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Artigo de método

Ensaios para a identificação de novos antivirais contra a febre catarral ovina vírus

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DOI:

10.3791/50820

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11 de outubro de 2013

 ,  , 
1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Molette Laboratory for Drug Discovery, Department of Chemistry and Biochemistry, Auburn University

Neste artigo

Resumo

Três ensaios, incluindo o efeito citopático (CPE) baseado em ensaio, o ensaio de dose-resposta e (TOA) ensaio de Tempo-de-adição ter sido desenvolvido, optimizado e validado e utilizado para identificar novos medicamentos antivirais contra o vírus da febre catarral (VFC), bem como para determinar o possível mecanismo de ação-de-(MOA) para antivirais recentemente identificados.

Resumo

Para identificar potenciais antivirais contra BTV, temos desenvolvido, otimizado e validado três ensaios aqui apresentados. O ensaio baseado CPE foi o primeiro ensaio foi desenvolvido para avaliar se um composto mostrou qualquer eficácia antiviral e foram utilizados para rastrear o composto biblioteca grande. Enquanto isso, a citotoxicidade dos antivirais podem também ser avaliadas utilizando o ensaio baseado em CPE. O ensaio dose-resposta foi concebido para determinar a gama de eficácia para o antiviral seleccionado, isto é, 50% da concentração inibitória (IC50), ou a concentração eficaz (EC 50), bem como a sua gama de citotoxicidade (CC 50). O ensaio ToA foi utilizado para o estudo inicial Moa para determinar o mecanismo subjacente dos novos antivirais durante BTV ciclo de vida viral ou o possível efeito sobre acolhimento maquinaria celular. Estes ensaios são essenciais para a avaliação da eficácia antiviral no sistema de cultura de células, e têm sido usados ​​para nossas pesquisas recentes levamção para a identificação de uma série de novos medicamentos antivirais contra BTV.

Introdução

BTV é um protótipo de cadeia dupla de RNA vírus do gênero Orbivirus, família Reoviridae. BTV é uma das doenças mais importantes da pecuária nacional, incluindo ovelhas, cabras, gado e outros animais domésticos, com a perda de 3.000 milhões dólares americanos / ano em todo o mundo 1,2. O exótico sorotipo BTV é um importante patógeno animal enumerados nas "USDA alta Consequence Pecuária Patógenos". Recentemente, o re-emergente de BTV causou um grande surto da doença em bovinos e ovinos em vários países em todo o norte da Europa 3,4. Como resultado do seu significado económico e como um sistema modelo, BTV tem sido o objecto de estudos moleculares, genéticos e estruturais extensas, e várias vacinas têm sido desenvolvidos. No entanto, devido à falta de ensaios adequados para a descoberta da droga anti-viral, não existem medicamentos antivirais disponíveis contra BTV.

Em recente pesquisa de alto rendimento campanha (HTS), utilizando o sistema BTV como modelo, nós developed, otimizado e validado um ensaio baseado em CPE para identificar potenciais antivirais de amplo espectro contra arbovírus 5. Ensaio baseado CPE é um ensaio bem conhecido que tem sido utilizado na descoberta de drogas anti-viral contra um número de vírus que induzida rápida e observável CPE / apoptose 5-7. No nosso sistema, infecção pós BTV, CPE é evidente em células de vertebrados, incluindo HeLa, BSR, e HEK 293T 8. CPE induzida por vírus da febre catarral pode ser monitorizada e quantificado usando vários métodos de detecção de viabilidade celular, incluindo o kit de reagente de viabilidade celular CellTiter Glo (kit CTG) 9. Este kit determina o número de células viáveis ​​em cultura com base na quantificação de ATP celular apresentado, o que sinaliza a presença de células vivas, metabolicamente activas. Sob condições otimizadas, o ensaio baseado em CPE aqui apresentado mostrou sua viabilidade com o protocolo de um passo "misturar e medir", e flexibilidade com sinais luminescentes estáveis. Enquanto isso, os compostos tóxicos reducing viabilidade celular irá ser excluída no presente ensaio baseia-CPE. O ensaio baseado CPE mostrou a sua robustez e fiabilidade para a descoberta da droga anti-viral contra o vírus da febre catarral, e tem sido utilizada para rastrear o NIH Molecular Bibliotecas de Moléculas Pequenas Repository (MLSMR), que conduz à identificação de seis novos aglomerado de potencial composto principal antiviral (s ) 5.

