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Artigo de método

Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro

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DOI:

10.3791/50803

⸱

1 de março de 2014

 , 
1Neuroscience Division of the Biomedical & Health Sciences Institute, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

Neste artigo

Resumo

Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.

Resumo

Embriões fase mid-gestação de rato foram cultivadas utilizando um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis em um sistema de cultura em frasco de rolamento oxigenado. Mouse embriões em E10.5 foram cuidadosamente isolada do saco vitelino com útero intacto e num processo que envolve a manobra cirúrgica precisa os embriões foram gentilmente exteriorizado partir do saco vitelino, enquanto mantém a continuidade vascular do embrião com o saco vitelino. Em comparação com os embriões preparados com saco vitelino intacta ou com o saco vitelino removidos, estes embriões apresentaram a taxa de sobrevivência superior e progressão do desenvolvimento, quando cultivadas sob condições semelhantes. Mostramos que estes embriões de ratinho, quando cultivadas num meio definido em uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C durante 16-40 horas, exibem crescimento e desenvolvimento morfológico comparável à os embriões em desenvolvimento no útero. Acreditamos ªé o método será útil para pesquisadores que necessitam de utilizar a cultura do embrião inteiro para estudar interações de sinalização importantes na organogênese embrionária.

Introdução

In vitro, utilizando métodos de cultura de embriões inteiros são adequados para estudar mecanismos de sinalização envolvidos na organogênese embrionária que são de outra maneira difícil acesso no útero. Embriões inteiros fornecer a integridade dos tecidos e apoio adequado para as interações de tecido que são cruciais para a ocorrência oportuna de mecanismos de sinalização essenciais para diferentes processos celulares, durante a organogénese. Enquanto as culturas de embriões inteiros fornecer uma plataforma para uma infinidade de aplicações, tais como estudos de transplante, manipulações genéticas e de tecidos, estudos de implantação do grânulo, estudos toxicológicos, etc., Sistemas de cultura de embriões atualmente utilizados são principalmente dependentes de soro para o crescimento e manutenção dos embriões na cultura 1-9.

O soro foi utilizado como um dos principais componentes que variam entre 10-100% do meio de cultura de 6-8, 10, 11.; No entanto, a composição do soro não está bem definida e pode variar de animal para animal e cada vez que o soro é recolhido. Enquanto preparação laboratorial de soro é demorado e envolve procedimentos rigorosos, o soro obtido exibe comercialmente considerável variabilidade entre lotes diferentes e aumenta os custos experimentais. A estes, o soro pode conter factores desconhecidos, como factores de crescimento, hormonas, ou outras proteínas, o que pode, potencialmente, afectar o resultado de certas experiências, especialmente aqueles que envolvem o estudo de moléculas de sinalização importantes em interacções de tecidos. Estudos têm mostrado que a adição de soro para a cultura pode potencialmente alterar os níveis intracelulares de determinadas moléculas de sinalização, tais como o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e de proteínas envolvidas na sinalização mitogénica e fosfoinositida 3 (PI3), as vias de sinalização da cinase 12-14. Contrariamente a isso, um sistema de cultura isento de soro, proporciona as vantagens de ambiente antigénio livre,abstinência de enzimas biologicamente ativas que podem alterar os processos celulares e permite a consistência entre experimentos.

No presente estudo, utilizámos um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis para a cultura da fase mid-gestação de embriões inteiros de uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C 15,16. Mouse embriões cultivados em 16 a 40 horas sob estas condições definidas apresentaram progressão para o desenvolvimento morfológico de corpo e diferentes estruturas embrionárias gerais, tais como o coração, membros, cérebro e olhos, indicando níveis adequados de proliferação celular, a migração, a diferenciação e as interacções de tecidos. A análise molecular do desenvolvimento embrionário em cultura por um dos sistemas de órgãos complexos como o olho revelou o desenvolvimento ocular para ser coerente com o observado no tecido ocular em embryos desenvolvendo no útero (Kalaskar e Lauderdale, em preparação). Assim, mostramos que os embriões de rato cultivadas em fase mid-gestação, apresentam um crescimento progressivo e desenvolvimento morfológico comparável à observada nos embriões em desenvolvimento in utero.

