Aqui detalhamos um método para germes dentários cultura em fatias mandíbula usando um cortador de tecidos. Este método permite acesso exclusivo ao dente durante o desenvolvimento, proporcionando uma excelente oportunidade para a manipulação e linhagem de rastreamento, não está disponível através de métodos de cultura mais tradicionais.
Cultura explante permite a manipulação de órgãos em desenvolvimento em pontos de tempo específicos e é, portanto, um método importante para a biologia do desenvolvimento. Para muitos órgãos é de difícil acesso tecido em desenvolvimento para permitir o monitoramento durante ex vivo da cultura. O método de cultura fatia permite o acesso ao tecido para que os movimentos morfogenéticos podem ser seguidas e populações de células específicas podem ser direcionados para a manipulação ou o rastreamento de linhagem.
Neste artigo descrevemos um método de cultura fatia que tem sido muito bem sucedido para a cultura de germes dentários em uma variedade de espécies. O método proporciona um acesso excelente para os germes de dentes, que se desenvolvem a uma taxa semelhante à observada in vivo, rodeado por outros tecidos maxila. Isto permite que as interacções de tecido entre o dente e tecido circundante a ser monitorizado. Embora este documento concentra-se germes de dente, o mesmo protocolo pode ser aplicado para seguir o desenvolvimento de uma sériede outros órgãos, tais como as glândulas salivares, cartilagem de Meckel, glândulas nasais, língua e orelha.
Para um número de experiências é importante ser capaz de cultura de tecidos ex vivo para seguir o desenvolvimento. Cultura de desenvolvimento do tecido proporciona acesso em períodos definidos de desenvolvimento e permite a manipulação de genes através da adição de factores para o meio de cultura, ou em pérolas carregadas, e pela utilização de transfecção e electroporação 1. Para muitos ensaios, é importante ser capaz de visualizar o tecido à medida que cresce, por exemplo, para seguir o destino de células de linhagem rotulado como o tecido é submetido a morfogénese. Isto pode ser particularmente problemática nos tecidos que se desenvolvem de profundidade dentro do embrião, que não são óbvias, quando um bloco de tecido a partir do embrião é cultivado. Os dentes são bons exemplos disso, como elas se desenvolvem dentro do processo nasal mandíbula, maxilar e frontal. Quando toda a mandíbula é cultivaram as estruturas superficiais do dente podem ser vistos, mas as alterações na morfologia só pode ser analisado depois de seccionamento do tecido fixado <sup> 2. Nós adaptamos uma fatia técnica cultura viva que nos permite acompanhar o desenvolvimento do germe do dente e dar acesso a diferentes partes do dente durante o desenvolvimento. As culturas técnica as fatias germinais dente na interface gás-líquido, usando um método modificado Trowell 3. Estas culturas fatia têm sido muito úteis em seguir diretamente morfogênese do dente, e permitindo o rastreamento de linhagem de componentes distintos, como o nó do esmalte e da papila dental e do folículo 1,4-7. A técnica não se limita aos embriões de ratinho e com sucesso tem sido utilizado para cultura de fatias de porco vivos e cobra 8,9 tecido dental. Para além da vantagem de ser capaz de visualizar o desenvolvimento dos dentes, o método fatia também tem a vantagem de que as fatias finas de tecido ter um maior acesso para os nutrientes a partir do meio e de ar a partir do incubador. Isso resulta em melhor crescimento dos germes dentários, que correspondem desenvolvimento in vivo, e mostram invasião de células endoteliais na papila 7. Em contraste, os germes de dentes em culturas de mandíbula inteiros desenvolver mais lento do que os in vivo, e o centro da cultura é frequentemente necrosado em culturas de longo prazo. Na cultura fatia, o dente desenvolve dentro de uma fatia de mandíbula, e a sua interacção com o desenvolvimento de osso circundante e outros tecidos podem ser monitorizados. Em nosso método, o tecido é cortado logo após dissecção sem a necessidade de incorporar em um meio de suporte 10,11 e não há necessidade de qualquer sistema para prender o tecido para o bloco de desbastamento. O método é, por conseguinte, não invasiva e rápida, permitindo que muitas mandíbulas para ser seccionado em uma sessão.
1. Estabelecer
2. Embrião Dissection
3. Embrião Fatias
4. Fatia Cultura
5. Lineage Tracing
Se o rastreamento de linhagem é necessária, corantes lipofílicos, como DII ou DiO pode ser injetado no germe do dente antes do passo 4, a cultura fatia.
