O método de cultura fatia para acompanhar o desenvolvimento de germes dentários Em Explant Cultura

O objetivo geral do experimento a seguir é acompanhar o desenvolvimento do dente ao longo de vários dias. Cultura de explicação in vitro, isso é conseguido dissecando a mandíbula em desenvolvimento de camundongos fetais em fatias vivas para expor os germes dentários em desenvolvimento como uma segunda etapa. As fatias são selecionadas, colocadas em filtros sobre um meio de cultura e incubadas para permitir o desenvolvimento.

Em seguida, as fatias são marcadas com um traçador de linhagem para rastrear o movimento celular durante o período de cultura, são obtidos resultados que mostram a natureza dinâmica dos tecidos dentários à medida que se desenvolvem durante a cultura explan. A principal vantagem dessa técnica sobre a cultura de explante convencional é que órgãos em desenvolvimento interno, como gemas dentárias, podem ser observados ao longo de seu desenvolvimento no contexto do tecido circundante. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de corte e seleção podem ser difíceis se a configuração da máquina ou a orientação do tecido for imprecisa.

Primeiro, prepare o meio de dissecção e cultura para os órgãos embrionários adicionando 1% de glutamato e 1% de estreptomicina de penicilina a 500 mililitros de ECCOs avançados modificados com meio de águia F 12. Em seguida, conforme descrito no artigo em vídeo de Takahashi Sumi, dissecar embriões de camundongos entre os estágios E 11.5 e E 15.5 de desenvolvimento e colocá-los em uma placa de Petri contendo meio fresco. Em seguida, decapite os embriões usando uma agulha de tungstênio estéril recém-afiada e transfira as cabeças para um prato fresco de meio pré-resfriado no gelo.

Em seguida, isole as mandíbulas das cabeças colocando uma agulha na cavidade oral e cortando temporariamente a parte de trás da cabeça. Armazene as mandíbulas isoladas em meio pré-resfriado no gelo antes de serem seccionadas. Antes de cortar o tecido da mandíbula, limpe o disco de montagem e a lâmina do picador de tecidos com etanol a 70% e certifique-se de que a lâmina esteja nivelada com o disco de montagem.

Quando cair, a lâmina precisará ser substituída após cortar aproximadamente 200 mandíbulas, definir a distância de corte entre 200 e 400 micrômetros de acordo com a idade da amostra e, dependendo se todo o germe do dente é necessário para um embrião E 14,5 onde o isolamento do germe do dente é necessário, uma distância de corte de 250 micrômetros é usada. Em seguida, transfira uma mandíbula para o disco de montagem de plástico e organize-a de forma que a língua em desenvolvimento fique em uma orientação transversal frontal. Ao dissecar molares para isolar incisivos, faça cortes sagitais através da mandíbula.

Uma vez orientado corretamente, remova o excesso de meio ao redor do tecido. Usando papel de filtro, isso acionará levemente uma mandíbula, fixando-a no disco de montagem. Imediatamente após a secagem com o papel de filtro, coloque o disco na mesa circular de aço inoxidável do picador.

Em seguida, defina a força da lâmina no máximo, ligue a máquina e pressione start. A mesa se desloca automaticamente da esquerda para a direita enquanto, ao mesmo tempo, o braço de corte que carrega a lâmina é levantado e solto em até 200 golpes por minuto. Assim que o lenço estiver completamente fatiado, desligue a máquina.

Certifique-se de que o braço da lâmina esteja na posição levantada e, em seguida, remova o disco. Certifique-se de não colocar os dedos sob o braço da lâmina ou deixar a máquina sem vigilância. Ao cortar o tecido, pegue o disco de montagem e adicione imediatamente meio às fatias do disco para evitar o ressecamento excessivo.

Em seguida, desaloje cuidadosamente o tecido da parte inferior do disco usando uma agulha ou pipeta de tungstênio e pipete-os em uma pequena placa de Petri de médio. Em seguida, separe as fatias individuais usando uma agulha e, em seguida, selecione as fatias de tecido contendo a área de interesse em um microscópio estéreo. Coloque as fatias selecionadas em pratos de cultura com grelhas de metal frescas e médias para o sistema de cultura cortando tiras, medindo quatro centímetros por 1,5 centímetros de folhas de tecido liso de aço inoxidável.

Em seguida, faça um furo no centro usando um furador estacionário padrão e dobre os lados para que a grade se encaixe no poço central e fique paralela ao fundo do prato. Assim que as grades estiverem moldadas corretamente, esterilize-as em uma autoclave antes de usar. Em seguida, prepare as placas de cultura de órgãos do poço central para cultura adicionando dois mililitros de água de autoclave ao poço externo para evitar a desidratação.

Em seguida, posicione uma grade de metal estéril no centro do prato. Corte um pedaço de membrana transparente de tereftalato de polietileno com um tamanho de poro de 0,4 micrômetros para que seja grande o suficiente para cobrir o orifício na grade. Em seguida, coloque a membrana cortada no prato com uma fatia de mandíbula selecionada, se o traçado da linhagem for desejado.

Primeiro prepare uma agulha capilar de vidro desenhando o vidro com um extrator de agulha. Em seguida, quebre a ponta da agulha e coloque-a com a ponta para baixo em uma solução de corante lipofílico, como dai eye ou dai o, e retire um pouco da solução de corante por ação capilar. Após alguns minutos, coloque a agulha cheia em um suporte e conecte-a a um aspirador bucal.

Posicione a ponta da agulha no meio de cultura de forma que toque a área a ser rotulada, como o folículo dentário mostrado aqui. Em seguida, desloque uma pequena quantidade de corante para o tecido. Em seguida, transfira a fatia para um microscópio fluorescente stage e verifique se a fatia foi rotulada com sucesso.

Uma vez rotulado com sucesso, levante cuidadosamente a fatia no topo da membrana e, em seguida, transfira a membrana para fora do meio com a fatia achatada no centro. Em seguida, coloque o filtro sobre o orifício circular no centro da grade a aproximadamente um mililitro de meio de cultura até o poço até que o nível do meio esteja no nível da membrana. Neste ponto, adicione quaisquer proteínas ou inibidores de moléculas pequenas no meio.

Além disso, imagine a fatia para um registro da morfologia no dia zero usando um microscópio de dissecação para obter a melhor fotografia, visualize as fatias com uma fonte de luz por baixo. Mantenha os pratos em uma atmosfera umidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e troque a mídia a cada dois ou três dias em intervalos regulares. Continue a visualizar as culturas para acompanhar o progresso.

Aqui é mostrada uma série de imagens que documentam o desenvolvimento do folículo dentário do primeiro molar, que é marcado com corante fluorescente ocular. A fatia é uma fatia frontal de 250 mícrons de espessura dissecada da mandíbula de um camundongo em E 14,5. O dente que é delineado com pontos pretos começa no estágio de tampa no dia zero.

No quarto dia, o germe dentário atingiu o estágio de sino e as células do folículo dentário são vistas se espalhando em um arco ao redor do esmalte externo em desenvolvimento. Epitélio Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em três horas, desde o embrião até a cultura final. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como visualizar com sucesso o desenvolvimento de órgãos em cultura.