Quando um composto antiviral potencial foi identificado usando o ensaio baseado em CPE, que terá de ser submetida ao ensaio de dose-resposta de dez concentração para determinar o intervalo de eficácia antiviral e citotoxicidade 2. A eficácia antiviral, representada como a concentração inibidora 50% (IC50) ou a concentração eficaz 50% (CE 50), é a concentração de uma droga que inibe a CPE induzida por vírus a meio caminho entre a linha de base e no máximo. A citotoxicidade dos antivirais, ou seja, a concentração de 50% de citotoxicidade (CC 50), é a concentraçãode um fármaco induzir 50% de citotoxicidade entre a linha de base e no máximo. O índice selectivo (SI), denotada como 50% de Si (SI 50) é calculado a partir de CC50 / IC 50, que determina a especificidade do anti-viral contra a CPE induzida por vírus. A IC50 (ou EC50), CC 50 e SI 50 valores são medidas importantes para determinar se um composto antiviral é potente e selectivo para o desenvolvimento de drogas.

Quando um antiviral mostrou nenhuma toxicidade manifesta in vitro, no entanto, impedido de vírus induzido CPE e o ciclo de vida viral produtiva, é importante caracterizar a sua MOA 2. Iniciamos tal caracterização através da realização de ensaio ToA para determinar a possível etapa (s) do ciclo de vida viral que é afetada pelo antiviral. Geralmente, composto antiviral foram adicionados às células em diferentes épocas pré-ou pós-infecção de vírus. Se os antivirais foram adicionados às células infectadas pôr ao seu alvo step durante o curso da infecção, ela iria resultar em menor actividade, quando comparada com a que foi adicionada antes do passo. Assim, o estudo ToA é crítico para a determinação da eficácia anti-viral de um composto, e o seu alvo potencial, quer no ciclo de vida viral ou a máquina hospedeira envolvidas no ciclo de vida viral.

Para todos os três ensaios, a viabilidade celular foi determinada utilizando o kit CTG seguindo as instruções do fabricante 5. Este sistema de detecção emite sinais de luminescência adequadas que poderiam ser analisadas por diversos softwares em casa. Cada ensaio foi validado e executada, pelo menos, em triplicado, com oito réplicas. Para todos os dados obtidos, três parâmetros, incluindo o valor médio (AVE), o desvio padrão (STDEV), e variação de co-eficiente (CV) foram analisados ​​para determinar a robustez do ensaio. Uma vez que a robustez do ensaio foi determinado, os dados irão ser ainda analisada e representada usando vários biostatics e graficaferramentas c 2.

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Protocolo

1. Células, vírus e a compostos antivirais

  1. Manter células BSR, de um derivado de rim de hamster bebé (BHK), células 10, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 5% de soro fetal de vitelo (FCS), 100U/ml penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina.
  2. Para todos os três ensaios, células da placa em DMEM com 1% de FCS, 100U/ml penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina, como anteriormente 5 optimizado. Este meio é referido como meio de ensaio para os três ensaios.
  3. Incubar todas as células na incubadora a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade.
  4. Placa-purificar e propagar o tipo 10 BTV (BTV-10), tal como descrito anteriormente 8. Diluir BTV-10 em meio de ensaio para cada ensaios designados.
  5. Dissolve-se todos os compostos de ensaio em DMSO para formar uma unidade com a concentração de 10 mM. Guarde os estoques a -20 ° C.
  6. Dilui-se os compostos a concentrações desejadas, utilizando meio de ensaio para o designadod ensaios 2.

2. Ensaio baseado no CPE utilizando o kit CTG

  1. Células BSR semente em um de 384 poços de microplacas (preto, formato de 16 x 24), através de MicroFlo selecione distribuidor. A densidade de sementeira é de 5.000 células / poço, e o volume de sementeira é de 20 uL para análise de eficácia antiviral.
  2. Incubar as células por 2-3 horas até obter células aderente à placa completamente.
  3. Adicionar composto antiviral com uma concentração final de 10 uM a cada poço. Misturá-lo completamente.
  4. Diluir a BTV título desejado e adicionar 5 mL de BTV com denotado MOI para cada poço. Para o controle bem, adicione 5 mL de meio de ensaio. Incubar as células infectadas durante 72 horas a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade.
  5. Aos 72 hpi, degelo e equilibrar tampão CTG CTG e o substrato liofilizado até à temperatura ambiente antes de usar. Reconstituir a solução homogénea reagente CTG misturando o liofilizado enzima / substrato e o reagente de tampão de acordo com a poinstruções e do fabricante.
  6. Equilibrar as placas de ensaio a temperatura ambiente durante 15 min.
  7. Adicionar um volume igual (25 ul) de reagentes de CTG para cada poço de um distribuidor. Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente na escuridão, medir os sinais de luminescência utilizando um leitor multi-modo, com um tempo de integração de 0,1 seg.