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Protocolo

Rato cultura de embriões:

Todos os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com Instituto Nacional de diretrizes de saúde seguindo o protocolo # A2010 07-119, que foi analisado e aprovado pela Universidade de Georgia Institutional Animal Care e do Comitê Use, que mantém a supervisão regulamentar continuou.

1. Preparação de Meios de Cultura

  1. Preparar meio de cultura utilizando a mídia e os suplementos de células-tronco disponíveis comercialmente nos seguintes valores: Knockout DMEM, KnockOut Serum Replacement (KSR) (10%), N-2 Suplemento (1x), albumina, a partir de soro bovino (2%), penicilina ( 50 UI / ml), estreptomicina (50 ug / ml) e anfotericina-B (1,25 ug / ml). O meio de cultura preparado é semelhante ao anteriormente descrito 15, com as seguintes alterações: a adição de anti-mycotics e utilizando o dobro da concentração de antibióticos (para detalhes de reagentes e equipamentos específicos, ver Liº de Materiais).
    Nota: a concentração de antibióticos como utilizado anteriormente (. Moore-Scott, 15 e outros) foi suficiente para culturas de embriões realizadas até 24 horas período de tempo. No entanto, quando a cultura foi prorrogado para além de 24 horas, tivemos a contaminação da cultura e esta foi controlada com sucesso através da duplicação da concentração de antibiótico.
  2. Armazenar os componentes de media, a 4 ° C ou a -20 ° C, conforme as recomendações do fabricante. KSR e N-2 suplemento deve ser armazenado em alíquotas a -20 ° C para evitar o congelamento e descongelamento repetidos. KnockOut DMEM uma vez aberto deve ser utilizado no prazo de 30 dias, por recomendação do fabricante. Antes de usar, aquecer os componentes em um banho de água a 37 ° C.
  3. Prepare a mídia em condições estéreis. Desinfetar a superfície de todos os equipamentos e frascos contendo os componentes de mídia com 70% spray de álcool antes de colocá-los na capa de cultura.
  4. Os componentes do meio podem ser misturados ou num copo esterilizado, ou directamente no sistema de filtro (Corning). Primeiro adicione o pó de albumina para o KnockOut DMEM. Misturar bem, agitando suavemente até a albumina se dissolva completamente. Em seguida, adicione o N-2 Suplemento, KSR e os antibióticos e misture bem com uma pipeta. Em seguida, filtrar esterilizar os meios de comunicação utilizando um filtro de 0,22 mM tamanho dos poros com sucção a vácuo. Dispensar a mídia em tubos de 50 ml e armazenar cônicas a 4 ° C até ser usado. Os meios de comunicação, uma vez preparados devem ser utilizados dentro de 4-5 dias para a cultura.

2. Preparação do Equipamento Cultura

  1. Esterilizar os frascos de cultura de vidro e rolhas de borracha. Enrole as garrafas de cultura em uma folha de alumínio e colocar as rolhas de borracha em um copo de água e esterilizar em autoclave.
  2. Esterilizar a câmara de cultura (Unidade de precisão Incubadora) com 70% de álcool de pulverização e aquecer a 37 ° C antes de iniciar a cultura. A câmara de cultura é ebrincou com um disco de rolamento no centro que detém as garrafas de cultura. O fluxo de gás para dentro da câmara é regulada por um medidor de pressão e a taxa de fluxo pode ser ajustada por meio da observação do fluxo de saída de bolhas de ar através de água em um tubo de vidro no final. Este aparelho cultura garrafa rolando é uma versão modificada do aparelho original introduzidas pelo Novo e Cockcroft 17.
  3. Conectar um cilindro de gás contendo uma mistura gasosa de 95% O2 / 5% de CO 2 para a câmara de cultura e ajustar o fluxo de gás para "uma bolha de ar por segundo", que dá uma taxa de fluxo de 50 cc / min, e assegura o fornecimento adequado de oxigénio para os embriões cultura.

