O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

Resumo

Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais.

Resumo

Cultura explante permite a manipulação de órgãos em desenvolvimento em pontos de tempo específicos e é, portanto, um método importante para a biologia do desenvolvimento. Para muitos órgãos é de difícil acesso tecido em desenvolvimento para permitir o monitoramento durante ex vivo da cultura. O método de cultura fatia permite o acesso ao tecido para que os movimentos morfogenéticos podem ser seguidas e populações de células específicas podem ser direcionados para a manipulação ou o rastreamento de linhagem.

Neste artigo descrevemos um método de cultura fatia que tem sido muito bem sucedido para a cultura de germes dentários em uma variedade de espécies. O método proporciona um acesso excelente para os germes de dentes, que se desenvolvem a uma taxa semelhante à observada in vivo, rodeado por outros tecidos maxila. Isto permite que as interacções de tecido entre o dente e tecido circundante a ser monitorizado. Embora este documento concentra-se germes de dente, o mesmo protocolo pode ser aplicado para seguir o desenvolvimento de uma sériede outros órgãos, tais como as glândulas salivares, cartilagem de Meckel, glândulas nasais, língua e orelha.

Introdução

Para um número de experiências é importante ser capaz de cultura de tecidos ex vivo para seguir o desenvolvimento. Cultura de desenvolvimento do tecido proporciona acesso em períodos definidos de desenvolvimento e permite a manipulação de genes através da adição de factores para o meio de cultura, ou em pérolas carregadas, e pela utilização de transfecção e electroporação ^1. Para muitos ensaios, é importante ser capaz de visualizar o tecido à medida que cresce, por exemplo, para seguir o destino de células de linhagem rotulado como o tecido é submetido a morfogénese. Isto pode ser particularmente problemática nos tecidos que se desenvolvem de profundidade dentro do embrião, que não são óbvias, quando um bloco de tecido a partir do embrião é cultivado. Os dentes são bons exemplos disso, como elas se desenvolvem dentro do processo nasal mandíbula, maxilar e frontal. Quando toda a mandíbula é cultivaram as estruturas superficiais do dente podem ser vistos, mas as alterações na morfologia só pode ser analisado depois de seccionamento do tecido fixado ^{2. Nós adaptamos uma fatia técnica cultura viva que nos permite acompanhar o desenvolvimento do germe do dente e dar acesso a diferentes partes do dente durante o desenvolvimento. As culturas técnica as fatias germinais dente na interface gás-líquido, usando um método modificado Trowell 3. Estas culturas fatia têm sido muito úteis em seguir diretamente morfogênese do dente, e permitindo o rastreamento de linhagem de componentes distintos, como o nó do esmalte e da papila dental e do folículo 1,4-7. A técnica não se limita aos embriões de ratinho e com sucesso tem sido utilizado para cultura de fatias de porco vivos e cobra 8,9 tecido dental. Para além da vantagem de ser capaz de visualizar o desenvolvimento dos dentes, o método fatia também tem a vantagem de que as fatias finas de tecido ter um maior acesso para os nutrientes a partir do meio e de ar a partir do incubador. Isso resulta em melhor crescimento dos germes dentários, que correspondem desenvolvimento in vivo, e mostram invasião de células endoteliais na papila 7. Em contraste, os germes de dentes em culturas de mandíbula inteiros desenvolver mais lento do que os in vivo, e o centro da cultura é frequentemente necrosado em culturas de longo prazo. Na cultura fatia, o dente desenvolve dentro de uma fatia de mandíbula, e a sua interacção com o desenvolvimento de osso circundante e outros tecidos podem ser monitorizados. Em nosso método, o tecido é cortado logo após dissecção sem a necessidade de incorporar em um meio de suporte 10,11 e não há necessidade de qualquer sistema para prender o tecido para o bloco de desbastamento. O método é, por conseguinte, não invasiva e rápida, permitindo que muitas mandíbulas para ser seccionado em uma sessão.}

Protocolo

1. Estabelecer

1. Afiar instrumentos de dissecção (utilizando uma pedra de afiar lubrificado com óleo mineral) e esterilizar antes da sua utilização para a cultura de órgãos, utilizando um pulverizador de etanol a 70% e a esterilização por calor seco. Afie as agulhas de dissecação através da eletrólise em hidróxido de sódio 2 M usando uma alimentação de 12 V.
2. Preparar o meio de cultura utilizado para a dissecção e a cultura de órgãos embrionários, que consiste de Meio de Eagle Modificado F12 da Dulbecco avançada (DMEM F12) suplementado com 1% GlutaMAX e 1% de penicilina-estreptomicina.