Este método de cultura de dentes tem a vantagem de que o acesso ao germe do dente é excelente, permitindo linhagem precisas rastreio e colocação de grânulos no interior do epitélio ou mesênquima. Regiões definidas do germe do dente em desenvolvimento pode, por conseguinte, ser dirigida especificamente. Durante a cultura a morfologia mudança do germe do dente podem ser seguidos, e o efeito de manipulações rapidamente avaliada.
O método, no entanto, é apenas apropriado para germes dentários jovens antes da formação substancial de tecidos duros, como o esmalte e dentina, uma vez que estas não podem ser cortados com precisão. Para mandíbulas após E15.5 é necessário remover o osso antes de cortar. Isto tem a desvantagem de potencialmente prejudicar o germe do dente, que está intimamente associada com o osso do E16.5. Temos cortado com sucesso germes dentários dissecados até dia pós-natal 4, após o qual o dente torna-se muito difícil para o helicóptero para cortar devido à deposição de esmalte. A fatia método funciona bem em germes dentários de E13.5, ou seja, a fase de botão 1,6. Antes deste ponto de tempo, quando o dente está em fase de espessamento epitelial, os germes de dentes se desenvolvem, mas a taxa de sucesso é reduzida e a morfologia pode ser afectada a longo prazo.
Uma grande desvantagem com o método é que o corte ocorre ao acaso através do dente. Em algumas fatias de um germe de dente inteiro será encontrada dentro de uma fatia, enquanto em outros o helicóptero pode cortar o germe do dente no meio. Isto significa que pode ser difícil obter um grande número de cortes idênticos. Para combater este problema, é possível dividir uma fatia ao meio e usar os lados direito e esquerdo como experimental e de controlo. Para isso, no entanto, a mandíbula têm de ser cuidadosamente colocado sobre o disco de corte para assegurar a fatia é cortada de forma simétrica. Para algumas experiências, é uma vantagem ter fatias que disseca o dente, de modo que as estruturas internas, tais como o esmaltenó, pode ser acessado por linhagem rotulagem 4. O germe do dente parece muito robusto e esses germes meio dente são capazes de desenvolver bem em cultura, como anteriormente mostrado na germes dentários molares pela metade 12,13.
Como uma alternativa para cortar cultura, os germes de dentes podem ser dissecados para fora da mandíbula e cultivadas em isolamento 14. Isso elimina o problema da má nutrição e oxigenação associada à cultura de grandes blocos de tecido e leva ao bom desenvolvimento dos dentes, mas como conseqüência o dente se desenvolve sem interação com o tecido circundante. Quando grandes quantidades de mesênquima circundantes são removidos o número de germes dentários que se formam podem ser alteradas, destacando a importância do mesênquima circundante para o desenvolvimento normal do dente 15. Fatia de cultura é, por conseguinte, um bom método para estudar as interacções de tecidos, por exemplo, como o osso e dente de interagir na formação do osso alveolar, ou como o salivariar glândulas interagir com a lingueta e do epitélio bucal, algo que é perdida quando esses tecidos são cultivadas isoladamente.
Este documento realça a utilização deste método para a cultura das bactérias dos dentes, mas o mesmo método também é excelente para a cultura em desenvolvimento a glândula submandibular e sublingual e acompanhando o desenvolvimento de estrutura, tais como a cartilagem de Meckel (Figura 2).
The authors have nothing to disclose.
Ethanol | VWR | 101077Y | 100% ethanol was diluted in distilled H<sub>2</sub>O to 70%. |
DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
Penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
DiI (Molecular probes) | Vybrant | V-22885 | Cell-labeling solution |
Invitrogen | Cell tracker CM-DiI, C-7000 | ||
DiO (Molecular probes) | Vybrant | V22886 | |
Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | Dry-heat sterilization |
McIlwain tissue chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | Standard table |
Organ culture dish (Center-Well Organ Culture Dish) | Falcon | 353037 | |
Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 μm pore size) | BD Falcon | 353090 | PET track-etched membrane, 6-well format |
Metal grids (Stainless Steel – AISI 304 – Mesh) | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
AutoFlow Direct Heat CO<sub>2</sub> Incubator | Nuaire | NU-5500 | |
Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | Single channel picospritzer III |
Glass capillary with filament 1 mm | WPI | TW100F-4 | |
Tungsten wire 0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
Tungsten wire 0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
Aspirator tubes | Sigma | A5177 | Used for mouth aspiration lineage tracers |