3. Rato Embryo Coleta e Preparação para a Cultura

  1. Para obter o tipo de embriões de rato selvagens, utilizamos camundongos C57BL/6J e de CD-1 (Charles River Laboratories) cepas de fundo genético.
  2. Confira os ratos fêmea para plugs vaginais todas as manhãs dia. O meio-dia do dia de encontrar ªe tampão vaginal, deve ser considerado como E0.5 dpc (dias pós-coito).
  3. Coletar embriões de camundongos em E10.5 dpc por eutanásia das ratas grávidas seguindo protocolos padrão. Os camundongos foram sacrificados utilizando um dispositivo de inalação de CO 2, conforme especificado pela American Veterinary Medical Association (AVMA) Diretrizes para a eutanásia de animais (2013). Para segurar a morte, luxação cervical foi realizado após a exposição ao CO 2.
  4. Spray de etanol a 70% sobre a superfície abdominal ventral para evitar a aderência de cabelo abdominal para os instrumentos. Em seguida, abrir a cavidade abdominal ventral utilizando uma tesoura afiada romba de funcionamento e um par de 4-3/4 em microdissecting fórceps para localizar o útero. Utilizando um fórceps 4 em microdissecting levantar todo o útero e separá-lo do corpo por corte com uma tesoura de luz de funcionamento no corpo uterino e nas pontas dos cornos uterinos.
  5. Enxaguar rapidamente todo o útero em 1x PBS aquecido a 37 ° Cpara remover qualquer colagem de sangue para o útero e colocar imediatamente em DMEM aquecido a 37 ° C em uma placa de Petri. Esterilizar os instrumentos em 70% spray de etanol antes de nova utilização.
    Nota: O pré-aquecimento das soluções, incluindo o PBS, DMEM e o meio de cultura e a sua manutenção a 37 ° C durante todo o procedimento é recomendado.
  6. Sob um microscópio de dissecação, o útero deve ser segmentally dissecado com uma luz tesoura operacionais. Isto resulta em pequenas aberturas em cada lado do útero segmentada, através do qual um par de modificados (extremidades embotadas) pinças microdissecting pode ser inserido suavemente para alargar a abertura. Isto permite que a exposição do decidua placentário, que pode então ser removido por arrancamento suavemente com um par de pinças microdissecting para expor o saco vitelino parietal (PYS) com a membrana de Reichert. Utilizando uma ponta de perfurar as pinças suavemente membrana de Reichert, juntamente com os PYS e separar the subjacente saco vitelino visceral (VYS) camada de expor os embriões com VYS intactas. O cone ectoplacental e os derivados trofoectoderma pode ser removido quer com a decídua placentária ou com a membrana de Reichert. Cuidados devem ser tomados para evitar a ruptura do VYS como os embriões sair imediatamente.
  7. Os embriões com VYS intactas deve então ser transferido para uma placa de Petri contendo o meio de cultura aquecido a 37 ° C utilizando uma pipeta de transferência de plástico.
    Nota: Transferência para o meio de cultura imediatamente após a separação do útero ajuda para um melhor desenvolvimento do embrião em cultura.
  8. Uma pequena abertura deve ser feito no saco vitelino com um par de pinças microdissecting evitando grandes vasos sanguíneos. Um par de pinças acentuada pode ser usada para fazer a abertura por perfuração suavemente numa área adjacente à região de cabeça. Alternativamente, dois pares de pinças sem corte pode ser utilizado para segurar o saco vitelino e suavemente rasgar para fazer uma pequena abertura.Então alargar suavemente a abertura expandindo com a pinça a um tamanho suficiente para caber a cabeça embrionária. A membrana amniótica, que é envolver estreitamente o embrião deve ser realizada suavemente para fora do corpo e rasgado usando um par de pinças. A cabeça embrionária e depois todo o embrião deve ser suavemente exteriorizado partir do saco vitelino, mantendo a integridade da vasculatura embrionária com o do saco vitelino 15.
    Nota: Qualquer dano à vasculatura saco vitelino podem potencialmente afetar o desenvolvimento do embrião em cultura. Tais embriões com vasculatura danificada não devem ser utilizados para a cultura e pode ser utilizado para encenar os embriões que podem mais tarde ser descartados.
  9. Critérios de estadiamento Embrionárias: Examinar os embriões sob o microscópio de dissecação e de grupo por critérios morfológicos, incluindo corpo e tamanho da cabeça, membros e morfologia do olho e estágio através da contagem do número de somite (s) por pelo menos dois embriões de cada grupo.
    Nota: Normalmente embriões obtidos a partir da mesma ninhada apresentam diferenças de desenvolvimento no útero e diferem no tamanho do corpo, características morfológicas e número de somitos. No entanto, descobrimos que os embriões agrupados por nossos critérios morfológicos geralmente exibiram número somite semelhante (± 1). Por esta razão, não é necessário contar somitos de cada embrião como esta iria atrasar o tempo para o início da cultura.
    Nota: Não usar os embriões que foram usados ​​para contar os somitos para a cultura. Contagem de somitos após o início da cultura de outros embriões de modo a evitar o atraso de tempo no início da cultura. Os embriões que foram retardados de cultura depois da separação do útero geralmente exibem fraca desenvolvimento.
  10. Transferir os embriões imediatamente para uma placa de Petri com meio de cultura fresco aquecido a 37 ° C e levá-la para a capa de cultura, onde os embriões devem ser novamente transferido para uma placa de Petri com cultur estérile mídia antes de colocá-los em frascos de cultura com meio para iniciar a cultura.
    Nota: As múltiplas transferências de mídia para os embriões antes de cultura ajuda na prevenção de contaminação como as diferentes etapas de colheita de embriões e dissecção foram realizados sob um microscópio de dissecação que não foi instalado na capa de cultura.
    Nota: Quando o tamanho da ninhada é grande (> 12 embriões), processo de metade dos embriões e iniciar a cultura ou colocá-los em um prato com meio de cultura e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Quando os embriões foram deixados de fora por períodos mais longos (> 35-40 min) observou-se o coração desacelerar e isso vai afetar o posterior desenvolvimento da cultura.