3. Ensaio de dose-resposta

  1. As células BSR semente em uma de 384 poços de microplacas (preto; formato de 16 x 24), através de um dispensador, com uma densidade de sementeira de 5000 células / cavidade em um volume de 20 ul de semeadura para ensaio de eficácia antiviral e 25 uL para o ensaio de citotoxicidade, respectivamente .
  2. Incubar as células durante 2-3 horas a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade até que as células estão bem ligados à placa.
  3. Processo de ensaio de um quarto da área da placa de 384 poços, para cada composto (equivalente a uma placa de 96 poços), como mostrado na Tabela 1. Alocar oito repetições para cada concentraçãonum único ensaio. Atribuir a primeira coluna como o controlo positivo sem adição de composto e vírus, e a última coluna (12 ª) como controlo negativo, adicionando apenas o vírus sem compostos.
  4. Dilui-se os compostos para 50 uM em meio de ensaio e adicionado à coluna 2 nd a 20 ul / poço para o ensaio de eficácia antiviral. Misturar o composto cinco vezes usando uma pipeta de 8 canais semi-automático para uma concentração de 25 uM.
  5. Usando uma pipeta semi-automática de 8 canais, transferir 20 ul de mistura em 2 ª coluna para a coluna seguinte (3 º), misturar bem para formar uma concentração de 12,5 | iM. Repetir este processo por meio da transferência de 20 uL de mistura de 3 a coluna para a coluna seguinte (4 mil) para formar uma outra diluição de duas vezes com uma concentração de 6,25 uM. Repita esta diluição em série de duas vezes até a 11 ª coluna. Aspirar e descartar 20 ul da mistura em 11 ª coluna após a adição e a mistura da amostraound.
  6. Adicionar BTV-10, com base na MOI de 0,01, para cada poço da coluna 2 para a coluna 11 com um volume de 5 ul / poço. Após a adição do vírus, a concentração de composto final em cada coluna devem ser: 20 uM em coluna de 2, 10 ^ M na coluna 3, e continuou com uma diluição de duas vezes para baixo para a coluna 11 com uma concentração final de 0,04 uM.
  7. Adicionar 5 mL de meio para a coluna como uma célula única de controlo (positivo) e 5 ul / poço de VFC à coluna 12, tal como infecção por vírus da febre catarral apenas controle (negativo).
  8. Dilui-se os compostos para uma concentração inicial de 200 pM para o ensaio de citotoxicidade. Da mesma forma, adicionar 25 ul / poço de composto para a coluna 2 e 5x misturado com pipeta semi-automática de 8 canais para uma concentração de 100 uM. Não adicione BTV.
  9. Realizar a diluição série de duas vezes por aspiração 25 mL da coluna 2 para a coluna vizinha 3, e continuou até a última coluna (12 º). Na coluna 12, depois de mistura, aspirado e descartar 25 ul de mixture. A concentração final na coluna 2 deve ser de 100 ^ M e a 12 ª coluna deve estar a 0,2 uM. A coluna 1 é o único controlo celular.
  10. Para ambos os ensaios de citotoxicidade e eficácia antiviral, incubar as placas a 37 ° C, com 5% de CO 2 e 80-95% de humidade durante 72 horas pós-tratamento. Medir a viabilidade celular utilizando o kit CTG como descrito acima (protocolo passos 2,5-2,7).