2. Embrião Dissection

1. Cull uma fêmea grávida acoplado cronometrado usando uma programação um método aprovado pelo Ministério do Interior ou outro órgão de governo. Dissecar longe a pele ao redor do abdômen inferior, e abriu o abdome com uma tesoura. Localize os dois cornos uterinos, que ligam juntos na linha média inferior.
2. Dissecar o útero e coloque em um tubo cheio de médio no gelo. When em gelo, o tecido pode ser deixada durante várias horas.
3. Remover o útero e lugar em uma placa de Petri em meio sob o microscópio. Sempre que possível, dissecações embriões devem ser realizados numa hote de fluxo laminar para minimizar a contaminação.
4. Dissecar os embriões do útero e libertá-los de seus tecidos extra-embrionário.
5. Decapitar os embriões utilizando uma agulha de tungstênio e transferir as cabeças em um novo prato de meio.
6. Isolar as mandíbulas de cabeças, colocando uma agulha para dentro da cavidade oral e cortar para a parte de trás da cabeça (Figuras 1A e 1B). Isolados mandíbulas podem ser temporariamente armazenados em meio no gelo enquanto espera para cortar.
7. Para fatias inteiras mandíbula encena E11.5-E15.5 são ideais para a cultura do germe do dente. Após E15.5 o osso da mandíbula em desenvolvimento é muito difícil para cortar. Fatias de dentes ainda podem ser feitas, mas o osso (osso alveolar dentário e formação) devem ser previamente removidos pordissecção antes de cortar ^9. Remover osso cuidadosamente o uso de agulhas de tungstênio e fórceps.

3. Embrião Fatias

1. Preparar as fatias de tecido de mandíbula usando um cortador de tecido tabela padrão (Figura 1C). Use uma lâmina nova após cerca de 200 mandíbulas, e certifique-se que se encontra alinhado com o disco de montagem quando cai.
2. Limpar o disco de montagem e lâmina com etanol 70% antes da utilização. Cuidados devem ser tomados ao utilizar a máquina, como a lâmina é muito afiada.
3. Definir o helicóptero, a uma distância de corte de entre 200-400 mm de acordo com a idade do espécime, e dependendo se todo o germe do dente é necessária. Defina a força da lâmina no máximo.
4. Transferir uma mandíbula para o disco de montagem de plástico com uma pipeta ou uma pinça. Organizar a mandíbula sobre a produção do disco se de que a orientação ainda é clara. A língua em desenvolvimento pode ser usada como um ponto de referência útil para determinar a orientação. Para molares uso afRontal / orientação transversal (ver plano de corte na Figura 1B), enquanto que para os incisivos usar um corte sagital através da mandíbula para refletir a diferente orientação desses dentes à medida que crescem (ver plano de corte na Figura 2A).
5. Remover o excesso de meio de todo o tecido, utilizando papel de filtro, a fim de secar ligeiramente a mandíbula no disco de montagem.
6. Imediatamente após a secagem, coloque o disco na mesa de aço inoxidável circular de helicóptero. Ligue a máquina e começar a pressionar. A mesa desloca automaticamente a partir da esquerda para a direita e, ao mesmo tempo, o braço de desbastamento levando a lâmina é levantado e deixado cair em até 200 batimentos / min.
7. Desligue a máquina uma vez que o tecido foi completamente cortado. Certifique-se o braço da pá está na posição levantada e remover o disco. Não coloque os dedos debaixo do braço lâmina ou deixar a máquina sem vigilância quando cortar.
8. Pegue o disco de montagem e adicionar imediatamente médio to as fatias no disco, a fim de evitar o ressecamento excessivo. Cuidadosamente desalojar o tecido cortado a partir da parte inferior do disco, utilizando uma agulha de tungsténio e, em seguida, pipeta numa pequena placa de Petri com meio (Figura 2A).
9. Separe as fatias usando uma agulha e, em seguida, selecione as fatias de tecido contendo o tecido de interesse sob um microscópio estereoscópico (Figuras 1D, 1E, e 2B). Coloque fatias selecionadas em placas de cultura com meio fresco.