4. Cultivar embriões de camundongos

  1. Abra as garrafas de cultura autoclavado na capa de cultura e etiquetá-las corretamente. Transferência de 3 ml de meio de cultura aquecido a 37 ° C para cada um dos the garrafas e, em seguida, os embriões de rato deve ser transferido suavemente nos frascos de cultura, utilizando pipetas de transferência de plástico esterilizadas. As garrafas de cultura deve, então, ser cobertas com as rolhas de garrafas de borracha, que ajudam a segurar as garrafas de cultura para o disco do rolamento no aparelho de cultura.
    Nota: Os frascos de cultura com os meios de comunicação podem ser preparado e colocado sobre o disco de laminagem do aparelho de cultura antes da eutanásia dos ratos. Isto encurta o tempo para a transferência de embriões para os frascos de cultura.
    Nota: os embriões do rato podem ser cultivadas individualmente ou como co-culturas com dois ou três embriões no mesmo frasco de cultura.
  2. As garrafas de cultura deve ser assepticamente transportados para o aparelho de cultura a 37 ° C e força-las para ligar os furos na disco do rolamento com as rolhas de borracha. Ligue o disco de rolamento para girar a uma velocidade constante de 35 rotações por minuto (rpm), que permite a flutuação livre do embryos na mídia e também ajuda na troca de gás livre pelo tecido embrionário. O gás do cilindro ligada à câmara de cultura flui através do disco do rolamento e as rolhas de borracha nas garrafas de cultura.
  3. Cultura dos embriões para 16-40 horas e verificar regularmente para o escoamento de gás e temperatura da câmara de cultura.
    Nota: manipulação de embrião de rato em cultura: Deixe os embriões se adaptar às condições de cultura, pelo menos, 30 min. Em seguida, os embriões que mostram um desempenho fraco e batimento cardíaco fraco pode ser descartada e os embriões restantes podem ser utilizadas para estudos de manipulação. Manipulações de embrião, tais como 5,9,16 electroporação, micro-injecções 18, o implante de talão 16, de tratamento de droga e outros procedimentos pode ser realizada nesta altura. Foi realizada com sucesso a implantação de agarose Affi-gel tratada com determinadas moléculas de sinalização para estudar o seu papel no desenvolvimento do olho adiantada. Os embriões depoismanipulações podem ser devolvidos num meio fresco e continuaram em cultura.
  4. Substitua os meios de cultura totalmente com meios frescos em intervalos específicos após 9-10 horas e 18-19 horas de cultura quando a cultura foi mantida por 40 horas.
    Nota: A substituição meios de cultura não pode ser necessária se a cultura é parado por 16-18 horas.
  5. Medidas de sucesso na cultura: a sobrevivência embrionária em cultura devem ser determinados pelo batimento cardíaco visível e circulação do sangue no corpo, enquanto o crescimento embrionário na cultura deve ser avaliada pelo aumento do tamanho do corpo, número somite e desenvolvimento morfológico de cabeça, membros, coração e os olhos.
  6. No útero desenvolvido em embriões E11.0 dpc (~ 40-41 s) e E12.0 dpc (~ 49-50 s) devem ser utilizados como controlos para comparação de embriões cultivados em 16-18 horas e 38-40 horas, respectivamente.
  7. O desenvolvimento embrionário em diferentes pontos de tempo durante a cultura e para em fases utero pode ser captrado sob microscópio de dissecação. Software de imagem local foi utilizado para capturar as imagens e posteriormente processadas utilizando o software de processamento de imagem.