4. Time-of-Adição (TOA) Assay

  1. Células BSR Semente da coluna 1-24 em 384 poços de microplacas (preto, formato de 16 x 24), através de um distribuidor em 5.000 células / poço e que o volume de semeadura é de 15 mL / poço.
  2. Para cada composto, utilizam todos os vinte e quatro colunas com oito réplicas para cada ponto de tempo no meio da placa de 384 poços (Tabela 2). Atribuir coluna 1 como células só controle adicionando 10 ul / poço de meio de ensaio. Mark coluna 24, tal como infecção por vírus da febre catarral apenas controle (controle negativo) pela adição de 5 ul / poço de ensaio meio de umd 5 ul / poço de vírus a uma MOI de 0,01 e um volume final de 25 ul / poço.
  3. Selecione as colunas de números pares da coluna 2-22 como antiviral coluna avaliação da eficácia em diferentes horas após a infecção (hpi). Nessas colunas, infectar as células com 5 mL / poço BTV no MOI de 0,01. No hpi diferente, também adicionar 5 uL / ​​poço composto diluído a cada poço para formar um volume final de 25 ul / poço. Para o denotado -2 e -1 hpi adicionar composto de células BSR antes da infecção BTV. Para 0 hpi, adicione o composto e BTV para a cultura ao mesmo tempo.
  4. Em paralelo, designam as colunas com números ímpares de coluna de 3-23 como composto apenas controla, de que o composto foi adicionado em diferentes pontos de tempo como designado (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 hpi). Nestas colunas, adicionar 5 mL de meio / poço de ensaio e 5 pL / cavidade diluída composto para proporcionar um volume final de 25 ul / poço.
  5. Após o tratamento, as células incubar a 37 ° C, 5% de CO 2, com 80-95% de humidade.
  6. Determinar a viabilidade celular às 72 hpi usando o kit de CellTiter-Glo, tal como descrito anteriormente (protocolo de passos de 2,5-2,7).

5. Análise de Dados

  1. Processar todos os dados utilizando software apropriado primeira in-house com base nos sinais luminescentes obtidos através do leitor multi-modo. Determinar o valor médio (média), o desvio padrão (STDEV) de cada tratamento, bem como as variações de coeficientes (CV), que requer um valor não superior a 10%.
  2. Transfira os dados processados ​​a partir do software acima para uma ferramenta de software bioestático e gráfico. Levar a cabo a análise de regressão não-linear para determinar os valores de EC 50 e CC 50.

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Resultados

1. Eficácia antiviral de composto

O ensaio de ECP de base celular foi desenvolvido, optimizado e validado in vitro utilizando o kit à base de CTG luminescente para identificar novos medicamentos antivirais contra BTV como descrito anteriormente de 2,5. O ensaio de resposta de dez dose foi empregada para reflectir a eficácia antiviral e citotoxicidade de um composto de chumbo identificados medindo o número de células metabolicamente viáveis ​​em cultura com base na quantifica...

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Discussão

Para a identificação inicial de visitas antivirais, um dos passos chave para a descoberta da droga anti-viral e de desenvolvimento consiste em desenvolver ensaios robustos, que inclui a selecção de um marcador quantificável, o desenvolvimento de um protocolo simples, obter sinais suficientes e menos do que 10% CV. A maioria das telas bioquímicos ou à base de células são projetados para fornecer um ponto de partida química baseada na mais robusta, ensaio simples e barato, devido à reprodutibilidade requerida no processo ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este projecto foi apoiado pela concessão 1R03MH08127-01 e 7R03MH08127-02 do NIH para Q. Li, e pelos fundos IMPACTO do Departamento de Medicina da UAB para Q. Li. O apoio do Fundo Molette e da Universidade de Auburn é apreciado. Agradecemos também as assistências técnicas de Ms. Pulin Che eo Sr. Volodymyr Musiienko durante o curso do trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio DMEMGibco1134218Para cultura
de células FBSGibco16000044Para cultura de células
0,05% Tripsina-EDTAGibco1000185Para cultura de células
DPBSGbico1049769Para cultura de células
Kit CellTiter-Glo (CTG)PromegaTB288Para medição de viabilidade celular
70% etanolFisherS25309BDiluído a partir de 95%
de compostos huashil antiviraisNIH MLSMR e síntese
BTV-10ATCCVR-187
BSR célulaDesenvolvido internamente
Leitor de microplacas multimodo Synergy-IIBioTekPara leitura de sinal luminescente
MicroFlo selecione dispensadorBioTekAdição de células, vírus e reagentes
Microplaca de fundo plano de 384 poçosCORNING28908031Para cultura de células
Software Gen. 5BioTekPara análise de saídas de leitura do leitor de microplacas multimodo Synergy-II
GraphPad Prism 5GraphPadVersão 5Para análise biostática e plotagem
de novo

Referências

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