss
CO2 Incubadora com camisa de água	Forma Scientific Modelo	: 3110
Capuz de Cultura	Armários de Segurança Biológica Nuaire Classe II Tipo A2	Modelo: Nu-425-600
Banho-maria	Fisher Scientific	Balança de Pesagem IsoTemp205
	Mettler Toledo	AG285
, 50 ml	de Operação Leve 430291		Corning
	Roboz	RS-6702
Tesoura de Operação Afiada-Cega	Roboz	RS-6812
Pinça de Microdissecação, 4 in	Roboz	RS-5211
Pinça de Microdissecação - Hudson (cWALD), 4-3/4 in	Roboz	RS-5237
Pinça de Microdissecação (5/45)	Roboz	RS-5005	Modificada - Pontas afiadas foram feitas sem corte
Pinças de Microdissecação (5)	Roboz	RS-5060	Modificado - Pontas afiadas foram feitas sem corte
Pinças de Microdissecação (55)	Roboz	RS-5063	Modificada - Pontas afiadas foram feitas sem corte
Bandeja de Instrumentos	Roboz	RT-1401S
Tampa da Bandeja de Instrumentos	Roboz	RT-1401L
Placa de Petri-100 mm	Fisher Scientific	087571Z
Placa de Petri-60 mm	Fisher Scientific	0875713A
Placa de Petri-35 mm	Fisher Scientific	0875711YZ
(0.22 µ m Acetato de Celulose)-150 ml	de Filtro 431153		Corning
(0.22 µ m Acetato de Celulose)-250 ml	Corning	430756
Sistema de Filtro (0.22 µ m Acetato de celulose) -500 ml	Corning	430758
pipeta auxiliar	Drummond Scientific Co.	D57849
Pipeta sorológica - 10 ml	VWR	89130-898
Pipeta sorológica descartável - 25 ml	Pipeta de transferência Corning	4251
- 7,7 ml	Thermo Scientific	202-20S

Unidade de Incubadora de Precisão Tubo de Centrífuga Tesoura Sistema de Filtro Sistema