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Resultados

Desenvolvimento de embriões de ratinho ex utero depende de múltiplos factores, a partir do momento em que o útero é isolado a partir do corpo para o momento em que os embriões são cultivados. Como representado na Figura 1, o processo envolve uma série de passos, incluindo, a separação do útero grávido do corpo (Figura 1A), isolamento de embriões com saco vitelino intacta (Figura 1B), exteriorização dos embriões a partir do saco vitelino ( Figura 1C)

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Discussão

Embriões fase mid-gestação de ratinho foram cultivadas num meio de cultura livre de soro, numa atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C. O desenvolvimento embrionário ex útero foi criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento que o útero é isolado a partir de murganhos sacrificados para a realização da cultura (Figura 1). O fator mais importante que influenciou o desenvolvi...

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Divulgações

Não temos quaisquer interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Julie Gordon e Dr. Nancy Manley para o seu conselho útil com a técnica de cultura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Glaucoma Infantil e Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
KnockOut DMEMInvitrogen10829-018
KnockOut Serum ReplacementInvitrogen10828-028
N-2 SuplementoInvitrogen17502-048Estoque: 100x
Albumina, de Soro BovinoSigmaA9418-50GEstoque: 100%
Antibiótico - Solução AntimicóticaCellgro30-004-ClEstoque: Penicilina (10.000 UI/ml); Estreptomicina (10.000 µ g/ml; Anfotericina (250 µ g/ml) 
DMEM   Cellgro15-013-CV
B.T.C. Engineering Milton Cambridge InglaterraId.No. 840-374
Garrafas de Vidro para Unidade RotativaB.T.C. Engineering
Cortiça de Borracha de SiliconeB.T.C. Engineering
95% O2/5% CO2 CilindroAirGas Inc.
Microscópio de dissecação Apo Stemi SV11Zeiss
Microscópio Stemi SV6Zeiss
CO2 Incubadora com camisa de águaForma Scientific Modelo: 3110
Capuz de CulturaArmários de Segurança Biológica Nuaire Classe II Tipo A2Modelo: Nu-425-600
Banho-mariaFisher ScientificBalança de Pesagem IsoTemp205
Mettler ToledoAG285
, 50 mlde Operação Leve 430291Corning
RobozRS-6702
Tesoura de Operação Afiada-Cega RobozRS-6812
Pinça de Microdissecação, 4 inRobozRS-5211
Pinça de Microdissecação - Hudson (cWALD), 4-3/4 inRobozRS-5237
Pinça de Microdissecação (5/45)RobozRS-5005Modificada - Pontas afiadas foram feitas sem corte
Pinças de Microdissecação (5)RobozRS-5060Modificado - Pontas afiadas foram feitas sem corte
Pinças de Microdissecação (55)RobozRS-5063Modificada - Pontas afiadas foram feitas sem corte
Bandeja de InstrumentosRobozRT-1401S
Tampa da Bandeja de InstrumentosRobozRT-1401L
Placa de Petri-100 mmFisher Scientific087571Z
Placa de Petri-60 mmFisher Scientific0875713A
Placa de Petri-35 mmFisher Scientific0875711YZ
(0.22 µ m Acetato de Celulose)-150 mlde Filtro 431153Corning
(0.22 µ m Acetato de Celulose)-250 mlCorning430756
Sistema de Filtro (0.22 µ m Acetato de celulose) -500 mlCorning430758
pipeta auxiliarDrummond Scientific Co.D57849
Pipeta sorológica - 10 mlVWR89130-898
Pipeta sorológica descartável - 25 mlPipeta de transferência Corning4251
- 7,7 mlThermo Scientific202-20S
Unidade de Incubadora de Precisão Tubo de Centrífuga Tesoura Sistema de Filtro Sistema

Referências

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Reimpressões e permissões

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