4. Fatia Cultura

1. Preparar pratos de órgãos centrais poços de cultura, prontos para a cultura através da adição de cerca de 2 ml de água esterilizada para o poço externo para impedir a desidratação, e pelo posicionamento de uma grade de metal através do centro do prato (Figuras 3A e 3B).
2. Prepare grades metálicas cortando tiras aproximadamente 4 cm x 1,5 cm, a partir de folhas de malha de aço inoxidável. Use um furador para fazer um buraco no centro e dobreos lados para criar um final escalonada. A grelha deve ficar plano através do poço central, encontra-se em paralelo ao fundo do prato (Figuras 3A e 3B). Autoclave as grades para esterilizar antes da utilização.
3. Cortar um pedaço de tereftalato de polietileno transparente (PET) de membrana (dimensão de poro 0,4 um) suficientemente grande para cobrir o furo na grade. Coloque a membrana corte no prato com a fatia selecionada.
4. Coloque a fatia sobre a membrana e, em seguida, levante cuidadosamente a membrana fora do meio, com fatia achatada no centro.
5. Colocar o filtro da grelha sobre o orifício circular no centro, e adicionar cerca de 1 ml de meio de cultura para o poço, até ao nível da membrana.
6. Para manipulações adicionar proteínas ou inibidores de moléculas pequenas para o meio (por exemplo ^8).
7. Fotografar a fatia para um registro de morfologia no dia 0 de cultura.
8. Colocar as cápsulas numa atmosfera húmida de 5% de CO _{2 a 37 ° C em uma incubadora.}
9. Fotografar as culturas em intervalos regulares para, em média, 7 dias. Altere o meio de cultura a cada 48-72 horas. Para a fotografia visualizar as fatias com uma fonte de luz por baixo (Figuras 2C-E).

5. Lineage Tracing

Se o rastreamento de linhagem é necessária, corantes lipofílicos, como DII ou DiO pode ser injetado no germe do dente antes do passo 4, a cultura fatia.

1. Puxe agulhas capilares de vidro usando um extrator de agulha.
2. Quebrar a ponta da agulha com a pinça e colocar ponta para baixo para dentro da solução corante. Deixe por alguns minutos, enquanto o corante enche a ponta por ação capilar.
3. Coloque a agulha colocada em um suporte e anexar via tubulação para um injetor ou a boca do aspirador.
4. Posicionar a ponta da agulha no meio de cultura que toca a área da fatia devido a ser rotulada. Aplicar pressão de ar para deslocar uma quantidade pequena de corante para fora da agulhad para o tecido.
5. Remova a agulha e verificar se a rotulagem sob fluorescência.
6. Fatias marcadas com sucesso pode ser transferido para filtros e cultivados como descrito no passo 4.

Resultados

De modo a seguir o movimento do primeiro folículo molar, 250 mM fatias frontais foram tomadas através de uma mandíbula, utilizando o método descrito acima. O folículo é a camada de mesênquima que rodeia o esmalte epitélio exterior (OEE) do dente em desenvolvimento, e tem sido mostrado previamente para participar na formação de tecido do periodonto ^6. Mandíbulas foram dissecadas na E14.5, o estágio tampa do desenvolvimento dentário. No corte do contorno do epitélio dental foi claro, e o mesênquima dentário de ...

Discussão

Este método de cultura de dentes tem a vantagem de que o acesso ao germe do dente é excelente, permitindo linhagem precisas rastreio e colocação de grânulos no interior do epitélio ou mesênquima. Regiões definidas do germe do dente em desenvolvimento pode, por conseguinte, ser dirigida especificamente. Durante a cultura a morfologia mudança do germe do dente podem ser seguidos, e o efeito de manipulações rapidamente avaliada.

O método, no entanto, é apenas apropriado para germes dentários jo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol	VWR	101077Y	O etanol 100% foi diluído em H2O destilado a 70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
Penicilina-estreptomicina	Sigma	P0781
DiI (sondas moleculares)	Vybrant	V-22885	Solução
	Invitrogen		Cell tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( Sondas moleculares)	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	Esterilização por calor seco
Helicóptero de tecidos McIlwain	Ted Pella, Inc.	10180	de mesa padrão
(Prato de cultura de órgãos Center-Well)	Falcon	353037
Membranes (Inserções de cultura de células, 0.4 μ m tamanho dos poros)	BD Falcon	353090	PET membrana gravada em esteira, formato de 6 poços
Grades metálicas (Aço Inoxidável - AISI 304 - Malha)	Goodfellow	FE228710	(Fe / Cr18 / Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2< / sub> Incubadora	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	Picospritzer III
de canal únicoCapilar de vidro com filamento 1 mm	WPI	TW100F-4
Fio de tungstênio 0,1 mm	Goodfellow	W005138
Fio de tungstênio 0,38 mm	Goodfellow	W005155
Tubos de aspiração	Sigma	A5177	Usado para traçadores de linhagem de aspiração bucal